一种原子力显微镜检测单分子水平分子间相互作用的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种原子力显微镜检测单分子水平分子间相互作 用的方法。

背景技术

单分子检测(single molecular detection，SMD)是近十年来迅速发展起来的一项超灵敏 检测技术。常规分子检测技术仅能得到一般物质的整体属性，无法准确、有效地表达单个 分子及单个分子之间的相互作用。而很多生物分子(如蛋白质、DNA、RNA等)都有多种 构象，且分子之间具有相互作用。因此，从单分子水平检测生物分子，对识别、分类和定 量描述生物分子，实时监测化学反应途径，在生理条件下探测生物分子并提供分子结构和 功能之间的信息具有重要意义。

单分子检测是在纳米级空间尺度检测有限个数目的分子或分子相互作用的事件。采用 原子力显微镜的酶促反应可实现纳米或微米精密度下固相载体表面靶分子的可控固定。酶 促纳米加工刻蚀技术可提供酶促反应产物随AFM探针移动而重新沉积时的形貌信息。例 如，可通过在AFM探针上固定活性酶分子，以除去预先存在的生物分子或者将其转化为小 分子，得到底片图像。为实现高通量和柔性分子印刷，浸蘸笔纳米加工刻蚀技术(dip-pen  nanolithography，DPN)和微接触印刷技术已应用于多元DPN和多聚物笔加工刻蚀技术， 并可通过原子力显微镜或荧光成像可视化。由于这些技术涉及到纳米级操作，因此需要建 立可控方法以实现单个分子在基底表面特定位置的固定。原子力显微镜技术可将单个分子 固定于指定位置，已应用于单分子和其他单分子力学光谱技术的研究。

现有技术中没有通过采用原子力显微镜直接测量DNA之间的相互作用力，实现单分子 水平上监测DNA双链在切刻内切酶作用下发生的剪切反应，该现状亟待解决。

发明内容

本发明的目的是提供一种原子力显微镜用于检测单分子水平分子间相互作用的方法， 通过采用原子力显微镜直接测量DNA之间的相互作用力，实现了单分子水平上监测DNA 双链在切刻内切酶作用下发生的剪切反应，为研究单分子水平上的酶促反应提供了一种新 方法。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种原子力显微镜用于检测单分子水平分子间相互作用的方法，在基底表面修饰DNA1 和在AFM探针上修饰DNA2；当AFM探针与基底表面靠近时，通过DNA1与DNA2的互 补杂交，形成DNA1/DNA2双链结构；采用切刻内切酶特异性识别双链DNA1/DNA2中的 特定序列，并将单链DNA1切断；然后采用原子力显微镜检测DNA之间的作用力。

包括以下步骤：

(1)AFM探针修饰DNA2：将AFM探针进行羟基化修饰，得到羟基修饰的AFM探 针，然后活化羟基修饰的AFM探针，将活化后的AFM探针与氨基修饰的DNA2进行固定 反应，取出AFM探针，对AFM探针进行后处理。

(2)金基底上固定DNA1：预处理金基底，将处理好的金基底与巯基修饰的DNA1进 行固定反应，37℃反应3小时以上。

(3)原子力显微镜测力：将缓冲溶液3滴在步骤(2)中得到的金基底上，将液滴固 定在原子显微镜的扫描器上，测DNA之间的相互作用力F1；使用切刻内切酶时，将含有1× 切刻内切酶缓冲液、切刻内切酶和所述缓冲溶液3的混合溶液，滴加到金基底上，将液滴 固定在原子显微镜的扫描器上，测DNA之间的相互作用力F2；从而检测出DNA双链在切 刻内切酶剪切前后DNA之间相互作用力的变化。

步骤(1)中，所述羟基化修饰的过程为：将AFM探针浸泡在浓硫酸和双氧水的混合 溶液中(浓硫酸(质量分数95～98％)：双氧水(质量分数30％)＝7:3(体积比))30分钟， 去离子水洗净，得到羟基修饰AFM探针。

步骤(1)中，所述活化过程为：将羟基修饰的AFM探针浸泡在200μl浓度为100mM  N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液中(注意：NHS溶液现用现配)，避光放置30分钟后，去 离子水冲洗干净。

步骤(1)中，后处理的过程为：先用缓冲溶液2冲洗三次，再用去离子水洗净，空气 中干燥30分钟。所述缓冲液2的组成：300mM NaCl，20mM Na₂HPO₄，2mM乙二胺四 乙酸，7mM十二烷基硫酸钠，pH＝7.4；作用：用于清洗AFM探针。

步骤(1)中，所述固定反应的过程为：将修饰有DNA2的AFM探针浸泡在200μl浓 度为1μM的氨基修饰DNA2溶液中，25℃反应12小时以上，优选为12～24小时，最优 选的为16小时。

步骤(2)中，所述预处理金基底的过程为：将金基底清洗、干燥。进一步具体的过程 为：用清洗液浸泡超声10分钟，去离子水冲洗干净，氮气吹干。所述清洗液为：氨水和双 氧水的混合溶液，其中水：氨水：双氧水的体积比为5:1:1。

步骤(2)中，所述固定反应过程为：将处理好的金基底浸泡在1ml浓度为1μM的巯 基修饰DNA1中进行固定反应。

步骤(2)中，所述反应时间为3～24小时。

步骤(3)中，测DNA之间的相互作用力的过程为：将AFM探针放入液相探针架后， 将探针架装入原子力扫描显微镜。打开仪器开关，调节探针架使其下降，与金基底上的液 滴接触。确保金基底与探针架玻璃片之间无气泡后，调节光斑。选择接触模式，进针，停 驻时间：10000ms。开始测量DNA之间的相互作用力，从而检测出DNA双链在切刻内切 酶剪切前后DNA之间相互作用力的变化。

步骤(3)中，所述缓冲液3组成：20mM Tris-HCl，0.1M MgCl₂，pH＝8.0，作用：原 子力显微镜测力的检测体系。

步骤(3)中，所述切刻内切酶是一类识别DNA特异序列，并在识别位点或其周围剪 切双链DNA底物中的一条DNA链的内切酶。所述切刻内切酶为切刻内切酶Nb.BbvCI； 所述1×切刻内切酶Nb.BbvCI缓冲液的组成为醋酸钾、Tris-醋酸、醋酸镁和牛血清白蛋白 (BSA)，其中各组分的浓度分别为：50mM醋酸钾，20mM Tris-醋酸，10mM醋酸镁， 100μg/ml BSA，pH 7.9。

所述DNA1和DNA2为两条碱基互补的待测链。

本发明的有益效果是：本发明建立了一种原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM) 研究单分子水平上DNA双链在切刻内切酶作用下发生剪切反应的方法。选用金片作为基 底，通过Au-S共价键在金基底上固定DNA1，使其与通过酰胺反应固定在AFM探针上的 DNA2互补杂交，从而在基底表面形成完全互补杂交的DNA1/DNA2双链结构，且双链中 包含切刻内切酶的特异性识别位点。在切刻内切酶作用下，固定在金基底上的单链DNA1 被切断为DNA1’和DNA1”，其中DNA1’固定在金基底上。与双链DNA1/DNA2相比，由 于DNA1’与DNA2互补杂交的碱基数减少，因此DNA相互作用力减小。本发明通过采用 原子力显微镜直接测量DNA之间的相互作用力，实现了单分子水平上监测DNA双链在切 刻内切酶作用下发生的剪切反应，为研究单分子水平上的酶促反应提供了一种新方法，并 能准确、有效地表达单个分子及单个分子之间的相互作用，为揭示生命现象的重要过程提 供理论依据，在分析化学、临床诊断和生物过程动力学等领域具有广泛的实际应用价值。

附图说明

图1：原子力显微镜技术研究单分子水平上DNA双链在切刻内切酶作用下发生剪切反 应的原理图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

本发明中AFM探针来源于本原纳米仪器有限公司(接触模式)，金基底来源于芬兰 BioNavis公司，DNA1和DNA2来源于生工生物工程(上海)股份有限公司，原子力显微 镜来源于本原纳米仪器有限公司CSPM5500扫描探针显微镜(SPM)系统，其他试剂无特 殊说明均来自商业途径。

本发明中M表示mol/L，mM表示mmol/L，μM表示μmol/L。

实施例1

本实施例选用切刻内切酶Nb.BbvCI以研究单分子水平DNA双链在切刻内切酶作用下 发生的剪切反应(实验原理如图1所示)。主要包括以下步骤：

一、AFM探针上修饰DNA1：

1、首先分别配制缓冲溶液1、缓冲溶液2和缓冲溶液3。

缓冲溶液1组成：25mM NaHCO₃，5mM MgCl₂，10％(v/v)二甲基亚砜，pH＝8.5。作 用：用于配制DNA溶液。

缓冲溶液2组成：300mM NaCl，20mM Na₂HPO₄，2mM乙二胺四乙酸，7mM十二 烷基硫酸钠，pH＝7.4。作用：用于清洗AFM探针。

缓冲溶液3组成：20mM Tris-HCl，0.1M MgCl₂，pH＝8.0。作用：原子力显微镜测力 的检测体系。

2、将AFM探针浸泡在浓硫酸和双氧水的混合溶液中(浓硫酸(质量分数95％)：双氧 水(质量分数30％)＝7:3(体积比))30分钟，去离子水洗净，得到羟基修饰AFM探针， 探针力常数为0.2N/m。

3、将羟基修饰AFM探针浸泡在200μl浓度为100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶 液中(注意：NHS溶液现用现配)，活化AFM探针，避光放置30分钟后，去离子水冲洗 干净。

4、将所得AFM探针浸泡在200μl浓度为1μM的氨基修饰DNA2溶液中，25℃反应 16小时，通过酰胺反应将DNA2固定在AFM探针上。

其中，DNA2的核苷酸序列为，如SEQ ID NO：2所示：

5’-GGTTACTATCACGCCTCAGCCTGAGGCATCAGCACGATTAGTAGTCATATTAGGT AGGG-3’，3’端氨基修饰。

5、将AFM探针取出，先用缓冲溶液2冲洗三次，再用去离子水洗净，空气中干燥30 分钟。

二、金基底上固定DNA2：

1、金基底使用前，用清洗液(清洗液的组成：水：氨水：双氧水的体积比例为5:1:1) 浸泡超声10分钟，去离子水冲洗干净，氮气吹干。

2、将处理好的金基底浸泡在1ml浓度为1μM的巯基修饰DNA1中，37℃反应3小 时。

其中，所述DNA1的核苷酸序列为，如SEQ ID NO：1所示：

5’-CCCTACCTAATATGACTACTAATCGTGCTGATGCCTCAGGCTGAGGCGTGATAGTAA CC-3’，3’端巯基修饰。

三、原子力显微镜测力

1、将100μl缓冲溶液3滴在步骤二得到的固定有DNA1的金基底上，使其形成一个大 液滴。将大液滴固定在原子力显微镜的扫描器上。

2、将AFM探针放入液相探针架后，将探针架装入原子力扫描显微镜。打开仪器开关， 调节探针架使其下降，与金基底上的液滴接触。由于DNA1与DNA2序列完全互补，且包 含切刻内切酶Nb.BbvCI特异性识别位点(▲代表剪切位置)。当AFM 探针接近基底表面时，DNA1与DNA2互补杂交，形成DNA1/DNA2双链结构。

确保金基底与探针架玻璃片之间无气泡后，调节光斑。

3、选择接触模式，进针，停驻时间：10000ms。开始测量。通过原子力显微镜分别测 量5个不同位置的作用力(每个位置平行测定50次)，测得双链DNA1/DNA2间的相互作 用力为30.5±3.7nN。

4、采用上述步骤得到DNA2修饰的AFM探针和DNA1修饰的金基底。加入10μl 10× 切刻内切酶缓冲液，10U切刻内切酶，加缓冲液3补充体积至100μl，滴加到DNA1修饰 的金基底上。使切刻内切酶Nb.BbvCI识别双链DNA1/DNA2中DNA1的剪切位点，将DNA1 切断为DNA1’和DNA1”，其中DNA1’固定在基底上。反应结束后，收回AFM探针，测的 此时DNA间作用力减小为10.2±3.7nN。说明切刻内切酶Nb.BbvCI特异性识别双链 DNA1/DNA2的剪切位点，进而将固定在金基底上的单链DNA1剪切成两部分DNA1’(18 个碱基)和DNA1”(41个碱基)。由于DNA1’固定在金基底上，与剪切前的双链DNA1/DNA2 相比(59个碱基对)，由于DNA1’与DNA2互补杂交的碱基数减少为18个碱基对，因此 DNA相互作用力减小，实现了单分子水平酶促反应的检测。该方法可从单分子水平直接提 供分子间相互作用的信息，为揭示生命现象的重要过程提供理论依据，在分析化学、临床 诊断和生物过程动力学等领域具有广泛的实际应用价值。

其中，所述1×切刻内切酶Nb.BbvCI缓冲液的组成为醋酸钾、Tris-醋酸、醋酸镁、BSA， 其中各组分的浓度分别为：50mM醋酸钾，20mM Tris-醋酸，10mM醋酸镁，100μg/ml  BSA，pH 7.9。

本实施例采用原子力显微镜技术，建立了一种研究单分子水平上DNA双链在切刻内切 酶作用下发生剪切反应的方法。在基底表面和AFM探针上分别修饰DNA1和DNA2。当 AFM探针与基底表面靠近时，通过DNA1与DNA2的互补杂交，形成DNA1/DNA2双链结 构。切刻内切酶可特异性识别双链DNA1/DNA2中的特定序列，并将单链DNA1切断。由 于切断后基底上的DNA与AFM探针上的DNA杂交长度变短，因此当AFM探针向上抬起 时，通过原子力显微镜测得DNA间的相互作用力减小。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的 限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需 要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。