Promethazine在制备抗肝癌和/或结肠癌和/或肺癌产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种Promethazine在制备抗肝癌和/或结肠 癌和/或肺癌产品中的应用。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的最常见也是最严重的一种疾病，研发高效抗肿瘤药物对延 长患者的生存周期至关重要。近年来，随着肿瘤基因组学学和分子药理学的飞速发展， 新型抗肿瘤药物的研发取得了不错的成果，但由于新药研发投入大，周期长等瓶颈无 法克服，以及肿瘤个体遗传变异大等特征，导致许多传统抗肿瘤药物效果不加，新药 价格昂贵，副作用未明。

BarabasiAL等研究者在2011年发表于《NatureReviewsGenetics》的论文中 指出，基于GWAS研究结果和互作组学(interactome)策略开展的分子网络分析有望 揭示复杂疾病新的药物靶点和分子标志物，并最终形成对疾病发病机制和治疗方案全 新的认识。更值得注意的是，药物重定位(drugrepositioning)研究发现，GWAS研 究锁定的易感基因及与其有蛋白-蛋白相互作用(protein-proteininteraction,PPI) 的基因更容易成为药物间接的靶点，这一发现有助于解释现有药物的作用机制并指导 新药的研发。2014年，OkadaY等研究者在《Nature》上发表的论文中显示GWAS研究 结果整合分析得到的类风湿性关节炎的101个易感基因中有98个目前正用于治疗类风 湿性关节炎药物的直接或间接靶标，而且还通过药物重定位研究，他们还发现了数十 个已获批准用于其他适应症的药物也可用于治疗类风湿性关节炎。

发明内容

本研究正是通过整合癌症组学Cosmicversion72数据库的癌症基因谱Cancer GeneCensus以及蛋白质相互作用STRINGversion10数据库和DrugBankversion4.2中 FDA批准的药物数据库，获得的候选重定位药物，对肿瘤细胞系进行筛查实验，筛选 出新的抗肿瘤药物。做肿瘤细胞系筛选的候选肿瘤抑制药物见如下:

Nicardipine,Promethazine,Estrone,Promethazine,Sunlidac,Promethazine,Et onogestrel,Levonorgestrel,Mesalazine,Indomethacin,Sulfasalazine,Balsalazid e,Irbesartan,Ibuprofen,Isoprenaline,PentosanPolysulfate。

本发明的一个目的是提供Promethazine的新用途。

本发明提供的Promethazine在制备治疗肝癌和/或结肠癌和/或肺癌产品中的应 用。

本发明的第二个目的是提供Promethazine的新用途。

本发明提供了Promethazine在制备抑制肝癌和/或结肠癌和/或肺癌细胞增殖产 品中的应用。

本发明的第三个目的是提供Promethazine的新用途。

本发明提供了Promethazine在制备降低肝癌和/或结肠癌和/或肺癌细胞IC50值 产品中的应用。

上述应用中，所述肝癌细胞为HUH-7；所述结肠癌细胞为LOVO，所述肺癌细胞为 NCI-H2141。

上述应用中，所述产品为药物或试剂盒。

本发明的第四个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，其活性成分为Promethazine；所述产品具有如下至少一种功 能：

1)治疗肝癌和/或结肠癌和/或肺癌；

2)抑制肝癌和/或结肠癌和/或肺癌细胞增殖；

3)降低肝癌和/或结肠癌和/或肺癌细胞IC50值。

上述产品中，所述肝癌细胞为HUH-7；所述结肠癌细胞为LOVO，所述肺癌细胞为 NCI-H2141。

上述产品中，所述产品为药物或试剂盒。

本发明的实验证明，本发明对FDA,CFDA已获批准的药物Promethazine进行肿瘤 药物重定位，根据肿瘤不同的细胞系(组织类型)以及突变位点对适应症不是抗肿瘤 的药物进行筛选，发现Promethazine抗肝癌和/或结肠癌和/或肺癌这种新用途，实现 旧药新用。

附图说明

图1为96孔培养板药筛药物板型分布。

图2为Promethazine对肝癌敏感；EC50＝41.9877；IC50＝31.3712；R²＝0.9988。

图3为Promethazine对结肠癌敏感；EC50＝18863738.7272；IC50＝33.4520；R²＝0.9164。

图4为Promethazine对肺癌敏感；EC50＝33.9362；IC50＝34.6324；R²＝0.9670。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中待测药物为Promethazine，其化学结构式如下:

其为drugbank产品，产品目录号为DB01069。

下面实施例中的肝癌细胞HUH-7和结肠癌细胞LOVO、人卵巢癌细胞SKOV-3和大 细胞肺癌细胞NCI-H661、肺癌细胞NCI-H2141的出处如下：

下面实施例中的主要的仪器及耗材

DMSO(fromSigma,Cat.No.D4540)

96-well白色底透细胞培养板(fromCorning,Cat.No.3610)

CellTiterGlo试剂盒(fromPromega,Cat.No.G7573)

Doxorubicin阳性药(fromMCE,Cat.No.HY-15142)

FetalBovineSerum(fromGibco,Cat#10099141)

100mm培养皿(fromCorning,Cat#430167)

RPMI-1640medium(fromGibco,Cat#A1049101)

DMEMmedium(fromGibco,Cat#11995081)

DMEM/F12medium(fromGibco,Cat#11330057)

EMEMmedium(fromGibco,Cat#10370021)

Mutidrop384细胞分液器(Thermo,Cat#5840150)

EnSpire多功能读板机(PerkinElmer,Cat#2300-001M)

实施例1、CELLTITER-GLO检测Promethazine抗肝癌和/或结肠癌

一、待测孔板的制备

1、细胞铺板

a)配制各个细胞所需完全培养基。

b)实验开始前，确认标记在100mm培养皿上的药筛细胞名字，培养基以及传代 时间，代次等信息，确保实验无误。

c)贴壁细胞操作参考步骤d)到i),悬浮细胞操作参考步骤j)到l)。

d)无菌操作时利用真空泵吸取细胞培养基。

e)用2ml的无菌PBS溶液润洗细胞表层，再用真空泵吸出PBS废液。

f)向培养皿轻轻加入1ml0.25％(w/v)Trypsin-0.038％(w/v)EDTA溶液消化 细胞，轻轻混匀几下，溶液覆盖住细胞表层，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，在 细胞将要脱落时终止胰酶消化作用。

g)向培养皿中加入5ml37℃预热好的完全培养基，用移液管轻轻吹打细胞， 使其从培养皿底部脱落下来。

h)将此细胞悬液转移到15ml或50ml无菌离心管中，1000rpm离心5min。

i)利用真空泵无菌操作吸出上清培养基。加入5ml37℃预热好的完全培养基重 悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀。

j)用移液管轻轻吹打细胞，使其从培养皿底部完全脱落下来。

k)将此细胞悬液转移到15ml或50ml无菌离心管中，1000rpm离心5min。

l)利用真空泵无菌操作吸出上清培养基。加入5ml37℃预热好的完全培养基重 悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀。

m)用细胞计数仪对细胞悬液进行计数，调整细胞悬液至合适密度接板进行细胞铺 板实验。

n)将HUH-7细胞和LOVO细胞按照上述方法进行，分别得到HUH-796孔细胞培养 板和LOVO96孔细胞培养板。

HUH-7细胞，完全培养基为DMEM，为life产品，11995081，接板密度(cells/well) 为6000。

LOVO细胞，完全培养基为DMEM，为life产品，11995081，接板密度(cells/well) 为8000。

2、待测药物Promethazine配制和加药(200X终浓度):

1)待测药物Promethazine母板配制

a)用DMSO将待测药物Promethazine稀释到20mM待用。

b)取a)步骤中配置好的20mM待测药物79μL加入稀释板第一行第一孔中， 随后加入54μL的DMSO溶剂到第一行第二孔至第九孔中，从第一孔中取25μL溶液 到第二孔中，混匀后从第二孔中取25μL溶液到第三孔中，依次类推到第九孔，保证 药物逐次进行3.16倍倍比梯度稀释。

2)阳性药Doxorubicin(MCE,Cat.No.HY-15142)母板配制

a)用DMSO将阳性药Doxorubicin稀释到6mM待用。

b)将6mM阳性药Doxorubicin溶液加入稀释板中，DMSO溶液1:3.16倍倍比梯 度稀释该待测药物。

3、药物工作板配制及加药

a)待测药物及阳性药加样模板如下图1所示，其中，S1208:阳性药Doxorubicin, DMSO:阳性对照孔,Cpd1,2,3:待测药物,DMSO终浓度为0.5％(DMSO兼容性)。

b)向工作板中加入95μl细胞特定的完全培养基，每个药物对应9个孔，用多 道排枪从待测药物和阳性药doxorubicin母板中分别依次转移5μl一系列(9个孔) 倍比稀释好的溶液(10X终浓度)，得到含有不同浓度药物的细胞培养基。

c)从培养箱中取出步骤1制备HUH-796孔细胞培养板和LOVO96孔细胞培养板， 按图1加药板型排列方式(图1)分别向HUH-796孔细胞培养板和LOVO96孔细胞培 养板中加入10μl上述b)制备的含有不同浓度药物的细胞培养基(10X终浓度)， 放入到CO₂培养箱37℃培养72h，得到HUH-7的96孔药筛板和LOVO的96孔药筛板。

以不加任何药物的作为对照孔。

上述待测药物、阳性药Doxorubicin和对照孔在96孔板中的终浓度及加药情况如 下：

待测药物在图1的2-10孔中的终浓度(μM)依次为:100、31.64557、10.01442、 3.16912、1.002886、0.317369、0.100433、0.031783、0.010058；

阳性药Doxorubicin在图1的2-10孔中的终浓度(μM)依次为:30、9.493671、 3.004326、0.950736、0.300866、0.095211、0.03013、0.009535、0.003017；

此外，96孔板中S1208孔(E1-H1和A12-D12):10μl终浓度100μM Doxorubicin溶液(溶剂为包含0.5％DMSO的完全培养基溶液),DMSO孔(A1-D1, E12-H12和A11-H11):10μl包含0.5％DMSO的完全培养基溶液。

二、CELLTITER-GLO荧光细胞活性检测系统检测

1、CellTiter-Glo试剂配制

a)使用前，将CellTiter-Glo试剂Buffer融化，平衡到室温使用。

b)使用前，将CellTiter-Glo试剂冻粉底物融化，平衡到室温使用。

c)取100ml平衡好的CellTiter-GloBuffer加入到瓶装CellTiter-Glo试剂 冻粉底物中，使其充分重悬形成酶/底物混合物，也就是所谓的CellTiter-Glo检测试 剂。

d)轻轻混匀涡旋，并反复倒置获得均匀的溶液。一般来说，1分钟内CellTiter-Glo 底物试剂就会充分溶解，分装，避光保存在-20℃备用，避免反复冻融。

2、检测

a)检测前，将上述一的3得到的HUH-7的96孔药筛板和LOVO的96孔药筛板在 室温中平衡20-30分钟。

b)倒置显微镜观察每块培养板的细胞形态及死亡情况，标记出异常情况并复测一 次。

c)向所有药筛孔中加入100μl上述1制备的CellTiter-Glo试剂，混匀。

d)在96孔微孔板振荡器上充分震荡混匀2分钟，使细胞完全裂解。

e)避光室温放置15分钟后进行冷光信号检测，保证信号的稳定性。

f)使用EnSpire多功能读板机570nm时读取冷光信号。

g)分析处理数据。

HUH-7的96孔药筛板结果如图2所示。

LOVO的96孔药筛板结果如图3所示。

计算IC50值，结果如表1所示。

采用同样的方法检测Promethazine作用人卵巢癌细胞SKOV-3和大细胞肺癌细胞 NCI-H661，细胞的IC50值，结果如表1。

采用同样的方法检测Promethazine作用肺癌细胞，细胞的IC50值，结果如表1 和图4。

NCI-H2141细胞，完全培养基为HITES(DMEM:F12Medium)，为life产品，11330057， 接板密度(cells/well)为16000。

可以看出，Promethazine对肝癌和/或结肠癌和/或肺癌细胞增殖具有特异抑制作 用，可以用来作为治疗肝癌和/或结肠癌和/或肺癌的药物。

表1为不同细胞在Promethazine药物作用下的IC50值