阿片样物质受体的正向变构调节剂和沉默变构调节剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年1月4日提交的美国临时申请序列号61/748,946的优先权，所述申请通过引用并入本文。

发明描述

此处随附含有参考文献(1)至(34)的参考书目，其各自通过引用并入本文。

本发明在本文中关于两种化合物进行具体描述，即，BMS-986121和BMS-986122(显示于图1)，其出于例举的目的呈现。

本发明的申请不意欲在范围中限于这两种化合物。相反，本发明的申请意欲覆盖发挥功能以提供本发明的所需方面的任何化合物。具体而言，本发明可适用的化合物包括发挥功能以结合阿片样物质受体且增强正构激动剂的结合亲和力或效力(或两者)的任何化合物。

G蛋白偶联受体(GPCR)的超家族，包含跨质膜蛋白，所述跨质膜蛋白经由质膜的内表面上的异源三聚G蛋白转导信号，导致参与细胞功能的许多方面的细胞内信号传导级联(1)。这些GPCR的细胞表面位置、组织分布和多样性使其成为药物干预的理想目标。实际上，约30％的市售药物靶向特异性GPCR活性(1, 2)。

阿片样物质受体是GPCR的A类家族的成员。存在四种阿片样物质受体类型(μ，δ，κ和ORL1)，其共享约60％氨基酸同一性(主要在跨膜结构域中)，并且通过异源三聚G蛋白的Gi/o家族信号传导，导致腺苷酸环化酶的抑制、离子通道活性的调节和细胞中的转录变化(3)。阿片样物质受体(和许多其他GPCR)也可以通过非G蛋白介导的途径信号传导，所述途径之一通过β-抑制蛋白募集至受体而起始。β-抑制蛋白参与受体脱敏和内化/再循环(4, 5)。阿片样物质受体是控制疼痛的关键目标，并且吗啡及其衍生物通过在阿片样物质受体、特别是μ阿片样物质受体充当激动剂而诱导疼痛缓解(6, 7)。阿片样物质受体已被广泛研究，因为需要更好地控制疼痛，同时试图减少或消除不良副作用。这些副作用包括耐受性、呼吸抑制、便秘、异常性疼痛和依赖(3, 8)。

为了克服这些副作用，研究已集中于开发更选择性的激动剂（其相比于其他阿片样物质受体类型靶向一种特异性阿片样物质受体类型），或部分激动剂(其与完全激动剂相比具有降低的效力)或联合治疗中一起使用的激动剂(9, 10)。然而，这些不同方法具有的单一共同性在于它们靶向该受体的正构(内源性)激动剂结合位点。已经用其他GPCR成功地使用的一种不同的方法是发现和开发变构配体，其相比于其正构对应物可以具有特定优点。

GPCR的变构配体结合受体上的位点，所述位点不同于结合正构(或内源性)激动剂的位点(11, 12)。变构调节剂(AM)可以在目标蛋白表现出一定范围的活性。正向变构调节剂(PAM)可以不具有任何内在效力，但是，当它们结合受体时增强正构激动剂的结合亲和力或效力(或两者)。负向变构调节剂(MAM)不具有任何内在效力，但是，当它们结合受体时抑制正构激动剂的结合亲和力或效力(或两者)。沉默变构调节剂(SAM)，也被称为中性变构配体(NAL)，结合于所述受体，但对正构激动剂亲和力或效力没有影响。然而，SAM可以在相同的变构位点充当竞争性拮抗剂，阻断PAM或NAM活性。尽管从治疗的观点来看不是特别有用，但SAM可以是显示假定的PAM或NAM效应是受体介导的有效工具。最后，变构激动剂可以结合和产生受体的直接激动剂活化，甚至在正构激动剂不存在的情况下。

变构配体具有与正构配体相比表现出相同家族中的GPCR亚型之间更大的选择性的潜能。对于一些GPCR已经证明了这一点，包括促代谢型谷氨酸受体、腺苷受体和毒蕈碱受体(13-17)。假设这种增加的选择性基于置于结合相同的内源性配体的密切相关的受体亚型之间的正构位点的进化限制。变构位点可以不需要这种进化限制。

尽管对于阿片样物质受体存在高选择性的正构激动剂配体，PAM的额外优势为作为疼痛控制中的潜在疗法的阿片样物质受体PAM提供了有趣的机会。

PAM，不像变构激动剂，在正构激动剂不存在的情况下，当它们结合受体时可不具有任何效应。因此，调节只有当正构激动剂结合受体时才发生。在体内，这导致细胞信号传导的时间和空间特征的保留；这是重要的，特别是对于脑和肠神经系统中的复杂神经元网络的信号传导。此外，通过保持天然受体信号传导的时间方面，PAM可以避免受体下调和由外源正构激动剂产生的持续受体活化触发的其他补偿机制。因此，可以预期阿片样物质受体PAM比外源正构激动剂产生更少的耐受性和依赖性。此处，我们描述μ阿片样物质受体PAM和SAM的发现和鉴定。使用β-抑制蛋白募集测定开发和实施高通量筛选(HTS)。起因于HTS的μ选择性PAM显示在β-抑制蛋白募集测定和G蛋白介导的信号传导测定中具有活性(腺苷酸环化酶活性和[³⁵S]GTPγS结合的抑制)。这些研究首先描述μ选择性PAM和SAM的存在，暗示正向变构作为用于发现密切调控的疼痛疗法的潜在新颖途径。

使用PathHunter®酶互补测定技术(DiscoveRx, CA)(18)从HTS运动鉴定潜在的阿片样物质受体配体。在该系统中，将被称为酶受体(EA)的β-半乳糖苷酶的N末端缺失突变体融合至U2OS细胞中稳定表达的β-抑制蛋白2的C末端。将被称为ProLink™ (PK)的β-半乳糖苷酶的突变的氨基末端片段融合至在这些细胞(U2OS-OPRM1)中重组表达的OPRM1受体的羧基末端。抑制蛋白结合至活化的μ阿片样物质受体导致酶的互补和酶活性的重构。因此，互补的酶活性可以用作抑制蛋白募集至μ阿片样物质受体的量度。在低(20 nM, ~EC₁₀)浓度的μ选择性正构激动剂内吗啡肽-I存在的情况下进行HTS运动，以鉴定激动剂和正向变构调节剂(PAM)两者。两种化合物被鉴定为潜在的μ阿片样物质受体PAM(μ-PAM)。这些化合物已被指定为BMS-986121和BMS-986122，并且它们的结构显示于图1A和B。BMS-986121和BMS-986122都不自身产生显著的β-抑制蛋白募集(激动剂检测模式)，但两种化合物都显著增强低浓度的内吗啡肽-I产生的β-抑制蛋白募集响应(PAM检测模式)(图1C和D)。在PAM检测模式，BMS-986121使20>max>50 (95%CI)为1.0>50为3.0>

为了测试响应的特异性，在表达PK-标记的δ阿片样物质受体的U2OS PathHunter®细胞(U2OS-OPRD1)中在类似测定中检查所述化合物。无一化合物在~EC₁₀>

为了进一步评估μ-PAM活性，在三种功能测定(β-抑制蛋白募集、腺苷酸环化酶活性的抑制和使用[³⁵S]GTPγS结合的G蛋白活化)中测试BMS-986121和BMS-986122。还在受体结合测定中评估化合物。

在各种浓度的各μ-PAM不存在或存在的情况下生成β-抑制蛋白的内吗啡肽-I介导的募集的浓度-响应曲线(CRC)。BMS-986121(图2A)或BMS-986122(图2B)产生内吗啡肽-I的效力的浓度依赖且饱和的向左偏移。BMS-986121产生内吗啡肽-I的效力的最大9倍增加。产生半最大向左偏移的BMS-986121的浓度为1.7 uM。BMS-986122产生内吗啡肽-I的效力的最大8倍增加，其中半最大向左偏移值为4.9 uM(图2C)。

阿片样物质受体经由Gα_i/o蛋白抑制腺苷酸环化酶(19)。为了评估μ-PAM对该信号传导途径的效应，在cAMP积累测定中测量它们的效应。U20S>50为76>10(30>50值分别为2.2>50；35>max)并不总是可重复的，并且在一些情况下，太低以致于无法测定浓度响应数据的拟合值。BMS-986122激动剂活性(41>50；60>max)更加明显。仅在高于产生内吗啡肽-I响应的显著增强所需的那些的浓度看到BMS-986121和BMS-986122的激动剂活性，并且两种激动剂响应未能达到内吗啡肽-I的最大效应。

在该测定中看到的PAM的激动剂活性和U2OS-OPRM1细胞中β-抑制蛋白募集测定中看到的激动剂活性的缺乏之间的差异可能是由于两种测定和/或细胞系的显著受体储备的差异。在重组CHO细胞中，与U2OS PathHunter®细胞中的抑制蛋白募集相比，内吗啡肽-I对于毛喉素刺激的cAMP积累的抑制的效力强~1000倍 ，表明与抑制蛋白测定相比，cAMP测定中存在显著水平的受体储备。先前已经显示，在表达高水平的GPCR蛋白的重组细胞中，PAM可以表现出激动剂活性(尽管在比对于PAM活性看到的浓度更高的浓度)(20)。实际上，已经表明，PAM是有效变构激动剂，并且观察到的激动剂效力的程度在很大程度上取决于用于检测信号的系统和测定的灵敏度(21)。

接下来，在来自稳定表达重组μ阿片样物质受体的C6神经胶质瘤细胞(C6μ)的膜中的G蛋白活化[³⁵S]GTPγS结合研究中表征μ-PAM(22)。在5分钟孵育后测定激动剂刺激的[³⁵S]GTPγS结合以捕获G蛋白活化的初始速率，这可以在该细胞系中区分部分激动剂与完全激动剂。10>35S]GTPγS结合的250％刺激，其中EC₅₀为222>50)(图4A)。BMS-986122>50)(图4B)。在该测定中对于PAM化合物中的任一种没有检测到任何显著激动剂活性。

在100 mM NaCl和10 uM GTPγS存在的情况下测定μ阿片样物质受体配体结合。在饱和结合研究中，μ-PAM，BMS-986122，不影响[³H]二丙诺啡结合亲和力(在媒介物存在的情况下的K_d是0.27>d是0.35>3H]二丙诺啡结合的竞争研究中使DAMGO的亲和力显著增加6倍(在媒介物存在的情况下的K_i是340>i是56>

[³⁵S]GTPγS结合测定中对部分激动剂的最大响应的增强将表明，μ-PAM能够调节该系统中观察到的效力。与[³⁵S]GTPγS>max，其中EC₅₀为110>50)(图4C)。在10>50>max)。这些数据证实，BMS-986121和BMS-986122可以正调节观察到的效力，其被测量为该系统中的部分激动剂吗啡的最大应答的增加。

先前实验使用表达高浓度受体的异种细胞系统。为了测定是否可以在天然组织中观察到μ-PAM活性，评估来自小鼠脑的膜中的DAMGO刺激的[³⁵S]GTPγS结合(图4F)。在BMS-986122>50)存在的情况下，DAMGO刺激[³⁵S]GTPγS结合的效力(458>50)向左偏移4.5倍。用BMS-986122观察到无激动剂活性。因此，对于来自具有内源水平的受体和G-蛋白的生理相关组织的膜中的DAMGO-介导的G蛋白活化还可以观察到μPAM活性。

在β-抑制蛋白募集测定中测试BMS-986122的许多密切类似物，以便探索化学系列的结构-活性关系(SAR)。在测试的15种类似物中，13种对μ受体显示至少一些PAM活性。这些化合物无一显示对μ阿片样物质受体的激动剂活性(图S3)。然而，所述类似物中的5种的确显示对δ受体的一些低效力激动剂或PAM活性(图S3)，表明对该化学型的修饰可以改变μ阿片样物质相比于δ-阿片样物质受体的选择性。对BMS-986122的结构的修饰影响U2OS-OPRM1细胞中化合物的PAM活性(图S3；表S2)。对于大部分，检查的类似物保留相对于BMS-986122类似的效力(在低μM范围中的EC₅₀值)。然而，对BMS-986122的结构的微小变化导致PAM检测模式中观察到的E_max值的明显降低。这可以推测为对应于化合物可以产生的内吗啡肽-I效力中的最大向左偏移的降低。在测试的类似物中，无一表现出比初始筛选命中物BMS-986122的更大PAM活性。

已经观察到，GPCR的变构调节剂可以经常表现出化学系列内的“活性转换”：化学结构中的微小修饰可以使化合物从PAM改变为负向(NAM)或沉默(SAM)变构调节剂(23)。所述类似物中的2种中观察到的PAM效力的不存在可能是由于结合亲和力的损失，或从PAM功能转换为NAM或SAM。因此，在U2OS-OPRM1细胞中的β-抑制蛋白募集测定和C6μ细胞中的[³⁵S]GTPγS测定中，评估这些BMS-986122类似物中的两种(指定为BMS-986123和BMS-986124)抑制正构激动剂活性的能力(在NAM检测模式测定中)或抑制BMS-986122>80浓度的内吗啡肽-I(300nM)(图S4)，表明它们不是NAM或正构拮抗剂。然而，在30>20)内吗啡肽-I存在的情况下，两种化合物都能够抑制在U2OS-OPRM1细胞中对12.5>80)>b值(在平衡时在激动剂不存在的情况下会占据50％受体的竞争性拮抗剂的抑制常数)分别为1>50)存在的情况下，DAMGO刺激C6μ细胞膜中的[³⁵S]GTPγS结合的效力再次增强8倍(224>50)(图5B，图S5)。BMS-986122>50)>

μ-SAM，BMS-986123产生[³H]二丙诺啡结合亲和力的小的(~2倍)、但显著下降(图S2)，但对DAMGO结合亲和力没有显著影响(表S1)。BMS-986123或BMS-986124(图S6和S7)在10>35S]GTPγS测定中的效力，尽管两种SAM在较小程度增加吗啡E_max(图S7)。在该测定中对于SAM化合物中的任一种没有检测到任何显著激动剂活性。

探针依赖性(变构调节剂调节一种正构激动剂、但不调节另一种正构激动剂的能力)是一些变构调节剂的显著特征(24)。BMS-986121 (100 uM)产生内吗啡肽-I(4.3倍)、吗啡(6.5倍)和亮氨酸-脑啡肽(4.5倍)在CHO-μ细胞中的毛喉素刺激的cAMP积累测定的抑制的效力的向左偏移(图S8)。将来自[³⁵S]GTPγS结合研究的DAMGO和吗啡数据集合和β-抑制蛋白数据合计，现在没有证据证明强烈探针依赖性，因为BMS-986121产生肽激动剂和小分子激动剂诱发的响应的类似增强。

如上所示，当结合正构激动剂时，PAM(不像变构激动剂)通常仅调节受体的活性，维持了体内细胞信号传导的时间和空间方面。因此，PAM相对于它们的正构激动剂对应物具有显著的优势。用传统的激动剂配体，受体长时间打开(基于给药方案)，经常导致不良效应，诸如长期刺激引起的受体响应的脱敏或受体介导的副作用。在阿片样物质受体的情况下，用阿片制剂长期给药导致耐受性和依赖性的发展，以及其他急性受体介导的副作用，诸如，呼吸抑制、便秘和异常性疼痛(3, 8)。我们已经确定，此处所述的μ-PAM可以正性调节μ阿片样物质受体对内源性激动剂内吗啡肽-I和亮氨酸-脑啡肽的响应。重要的是确定当体内单独施用时μ-PAM是否可以产生镇痛作用，增效对内源性阿片样物质激动剂的响应。μ阿片样物质受体活化的基础调节的证据确实存在。例如，降解内源性阿片肽的脑啡肽酶的抑制导致炎症和神经性疼痛的动物模型中的镇痛作用(25)。此外，当施用于不服用外源性阿片制剂的术后患者后，阿片样物质受体拮抗剂纳洛酮增加疼痛知觉，表明内源性阿片肽产生基础镇痛调节，其可以被纳洛酮降低(26)。

PAM的另一个优点是其使正构激动剂的效力向左偏移有限量的能力。例如，BMS-986122的类似物(表S2)显示使正构激动剂的效力向左移动的差异能力，导致当化合物与低剂量的内吗啡肽-I共同施用时的不同的E_max值。药物开发程序可以利用该有限的效力移位以便通过设计无法超过效果的所需水平的PAM以改善安全性。

阿片样物质受体耐受性和依赖性由长期暴露于阿片制剂而导致，导致细胞功能的改变，导致需要增加激动剂介导相同镇痛效果的剂量。可以预测，与μ-PAM一起施用的较低剂量的吗啡，可以产生与较高剂量的单独吗啡相同的功能反应，因此可以免去耐受性的发展。重要的是确定激动剂与PAM的组合是否导致脱敏和/或耐受性和依赖性相比于单独的激动剂的降低。关于GABA-B受体，这有一些优先。GABA-B受体PAM，GS39783，当与低剂量的激动剂组合时，产生与较高剂量的GABA-B激动剂相同水平的功能反应，还产生较少的GABA-B受体脱敏(27)。这可以表明，较低剂量的阿片制剂与μ-PAM的共同施用，可以区分阿片制剂的治疗性镇痛特性和它们的耐受性和依赖性倾向。此外，存在μ-PAM可使正构激动剂响应偏离远离介导耐受性和依赖性和其他不想要的效应的信号传导通路而有利于介导如其他系统中观察到的治疗响应的信号传导通路的可能性(24, 27, 28)。

在本专利申请中，我们已经具体地描述两种μ阿片样物质受体选择性PAM的发现和表征。BMS-986122化学型显示来自结构活性关系研究的化学溯源性，并且也导致μ阿片样物质受体SAM的鉴定。就我们所知，存在第一种阿片样物质受体PAM和SAM描述于文献中。两种PAM显示正构激动剂介导的β-抑制蛋白募集的增强、腺苷酸环化酶抑制和G蛋白活化。BMS-986122增强小鼠脑膜中的DAMGO介导的[³⁵S]GTPγS结合，并且似乎至少部分是μ阿片样物质受体用于DAMGO结合的正亲和力调节剂。这些研究提供了用于开发新颖阿片样物质变构调节剂的概念验证，所述新颖阿片样物质变构调节剂可以具有慢性疼痛控制的治疗潜力，且具有改善的副作用和降低的耐受性和依赖性倾向。

下面描述本发明的一些方面。

在本发明的一个方面，提供了鉴定μ阿片样物质受体正向变构调节剂的筛选方法，其包括以下步骤：

(i) 将正向变构调节剂测试化合物和低浓度的μ选择性正构激动剂单独或与式I (BMS-986123)代表的沉默变构化合物共同添加至细胞；

(ii) 测量所述μ选择性正构激动剂和所述测试化合物单独或在所述式I化合物存在的情况下对所述细胞的效应；和

(iii) 如果通过所述测试化合物的正向变构激动剂活性的降低证明所述式I的化合物显示与所述测试化合物的竞争性结合，则将所述测试化合物鉴定为是正向变构调节剂。

优选地，μ选择性正构激动剂的低浓度选自：

(a) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC80；

(b) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC70；

(c) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC60；

(d) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC50；

(e) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC40；

(f) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC30；

(g) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC20；

(h) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC10。

优选地，所述细胞是U2OS细胞、CHO细胞或C6神经胶质瘤细胞。

在本发明的另一个方面，提供了鉴定μ阿片样物质受体负向变构调节剂的筛选方法，其包括以下步骤：

(i) 将负向变构调节剂测试化合物和高浓度的μ选择性正构激动剂单独或与式I (BMS-986123)代表的沉默变构化合物共同添加至细胞；

(ii) 测量所述μ选择性正构激动剂和所述测试化合物单独或在所述式I化合物存在的情况下对所述细胞的效应；和

(iii) 如果通过所述测试化合物的负向变构激动剂活性的降低证明所述式I的化合物显示与所述测试化合物的竞争性结合，则将所述测试化合物鉴定为是负向变构调节剂。

优选地，μ选择性正构激动剂的低浓度选自：

(a) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC10；

(b) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC20；

(c) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC30；

(d) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC40；

(e) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC50；

(f) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC60；

(g) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC70；

(h) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC80；

(i) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC90；和

(j) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC100。

优选地，除了融合至OPRM1的C末端的β半乳糖苷酶的突变的氨基末端片段以外，所述细胞重组表达融合至β-抑制蛋白2的C末端的β半乳糖苷酶的N末端缺失突变体。

优选地，μ选择性正构激动剂是内吗啡肽-I。

优选地，所述细胞重组表达人μ阿片样物质受体(CHO-μ)。

优选地，所述细胞重组表达人μ阿片样物质受体(C6-μ)。

优选地，μ选择性正构激动剂是DAMGO。

在本发明的另一个方面，提供了证实正向变构调节剂测试化合物具有μ阿片样物质受体正向变构调节剂的方法，其包括以下步骤：

(i) 将正向变构调节剂测试化合物和低浓度的μ选择性正构激动剂单独或与式I (BMS-986123)代表的沉默变构化合物共同添加至细胞；

(ii) 测量所述μ选择性正构激动剂和所述测试化合物单独或在所述式I化合物存在的情况下对所述细胞的效应；和

(iii) 如果通过所述测试化合物的正向变构激动剂活性的降低证明所述式I的化合物显示与所述测试化合物的竞争性结合，则证实所述测试化合物具有正向变构调节活性。

优选地，μ选择性正构激动剂的低浓度选自：

(a) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC80；

(b) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC70；

(c) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC60；

(d) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC50；

(e) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC40；

(f) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC30；

(g) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC20；

(h) 在所述细胞中小于或等于约计算的EC10。

在本发明的另一个方面，提供了证实负向变构调节剂测试化合物具有μ阿片样物质受体负向变构调节剂的方法，其包括以下步骤：

(i) 将负向变构调节剂测试化合物和高浓度的μ选择性正构激动剂单独或与式I (BMS-986123)代表的沉默变构化合物共同添加至细胞；

(ii) 测量所述μ选择性正构激动剂和所述测试化合物单独或在所述式I化合物存在的情况下对所述细胞的效应；和

(iii) 如果通过所述测试化合物的负向变构激动剂活性的降低证明所述式I的化合物显示与所述测试化合物的竞争性结合，则证实所述测试化合物具有负向变构调节剂。

优选地，μ选择性正构激动剂的低浓度选自：

(a) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC10；

(b) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC20；

(c) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC30；

(d) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC40；

(e) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC50；

(f) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC60；

(g) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC70；

(h) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC80；

(i) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC90；和

(j) 在所述细胞中大于或等于约计算的EC100。

优选地，所述细胞是U2OS细胞、CHO细胞或C6神经胶质瘤细胞。

优选地，除了融合至OPRM1的C末端的β半乳糖苷酶的突变的氨基末端片段以外，所述细胞重组表达融合至β-抑制蛋白2的C末端的β半乳糖苷酶的N末端缺失突变体。

优选地，μ选择性正构激动剂是内吗啡肽-I。

优选地，所述细胞重组表达人μ阿片样物质受体(CHO-μ)。

优选地，所述细胞重组表达人μ阿片样物质受体(C6-μ)。

优选地，μ选择性正构激动剂是DAMGO。

在本发明的另一个方面，提供了治疗有需要的患者中的疼痛的方法，其包括向患者施用作为μ阿片样物质受体的正向变构调节剂的化合物。

优选地，所述化合物相对于δ阿片样物质受体对于μ阿片样物质受体是选择性的。

优选地，所述化合物有效提供选自G蛋白活化、腺苷酸环化酶活性的抑制或b-抑制蛋白募集的至少一种μ阿片样物质受体功能的增强。

在本发明的另一个方面，提供了治疗有需要的患者中的疼痛的方法，其包括向患者施用作为μ阿片样物质受体的正向变构调节剂的化合物和作为μ阿片样物质受体的正构激动剂的另一种化合物的组合。

优选地，作为μ阿片样物质受体的正向变构调节剂的化合物相对于δ阿片样物质受体对于μ阿片样物质受体是选择性的。

优选地，作为μ阿片样物质受体的正向变构调节剂的化合物有效提供选自G蛋白活化、腺苷酸环化酶活性的抑制或β-抑制蛋白募集的至少一种μ阿片样物质受体功能的增强。

在本发明的另一个方面，提供了调节μ阿片样物质受体的方法，其包括在正构外源性或内源性激动剂存在的情况下使所述受体与有效提供受体功能的增加的化合物接触。

优选地，在最大效应、效力或两者中观察到受体功能的增加。

尽管已经关于特定方面描述了本发明，但意欲本文所述的权利要求不应限于所述的特定方面，并且权利要求将有权获得根据法律提供的全部范围。

上述实验中使用的某些材料和方法如下。

试剂和细胞。

工程改造以表达Prolink/Enzyme Donor (PK)-标签化的OPRM1(μ阿片样物质)受体或Prolink/Enzyme Donor (PK)-标签化的OPRD1(δ阿片样物质)受体的PathHunter® β-抑制蛋白U2OS细胞来自DiscoveRx (Fremont, CA)。表达重组μ阿片样物质受体(CHO-μ)的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)来自PerkinElmer (Waltham, MA)。稳定表达重组μ阿片样物质受体(C6μ)的C6神经胶质瘤细胞如先前所述开发(29)。细胞培养基和补充剂来自Life Technologies™ (Carlsbad, CA)。HTRF® cAMP检测试剂来自Cisbio (Cambridge, MA)。PathHunter®检测试剂来自DiscoveRx™ (Freemont, CA)。硫酸吗啡、亮氨酸脑啡肽、β内啡肽和所有其他非阿片样物质配体生化试剂来自Sigma-Aldrich® (St. Louis, MO)。[³⁵S]GTPγS和[³H]二丙诺啡来自PerkinElmer。所有其他阿片样物质配体来自Tocris>

β-抑制蛋白募集测定

β-抑制蛋白募集测定根据DiscoveRx建立的方案(参见SI方法)在U2OS-OPRM1和U2OS-OPRD1细胞悬浮液中进行。

毛喉素刺激的cAMP积累抑制测定。

毛喉素刺激的cAMP积累抑制使用CisBio HTRF cAMP检测试剂盒以建立的方案(参见SI方法)在CHO-μ细胞悬浮液中进行。

细胞膜匀浆

如先前所述(30)，使稳定表达大鼠MOR(C6μ)的C6神经胶质瘤细胞生长，且制备细胞膜。对于小鼠脑膜，将小鼠通过颈脱位处死。如先前所述(31)，移取减去小脑的全脑组织，立即冷冻在冰冷的50 mM Tris-HCl, pH 7.4中，并且制备制备膜匀浆。将最终膜沉淀重新悬浮在50 mM Tris-HCl, pH 7.4中，等分且储存在-80℃。蛋白含量使用Bradford的方法(32)测定。

[³⁵S]GTPγS结合测定

膜中的[³⁵S]GTPγS结合如先前所述(22)进行(参见SI方法)。

[³H]二丙诺啡饱和结合研究

[³H]二丙诺啡饱和结合研究如先前所述(33)进行。简而言之，将膜(5>3H]二丙诺啡和10>2和50>35S]GTPγS结合所述，将样品快速过滤通过玻璃纤维过滤垫。

[³H]二丙诺啡竞争结合研究

[³H]二丙诺啡竞争结合研究如先前所述(34)进行。将膜(10>3H]二丙诺啡和0-10>2和50>35S]GTPγS结合所述，将样品快速过滤通过玻璃纤维过滤垫。

将浓度响应数据使用非线性回归分析拟合至逻辑方程(方程1)，以便使用GraphPad Prism^TM>50)和斜率因子(Hill斜率)的估算值。

Y=最低值 + (最高值-最低值)/(1+10^((LogEC₅₀-X)*Hill斜率))>

其中描述了P值，通过双因素ANOVA以Bonferroni后检验使用GraphPad Prism^TM>

β-抑制蛋白募集测定

使PathHunter® U2OS-OPRM1和U2OS-OPRD1细胞在含有10%胎牛血清(FBS)、500 ug/ml G418和250 ug/ml潮霉素的改良Eagle培养基(MEM)中生长。使细胞在细胞培养Nunc三层烧瓶(Thermo Fisher Scientific)中生长至汇合，用TrypLE^TM>6个细胞/ml重新悬浮在测定缓冲液(Hanks缓冲盐溶液(HBSS)>10)的正构激动剂的测定缓冲液(PAM检测模式)，或含有~EC₈₀浓度的正构激动剂的测定缓冲液(拮抗剂/NAM检测模式)添加至测定板。在结果中描述了使用的正构激动剂和它们的最终浓度。最后，将1>

毛喉素刺激的cAMP积累抑制测定。

使表达重组人μ阿片样物质受体(CHO-μ)的CHO细胞在T-175细胞培养瓶(Corning)中含有10% FBS、100 IU/ml青霉素、100 ug/ml链霉素和400 ug/ml G418的F12培养基中生长至汇合，并且用TripLE^TM>5个细胞/ml重新悬浮在测定缓冲液中。

将化合物(30 nl的100% DMSO中的100x最终浓度)通过使用Echo-550的声学分配添加至1536孔白色固体未处理板。接下来，将1.5 ul的没有(激动剂检测模式)或有(PAM检测模式) 2x内吗啡肽-I (30 pM最终，~EC₁₀浓度)的含有1>

CHO-μ cAMP测定中的μ选择性PAM的表征，使用曲线偏移测定和探针依赖测定，如上所述进行，其使用结果中描述的正构激动剂和调节剂。

[³⁵S]GTPγS结合测定

将膜用50 mM Tris-HCl, pH 7.4稀释，并且在室温在摇动水浴中与含有GDP的测定缓冲液预孵育(1体积膜 + 2体积2×测定缓冲液)30分钟。然后将150 ul膜/测定缓冲液混合物添加至含有50 ul药物和[³⁵S]GTPγS的孔中(最终浓度：20>2,>35S]GTPγS,0-30 uMDAMGO或吗啡, 10 uM调节剂或DMSO，以实现2％DMSO最终浓度，和15 ug膜蛋白/孔（对于C6μ细胞膜）或10 ug膜蛋白/孔（对于小鼠脑膜）)。在室温孵育额外5分钟后，将样品使用Brandel细胞收集器快速过滤通过玻璃纤维过滤垫，并且用冰冷的洗涤缓冲液(50>2)清洗5次。将过滤垫干燥，添加闪烁混合液，并且在Wallac>

附图简述

图1

μ-PAM的化学结构和μ-PAM对β-抑制蛋白募集的效应。从高通量β-抑制蛋白募集筛选鉴定了指定为BMS-986121 (A)和BMS-986122 (B)的两种明显μ阿片样物质受体选择性正向变构调节剂(μ-PAM)的化学结构。以不同浓度在激动剂检测模式(用单独的化合物)和在PAM检测模式(在低浓度(~EC₁₀)的正构激动剂存在的情况下的化合物)测定BMS-986121>+>max。在PAM检测模式，将0％活性针对低浓度(~EC₁₀)的正构激动剂(在U2OS-OPRM1细胞中的内吗啡肽-I，和在U2OS-OPRD1中的亮氨酸脑啡肽)进行归一化。100％活性代表对E_max浓度的这些相应激动剂的响应。

图2

μ-PAM BMS-986121和BMS-986122对U2OS-OPRM1细胞中的内吗啡肽-I刺激的β-抑制蛋白募集的效应。BMS-986121 (A)和BMS-986122 (B)两者，在对激动剂内吗啡肽-I的β-抑制蛋白募集响应中产生浓度依赖的向左偏移。在化合物的各浓度对于内吗啡肽-I的计算的EC₅₀值(nM)显示于各图注中。呈现了渐增浓度的PAM化合物存在的情况下内吗啡肽-I的EC₅₀值的向左偏移倍数。数据表示为4次实验的平均值+/->

图3

μ-PAM对CHO-μ细胞中的毛喉素刺激的cAMP积累的抑制的效应。BMS-986121 (A)和BMS-986122 (B)两者均以浓度依赖的方式增加低(~EC₁₀;>10>+>

图4

μ-PAM对来自C6μ细胞和小鼠脑的膜中的μ阿片样物质激动剂刺激的[³⁵S]GTPγS结合和C6μ细胞膜中的DAMGO结合亲和力的效应。C6μ膜中的[³⁵S]GTPγS结合如材料和方法中所述测定。在10>35S]GTPγS结合的EC₅₀向左偏移4倍(A)。BMS-986122使DAMGO效力增加7倍(B)。DAMGO的最大刺激不受BMS-986122或BMS-986121影响。μ-PAM不显著影响基础值(媒介物对照基础>35S]GTPγS结合的EC₅₀向左偏移2.5倍(C)。BMS-986122>3H]二丙诺啡的DAMGO竞争结合研究中，BMS-986122>3H]二丙诺啡结合亲和力没有影响(图S2，表S1)。在10>35S]GTPγS结合的EC₅₀向左偏移4.5倍(F)。基础[³⁵S]GTPγS结合(4.8>+>

图5

β-抑制蛋白募集测定和DAMGO介导的[³⁵S]GTPγS结合中的功能性SAM的表征。(A)>80浓度的BMS-986122>20浓度的内吗啡肽-I>20浓度的单独的内吗啡肽-I的活性。图表显示三次实验的平均值+>80>35S]GTPγS结合的效力增加8倍。SAM>+>50值。(**)代表p>35S]GTPγS结合的浓度响应曲线显示于图S5中。

图S1

内吗啡肽-I对CHO-μ细胞中的1 uM毛喉素刺激的cAMP积累的抑制的效应。内吗啡肽-I诱导毛喉素刺激的cAMP积累降低17倍，EC₅₀为76>+>

图S2

μ-PAM, BMS-986122和SAM, BMS-986123对来自C6μ细胞的膜中的[³H]二丙诺啡饱和结合的效应。BMS-986122>3H]二丙诺啡结合亲和力没有显著影响，但在竞争结合研究中诱导DAMGO的亲和力增加6倍(参见图5C，表S1)。BMS-986123>3H]二丙诺啡亲和力的小的(~2倍)、但显著下降，但对DAMGO亲和力没有显著效果(参见表S1)。数据表示为3-7次实验的平均值+>

图S3

BMS-986122和18类似物在U2OS-OPRD1和U2OS-OPRM1细胞中的β-抑制蛋白募集测定中的活性。在激动剂检测模式(在亮氨酸-脑啡肽不存在的情况下)和PAM检测模式(在~EC₁₀浓度的亮氨酸-脑啡肽存在的情况下)在U2OS-OPRD1细胞中测试化合物。还在激动剂检测模式(在内吗啡肽-I不存在的情况下)和PAM检测模式(在~EC₁₀浓度的内吗啡肽-I存在的情况下)在U2OS-OPRM1细胞中测试化合物。最后，在SAM检测模式(在~EC₂₀浓度的内吗啡肽-I加上~EC₈₀的PAM>50和E_max值表示在表S2中。对于激动剂检测模式，0％和100％活性分别代表正构激动剂的基础活性和Emax浓度。对于PAM检测模式，0％活性代表对低(~EC₁₀)浓度的单独的激动剂的响应，且100％活性代表对E_max浓度的激动剂的响应。对于SAM检测模式，0％抑制代表对低(~EC₂₀)浓度的内吗啡肽-I组合~EC₈₀浓度的μ-PAM>20)浓度的单独的内吗啡肽-I的响应。

图S4

BMS-986123和BMS-986124在U2OS-OPRM1细胞中对~EC₈₀浓度的内吗啡肽-I(拮抗剂/NAM检测模式)的β-抑制蛋白响应的效应。BMS-986123和BMS-986124在U2OS-OPRM1细胞中对内吗啡肽-I(300>+>

图S5

BMS-986124对C6μ细胞膜中的DAMGO-刺激的[³⁵S]GTPγS结合的BMS-986122-介导的PAM活性的效应。在μ-PAM>35S]GTPγS结合效力增加8倍(A)。与50uM>35S]GTPγS结合效力(B)。当与单独的BMS-986122的孵育相比时，BMS-986124>+>50值在结果和讨论部分和图5B中给出。

图S6

SAMs BMS-986123和BMS-986124对来自C6μ细胞的膜中的高于基础活性的DAMGO-刺激的[³⁵S]GTPγS结合的效应。BMS-986123>50为321>50为223>50为222>

图S7

SAMs BMS-986123和BMS-986124对来自C6μ细胞的膜中的吗啡刺激的[³⁵S]GTPγS结合的效应。BMS-986123>35S]GTPγS结合的EC₅₀(110>50。BMS-986123>

图S8

μ-PAM BMS-986121对CHO-μ细胞中的不同正构激动剂介导的毛喉素刺激的cAMP积累的抑制的效应。BMS-986121 (100 uM)产生使用的三种正构配体中每种的激动剂效力的向左偏移((A)内吗啡肽-I = 4倍，(B)吗啡= 6.5倍，和(C)亮氨酸-脑啡肽= 4.5倍))。激动剂在各BMS-986121浓度的EC₅₀值显示于图注中。数据代表3次实验的平均值+>

表S1

μ-PAM, BMS-986122和SAM, BMS-986123对来自C6μ细胞的膜中的[³H]二丙诺啡饱和结合和DAMGO竞争结合的效应。

表S2

在U2OS-OPRM1细胞中的β-抑制蛋白募集测定中在PAM检测模式测试的BMS-986122和类似物的结构活性关系。表现出PAM活性的化合物基于其作为完全、强烈、中等或微弱PAM的效力进行描述。0％活性代表对低(~EC₁₀)浓度的单独的内吗啡肽-I的响应，且100％活性代表对E_max浓度的内吗啡肽-I的响应。在SAM检测模式(在低浓度(~EC₂₀)的内吗啡肽-I存在的情况下的BMS-986122>80)响应的抑制)额外测试没有显示PAM活性的2种化合物，其中显示所述化合物抑制BMS-986122响应(图S3)。从IC₅₀值提供计算的K_b值。对于SAM化合物BMS-986123和BMS-986124的浓度响应曲线显示于图5A中。数据表示为3次实验的平均值。

参考书目