1-{3-(3-乙酰基-2,4-二羟基-苯基)-(2,4-二羟基-苯基)-甲基-2,6-二羟基-苯基}-乙酮的合成方法及其用途

技术领域

本发明涉及1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮的合成方法及其用途，属于食品、化妆品和医药领域。

背景技术

褐变和病原体感染导致的腐败是引起果蔬采后损失的两个重要因素。在果蔬加工和贮藏过程中，由酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)引起的酶促褐变不仅影响产品的色泽、外观，而且会破坏必需产品的氨基酸、降低其营养和消化吸收，并最终严重影响产品的营养价值和市场价值。许多果蔬由于受到真菌疾病、机械损伤以及老化等因素影响而导致保质期很短。通常情况下，天然菌群常常存在于果蔬产品中，也可能会存在于人类食用过程中，它们一般对人类没什么毒性；但是，在生产、收割、运输、以及进一步加工处理过程中，都可能导致果蔬产品受到微生物污染。机械损伤和破坏更会加重褐变和微生物的污染。使用酪氨酸酶抑制剂和杀菌剂可以控制果蔬采后褐变和病害。

天然的查尔酮广泛存在于水果、蔬菜、香料、茶、大豆食品和一些中草药中。目前查尔酮合成的主要方法是芳香醛和苯乙酮在碱性条件下通过Clasein-Schmidt缩合反应。在过去几十年中，来自世界各地的研究人员开发了不少合成查尔酮的方法。然而，这些方法有很多缺陷，如苛刻的反应条件、有毒试剂和金属催化剂、强酸强碱、油状产物、过长反应时间、低产率、低选择性以及繁琐的后处理程序。另外，在大部分情况下，合成羟基查尔酮衍生物需要保护和去保护羟基，不仅增加反应步数和时间，同时也增加使用有毒或有害试剂的机会。目前虽然也有一些绿色合成方法，如使用氢氧化钙做催化剂，用乙二醇作为反应溶剂等，但这些绿色合成方法同样存在着低产率、油状产物和繁琐后处理等问题。

本发明提供一种新的具备酪氨酸酶抑制活性的化合物及其合成方法，采用无毒无害原料、无毒的固体酸/碱催化剂和绿色溶剂，使用温和的条件，合成具有较高酪氨酸酶抑制活性的一种羟基查尔酮类衍生物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具酪氨酸酶抑制活性的化合物，通过2，4-二羟基苯甲醛和2，6-二羟基苯乙酮在硼酸和维生素C的催化制备得到，命名为1-{3-[(3-acetyl-2,4-dihydroxy-phenyl)-(2,4-dihydroxy-phenyl)-methyl]-2,6-dihydroxy-phenyl}-eth anone，其中文名为1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮，其结构如式(1)所示：

本发明的另外一个目的是提供所述1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮的绿色合成方法，通过以下步骤实现：

(1)2，4-二羟基苯甲醛和2，6-二羟基苯乙酮在硼酸和维生素C的催化下，以PEG400或乙二醇或乙醇或甲醇等为溶剂，于100～130℃反应3～6小时；2，4-二羟基苯甲醛与2，6-二羟基苯乙酮的摩尔比为2：1；

(2)反应液用乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚或三氯甲烷等萃取3-5次，有机相浓缩得干燥样品；

(3)干燥样品上硅胶柱，洗脱剂是以体积比10：1混合的二氯甲烷：甲醇；

(4)步骤(3)收集的含目的物的洗脱液样品浓缩得干燥样品，再经Sephadex LH-20凝胶柱层析分离得到目的物。

本发明的一种实施方式，主要包括以下步骤：

(1)2，4-二羟基苯甲醛和2-羟基苯乙酮在硼酸和维生素C的催化下，以PEG400为溶剂130℃反应6小时；2，4-二羟基苯甲醛与2，6-二羟基苯乙酮的摩尔比为2：1；

(2)反应液用乙酸乙酯萃取3次，有机相减压浓缩至干燥，得干燥样品；

(3)干燥样品上硅胶柱，洗脱剂是以体积比10：1混合的二氯甲烷：甲醇；

(4)步骤(3)收集的含目的物的洗脱液样品经浓缩干燥得干燥样品，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂是以体积比7：3混合的甲醇-水，收集洗脱液，薄层板检测，相同流分合并得到产物。

本发明的一种实施方式，步骤(3)所述硅胶柱是颗粒度为200-300目的硅胶。 

本发明所提供的1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮可应用于制备抗果蔬酶促褐变抑制剂、化妆品美白剂、预防和治疗黑色素异常导致的人体色素沉着性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病症的药物中，可以作为活性成分，不加或加入食品添加剂辅料、化妆品辅料或药剂上接受的辅料，按照相应剂型的制备方法制成制剂。

所述的剂型包括固体粉末、水溶液、醇溶液、乳液、面膜、巴布剂、注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩剂、微丸等。

本发明的有益之处在于：提供一种具有酪氨酸酶抑制活性的化合物，它具有比阳性对照物曲酸、2，6-二羟基苯乙酮和2，4-二羟基苯甲醛更强的活性，制成相应制剂易于质量控制，可应用在抗果蔬酶促褐变抑制剂、化妆品美白剂、预防和治疗黑色素异常导致的人体色素沉着性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病症的药物中。

附图说明

图1为化合物1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮的¹H NMR谱

图2为化合物1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮的¹³C NMR谱

图3为化合物1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮的HSQC谱

图4为化合物1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮的HMBC谱

图5为化合物1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮的ESI-MS谱

具体实施方式

实施例1 1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮的制备

称取0.06mol 2，4-二羟基苯甲醛、0.03mol 2，6-二羟基苯乙酮、2.0g硼酸、0.5g抗坏血酸于50mL圆底烧瓶中，加入25mL的PEG400搅拌溶解，置于130℃油浴中搅拌回流6h， TLC跟踪反应进程。反应液用乙酸乙酯萃取三次，有机相减压浓缩至干燥；干燥后的样品上硅胶柱(颗粒度：200～300目)，采用二氯甲烷：甲醇＝10：1(v/v)洗脱，收集洗脱液，薄层板检测，相同流分合并，浓缩干燥，得干燥样品；通过液质联用技术，确定分子量为424的流分为含有目标物的流分；以上流分干燥样品甲醇溶解后再用凝胶柱层析(Sephadex LH-20)进行分离，甲醇-水(v/v，7：3)洗脱；收集洗脱液，薄层板检测，相同流分合并，即得1-{3-[(3-acetyl-2,4-dihydroxy-phenyl)-(2,4-dihydroxy-phenyl)-methyl]-2,6-dihydroxy-phenyl}-ethanone纯品。

反应通式为： 

1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮的核磁共振光谱数据如下：

¹H NMR(Acetone-d₆，400MHz)δ：13.33(2H，s，OH-2,2')，9.53(2H，s，OH-4，4')，7.94(1H，s，OH-2”)，7.92(1H，s，OH-4”)，6.82(2H，d，J＝8.4Hz，H-6，6')，6.54(1H，d，J＝8.4Hz，H-6”)，6.39(1H，d，J＝2.0Hz，H-3”)，6.34(2H，d，J＝8.4Hz，H-5，5')，6.22(1H，dd，J＝8.0，2.4Hz，H-5”)，6.21(1H，s，H-7)，2.69(6H，s，H-9，9')；¹³C NMR(Acetone-d₆，100MHz)δ：206.4(C＝O，C-8，8')，162.7(C，C-2，2')，159.5(C，C-4，4')，157.7(C，C-2”)，156.7(C，C-4”)，137.0(CH，C-6，6')，130.8(C，C-6”)，124.3(C，C-1，1')，121.9(C，C-1”)，110.8(C，C-3，3')，106.9(CH，C-5”)，106.0(CH，C-5，5')，103.7(CH，C-3”)，36.1(CH，C-7)，33.6(CH₃，C-9，9')。

ESI-MS:m/z 423.1[M-H]^-(C₂₃H₁₉O₈)。结合二维谱HSQC和HMBC解析表明该化合物为1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮。

高效液相色谱-质谱联用检测条件：

(1)仪器：Waters UPLC-质谱仪。

(2)色谱柱：Acquity BEH C18(50×2.1mm,1.7μm)。

(3)流动相：A相：含0.2％甲酸的去离子水；B相：乙腈。线性洗脱梯度：0min，10％B；0.1min，10％B；18min，70％B；20min，100％B；20.1min，10％B。流速：0.3mL/min。

(4)进样量：1μL。

(5)质谱条件：负离子模式；喷涂电压：2.8V；离子源温度：120℃；脱溶剂温度：350℃。

实施例2酪氨酸酶抑制活性评价方法

将1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮用DMSO溶解分别配成50、10、5、2.5、0.5μg/mL。阳性对照曲酸配成50、25、10、5、2.5μg/mL浓度的溶液。取五种浓度的溶液各300μL，用700μL pH6.8的磷酸盐缓冲溶液配成1mL，加进0.1mg/mL的酪氨酸1mL，然后加入由pH值6.8的磷酸盐缓冲溶液配成的1mL酪氨酸酶(400U/mL)，在37℃下孵育20min，于492nm处测定吸光值，计算化合物抑制酪氨酸酶活性的能力。

酶活性抑制率＝[(A₂-A₁)-(B₂-B₁)]/(A₂-A₁)×100％

A₁为0min时候未加抑制剂的吸收值；A₂为20min后未加抑制剂的吸收值；

B₁为0min时候加抑制剂的吸收值；B₂为20min后加了抑制剂的吸收值。

实施例3化合物酪氨酸酶抑制活性评价

1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮抑制酪氨酸酶的IC₅₀为5.60μM，曲酸的IC₅₀为50.6μM，2，4-二羟基苯甲醛的IC₅₀>200μM，2，6-二羟基苯乙酮的IC₅₀>300μM。化合物1-{3-[(3-乙酰基-2，4-二羟基-苯基)-(2，4-二羟基-苯基)-甲基]-2，6-二羟基-苯基}-乙酮的酪氨酸酶抑制活性远远大于阳性对照物曲酸，以及反应原料2，6-二羟基苯乙酮和2，4-二羟基苯甲醛。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。