一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法。

背景技术

DNA分子标记技术已广泛用于植物种质资源研究。通过分子标记辅助育种可以大大缩短育种周期，不受发育时期、组织器官和环境条件等因素影响。高效、快速制备高质量的基因组DNA，并保证DNA的纯度和完整性，是进行分子标记和其他分子生物学试验的基础。

从植物组织中提取基因组DNA的常用方法有CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法和SDS(十二烷基磺酸钠)法，以及基于这两种方法的改良法。这些方法适用于香蕉幼嫩组织的基因组DNA提取，提取的DNA纯度能够满足一般分子生物学的需要，但对于富含多糖、多酚的香蕉果实而言就需要通过分步离心，或加入醋酸钾和氯仿/异戊醇多次抽提，不仅提取效果不能保证，而且操作步骤复杂，耗时长，易交叉污染。现有的实验操作中采用一种组织对应一种方法的方式提取植物不同组织的基因组DNA，由于每种方法要配置的药品不同、操作步骤各异，因此会增多实验步骤，加大工作量。

鉴于上述情况，期望获得一种从香蕉不同组织器官中均能快速提取高质量的基因组DNA的方法，即，仅应用一种方法就可提取香蕉不同组织器官中的基因组DNA。

发明内容

本发明旨在解决上述问题。

本发明的目的之一在于提供一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法。

本发明的适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA方法包括如下步骤：步骤一：取香蕉组织样品，加入液氮后研磨成粉末，转至离心管中；步骤二：在所述步骤一的所述香蕉组织样品中加入提取缓冲液、10％SDS与氯化苄，充分混匀后水浴；步骤三：在经所述步骤二得到的混合液中加入乙酸钠冰浴，然后离心分离；步骤四：取经所述步骤三所得的上清至一干净离心管，加入预冷的异丙醇，混匀后离心分离，弃上清液；步骤五：取经所述步骤四得到的沉淀用75％的乙醇洗涤，室温挥发乙醇，然后加入TE buffer或无菌水，再用适量的RNase A消化，取出后于-20℃保存备用。

进一步的，所述步骤一中所述香蕉组织样品的用量为0.5g；所述步骤二中所述提取缓冲液的用量为1mL、所述10％SDS的用量为150μL、所述氯化苄的用量为200μL～800μL；所述步骤三中加入所述乙酸钠的含量为450μL；所述步骤四中的所述异丙醇的用量为0.1mL。

进一步的，所述氯化苄为600μL。

进一步的，所述提取缓冲液包括pH 9.0的100mmol·L^-1Tris-HCl、pH 8.0的40mmol·L ^-1EDTA。

进一步的，所述步骤二中水浴温度为65℃，水浴时间为45min。

进一步的，所述步骤三中所述乙酸钠冰浴所述混合液的时间为15min，且设定的离心参数为13000×g离心8min。

进一步的，所述步骤四中设定的离心参数为13500×g离心10min。

进一步的，所述步骤五中所述75％的乙醇洗涤所述沉淀的次数为两次。

本发明的有益效果在于：本发明的适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA方法不受取材限制，从香蕉不同组织器官中均能快速提取高质量的基因组DNA，而且从单位香蕉组织样品中提取的基因组DNA的纯度高并且收率高。

附图说明

图1-1示出根据现有技术的CTAB常规法和CTAB改良法1提取香蕉各组织基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图1-2示出根据现有技术的CTAB改良法3和CTAB改良法2提取香蕉各组织基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图1-3示出根据现有技术的SDS法和SDS结合蛋白酶K法提取香蕉各组织基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图1-4示出根据现有技术的改良尿素法和根据本发明的氯化苄法提取香蕉各组织基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图2示出根据本发明的氯化苄法中不同浓度氯化苄提取香蕉各组织基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果；

图3示出根据本发明的氯化苄法DNA的ITS扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例详细描述本发明。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

香蕉基因组DNA提取方法的比较实验

在香蕉基因组DNA提取方法比较实验中，香蕉的叶、假茎、根和果实样品均采自国内香蕉主栽品种‘巴西蕉’(Musa Cavendish AAA)。此外，果实催熟后分别对果皮和果肉部位进行采样。所有样品采集后迅速用95％的酒精清洗，分别置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

取0.5g上述各样品，加入适量液氮后研磨成粉末，迅速转至2mL离心管中，然后分别按下述方法提取基因组DNA。

(1)氯化苄法(即本发明的方法)

步骤如下： 

实施例1：

①加入1mL提取缓冲液(100mmol·L-1 Tris-HCl pH 9.0、40mmol·L-1 EDTA pH 8.0)，以及150μL 10％SDS和氯化苄200μL，充分混匀后65℃水浴45min，期间每隔10min摇匀一次；

②加入450μL乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000×g的条件下离心8min；

③取上清至一新离心管，加入0.1mL-20℃预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后在设定的离心参数为13500×g的条件下离心10min，弃上清液；

④取沉淀用75％的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA，再用适量的RNase A消化(37℃水浴1h)，取出后于-20℃保存备用。

实施例2：

①加入1mL提取缓冲液(100mmol·L-1 Tris-HCl pH 9.0、40mmol·L-1 EDTA pH 8.0)，以及150μL 10％SDS和氯化苄600μL，充分混匀后65℃水浴45min，期间每隔15min摇匀一次；

②加入450μL乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000×g的条件下离心8min；

③取上清至一新离心管，加入0.1mL-20℃预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后在设定的离心参数为13500×g的条件下离心10min，弃上清液；

④取沉淀用75％的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA，再用适量的RNase A消化(37℃水浴2h)，取出后于-20℃保存备用。

实施例3：

①加入1mL提取缓冲液(100mmol·L-1 Tris-HCl pH 9.0、40mmol·L-1 EDTA pH 8.0)，以及150μL 10％SDS和氯化苄800μL，充分混匀后65℃水浴45min，期间每隔10-15min摇匀一次；

②加入450μL乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000×g的条件下离心8min；

③取上清至一新离心管，加入0.1mL-20℃预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后在设定的离心参数为13500×g的条件下离心10min，弃上清液；

④取沉淀用75％的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA，再用适量的RNase A消化(37℃水浴1-2h)，取出后于-20℃保存备用。

实施例4：

①加入1mL提取缓冲液(100mmol·L-1 Tris-HCl pH 9.0、40mmol·L-1 EDTA pH 8.0)，以及150μL 10％SDS和氯化苄400μL，充分混匀后65℃水浴45min，期间每隔10-15min摇匀一次；

②加入450μL乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000×g的条件下离心8min；

③取上清至一新离心管，加入-20℃预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后在设定的离心参数为13500×g的条件下离心10min，弃上清液；

④取沉淀用75％的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA，再用适量的RNase A消化(37℃水浴1-2h)，取出后于-20℃保存备用。

(2)CTAB常规法

步骤如下： 

①加入1mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液(100mmol·L^-1Tris-HCl pH 8.0、20mmol·L^-1EDTA pH 8.0、1.4mol·L^-1NaCl、3％CTAB、2％PVP、4％β-巯基乙醇)，充分混匀后65℃水浴1h，每隔10-15min摇匀一次；

②取出离心管，室温下冷却，加入0.6mL苯酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)，充分混 匀后静置片刻，设定的离心参数为12000×g的条件下离心10min；

③取上清液至新离心管，加入0.6mL的氯仿:异戊醇(体积比24:1)，混匀后设定的离心参数为12000×g的条件下离心10min；

④取上清液至新离心管，加入0.1mL的乙酸钠和0.1mL-20℃预冷的异丙醇，充分混匀后-20℃放置1h以上，设定的离心参数为12000×g的条件下离心8min；

⑤弃上清液，取沉淀用75％的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA，再用适量的RNase A消化(37℃水浴1-2h)，取出后于-20℃保存备用。

(3)CTAB改良法1

操作步骤同CTAB常规法，区别在于步骤①抽提时CTAB提取缓冲液中NaCl浓度提高至2.50mol·L^-1，同时加入30μL蛋白酶K(浓度20mg·mL^-1)。

(4)CTAB改良法2

操作步骤基本同CTAB常规法，区别在于上述步骤③中加入少量无水乙醇，可以沉淀多糖，并且利于去除蛋白质。

上述步骤③具体改动如下：待利用CTAB提取缓冲液抽提、离心后，取上清液至新离心管，加入0.3mL无水乙醇和0.4mL苯酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)，充分混匀后静置片刻，离心取上清液；后续操作同上述CTAB常规法步骤④和⑤。

(5)CTAB改良法3

①加入CTAB提取缓冲液于65℃水浴1h后，加入0.5mL氯仿:异戊醇(体积比24:1)抽提去除蛋白质，设定的离心参数为13500×g的条件下离心10min，取上清液；

②加入0.6mL-20℃预冷的异丙醇用于沉淀核酸，充分混匀后设定的离心参数为13500×g的条件下离心10min，弃上清液；

③沉淀用0.8mL 1mol·L^-1NaCl溶解DNA，加入0.8mL苯酚:氯仿(体积比1:1)，充分混匀后在设定的离心参数为13000×g的条件下离心10min，取上清液；

④再加入0.8mL氯仿:异戊醇(体积比24:1)，充分混匀后在设定的离心参数为13000×g的条件下离心8min，取上清液；

⑤加入0.8mL预冷的无水乙醇混匀再次去除杂质，在设定的离心参数为13500×g的条件下离心10min，弃上清液；

⑥沉淀用70％的乙醇洗涤1次，室温挥发乙醇，后续操作同上述CTAB常规法步骤⑤。

(6)SDS法

步骤如下： 

①加入1mL提取缓冲液(100mmol·L^-1Tris-HCl pH 8.0、50mmol·L^-1EDTA pH 8.0、0.5mol·L^-1NaCl、2％β巯基乙醇)，混匀后加入0.5mL 10％SDS，充分混匀后65℃水浴60min，期间每隔10-15min摇匀一次；

②加入1mL 5mol·L^-1乙酸钠，混匀后冰浴30min，在设定的离心参数为12000×g的条件下离心10min；后续操作同上述CTAB常规法步骤③、④和⑤。

(7)SDS结合蛋白酶裂解法

步骤如下：加入1mL 50℃预热的提取缓冲液(10mmol·L^-1Tris-HCl pH 8.0、100mmol· L^-1EDTA pH 8.0、0.5％SDS、75mg·L^-1蛋白酶K)，充分混匀后50℃水浴2h，每隔10-15min摇匀一次；后续操作同上述CTAB常规法步骤②、③、④和⑤。

(8)改良尿素法 

步骤如下： 

①加入1mL提取缓冲液(7mol·L^-1尿素、0.3mol·L^-1NaCl、0.034mol·L^-1十二烷基肌氨酸钠、50mmol·L^-1Tris-HCl pH 8.0、20mmol·L^-1EDTA pH 8.0、2％β巯基乙醇)，充分混匀后65℃水浴45min，期间每隔10-15min摇匀一次；②在设定的离心参数为13000×g的条件下离心10min，取上清加入100μL 10mol·L^-1乙酸胺，混匀后再加入2倍体积的无水乙醇，混匀后在设定的离心参数为13000×g的条件下离心10min；

后续操作同上述CTAB常规法步骤②、③、④和⑤。

香蕉基因组DNA的质量检验 

(1)①由上述各种方法提取的香蕉基因组DNA的凝胶电泳检测

取按上述各种方法提取的香蕉基因组DNA样品3μL于1.0％琼脂糖凝胶(含EB－溴化乙锭)中分别进行电泳，在凝胶成像系统下观察、拍照。

在图1(图1-1、图1-2、图1-3以及图1-4)中，1：以香蕉果肉的基因组DNA为样品的泳道；2：以香蕉果皮的基因组DNA为样品的泳道；3：以香蕉根的基因组DNA为样品的泳道；4：以香蕉假茎的基因组DNA为样品的泳道；5：以香蕉叶的基因组DNA为样品的泳道；M：Maker(10000)；A:CTAB常规法；B:CTAB改良法1；C:CTAB改良法3；D:CTAB改良法2；E:SDS法；F:SDS结合蛋白酶裂解法；G:改良尿素法；H:氯化苄法。如图1中所示，A(CTAB常规法)与B(CTAB改良法1)下凝胶电泳图类似，香蕉果肉与果皮样品中未出现基因组DNA的条带，根中条带不清晰，仅假茎与叶中出现较清晰的条带；C(CTAB改良法3)与D(CTAB改良法2)下凝胶电泳图类似，香蕉果皮样品中未出现基因组DNA的条带，香蕉其它组织中出现较清晰的基因组DNA的条带；E(SDS法)与F(SDS结合蛋白酶裂解法)下凝胶电泳图类似，香蕉果肉与果皮样品中未出现基因组DNA的条带，而且香蕉其它组织中出现基因组DNA的条带不清晰；G(改良尿素法)与H(氯化苄法)下凝胶电泳图类似，H(氯化苄法)提取的香蕉的果肉、果皮、根、假茎以及叶中均有清晰的主条带，而且条带整齐明亮，几乎没有降解，但是G(改良尿素法)下，香蕉果皮样品中未出现基因组DNA的条带。如上所述，仅H(氯化苄法)能提取香蕉各组织中的基因组DNA，而且主条带清晰明亮可见，即，该方法提取的DNA完整性较好、质量较高。

②按加入不同浓度氯化苄的氯化苄法提取的香蕉基因组DNA的凝胶电泳检测

取按不同体积氯化苄的氯化苄法提取的香蕉基因组DNA样品3μL于1.0％琼脂糖凝胶(含EB－溴化乙锭)中分别进行电泳，在凝胶成像系统下观察、拍照。

在图2中，1：以香蕉果肉的基因组DNA为样品的泳道；2：以香蕉果皮的基因组DNA为样品的泳道；3：以香蕉根的基因组DNA为样品的泳道；4：以香蕉假茎的基因组DNA为样品的泳道；5：以香蕉叶的基因组DNA为样品的泳道；M：Maker(10000)；C1：400μL氯化苄的氯化苄法；C2：200μL氯化苄的氯化苄法；C3：600μL氯化苄的氯化苄法；C4：800μL氯化苄的氯化苄法。如图2中所示，在C4下，1泳道(果肉)中条带明显与其它泳道中的条 带跑得慢，而且条带模糊，这可能是该果肉基因组DNA中含有较多的蛋白质以及酚类；在C1、C2与C3下，条带状况基本相似，但C1与C2下，泳道2中条带非常淡，而C3中，各泳道的带比较清晰、整齐。综上所示，C3(600μL氯化苄的氯化苄法)最适于提取香蕉各组织中的基因组DNA。

(2)吸光度检测 

利用核酸蛋白测定仪(Eppendorf BioPhotometer Plus)检测按上述各种方法提取的香蕉基因组DNA样品的质量浓度(单位样品中提取出的基因组DNA的质量，单位：μg/mL)以及在波长260nm、280nm处的吸收值A260和A280，计算A260/A280用以判断DNA的纯度。表1示出不同方法提取香蕉各组织DNA的质量浓度(μg/mL)。表2示出不同DNA提取方法提取香蕉各组织DNA的A260/A280值。表3示出氯化苄法中添加不同浓度氯化苄提取香蕉各组织DNA的质量浓度(μg/mL)、A260/A280值。

纯DNA的A260/A280比值为1.8，若A260/A280比值在1.7～1.9之间，则表明DNA的纯度较高；若比值在1.5及以下则表示DNA溶液中含50％以上的蛋白质，即，DNA受到蛋白(芳香族)或酚类物质的污染。

表1中明显可见氯化苄法(600μL)无论在香蕉的叶、假茎与根中，还是在果皮以及果肉中提取出的基因组DNA的质量浓度均高于其它方法中提取的基因组DNA。

如表2中所示，仅CTAB改良法2与氯化苄法(600μL)能从香蕉各组织(叶、假茎、根、果皮以及果肉)中提取出基因组DNA；并且仅氯化苄法(600μL)的A260/A280比值均在1.7～1.9之间，如上所述，上述方法中仅氯化苄法(600μL)能从香蕉各组织中提取出纯度高的基因组DNA。

如表3中所示，600μL氯化苄的氯化苄法在香蕉叶、假茎、根中提取的基因组DNA的质量浓度均高于其它浓度的氯化苄法，而且A260/A280比值均在1.7～1.9之间；虽然600μL氯化苄的氯化苄法在香蕉果肉中提取的基因组DNA的质量浓度低于800μL氯化苄的氯化苄法，但是600μL氯化苄的氯化苄法的A260/A280比值高于800μL氯化苄的氯化苄法的A260/A280比值，并且小于1.8，另外，600μL氯化苄的氯化苄法在香蕉果皮、果肉中提取的基因组DNA的质量浓度均明显高于200μL、400μL的氯化苄的氯化苄法中提取的基因组DNA的质量浓度。

综上所述，在综合考虑基因组DNA质量浓度与纯度的情况下，600μL氯化苄的氯化苄法是提取香蕉不同组织的基因组DNA的最优方法。

表1不同方法提取香蕉各组织DNA的质量浓度对比

表2不同DNA提取方法提取香蕉各组织DNA的A260/A280值对比

表3氯化苄法中添加不同浓度氯化苄提取香蕉各组织DNA的质量浓度对比

(3)PCR扩增检测

分别从香蕉品种：Calcutta 4；巴西蕉(香牙蕉类)；Mbwazirume(东非高原香蕉)；Mbi Egome1(Plantain)；过山香；东莞大蕉(大蕉类)；广粉1号(粉蕉类)；贡蕉中取样，然后将所有样品迅速用95％的酒精清洗，分别置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

取0.5g上述各样品，加入适量液氮后研磨成粉末，迅速转至2mL离心管中，然后分别按氯化苄法(添加600μL氯化苄)提取基因组DNA。

以上述基因组DNA为模板，采用香蕉内转录间隔区通用引物ITS4/ITSL进行PCR扩增，产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后EB染色，在紫外光下观察、拍照。

在图3中，M：Maker(2000)的泳道；附图标记1、2、3、4、5、6、7以及8分别表示香蕉品种Calcutta 4、巴西蕉(香牙蕉类)、Mbwazirume(东非高原香蕉)、Mbi Egome1(Plantain)、过山香、东莞大蕉(大蕉类)、广粉1号(粉蕉类)以及贡蕉的基因组DNA的PCR产物的泳道。如图3中所示，电泳条带均清晰可见，为单一的700bp左右大小的带，符合香蕉种质资源ITS特有片段，由此可见，由氯化苄法(添加600μL氯化苄)提取的DNA符合PCR操作的需求。

综上所述，采用氯化苄法可简便、快速地提取香蕉不同组织的基因组DNA，而且所提取的基因组DNA完整性好、纯度高，适于PCR操作的需求；与提取基因组DNA的其它方法相比，就提取香蕉果皮、果肉的基因组DNA而言，600μL氯化苄的氯化苄法效果尤其凸显。

本文虽然已经给出了本发明的具体实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。