t10,c12-共轭亚油酸工程菌株及其重组表达质粒与构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是t10,c12-共轭亚油酸工程菌株及其重组表达质粒与构建方法和应用。

背景技术

共轭亚油酸(conjugatedlinoleicacid，CLA)是由必需脂肪酸-亚油酸(linoleicacid，LA)衍生的共轭双烯酸的多种位置和几何异构体的总称，具有抗癌、降脂、调节免疫、抗粥样硬化等重要的生理功能，是近几年发展起来的一种新型的的食品功能性油脂，其中，t10,c12-CLA是最具生理活性的异构体之一。自1987年美国威斯康辛营养研究所的Ha等在研究烤牛肉过程中诱变剂的形成时发现共轭亚油酸具有抗癌特性后，引起了人们的极大关注，目前CLA已广泛应用于药品、保健品、功能食品和食品防腐剂等领域。

天然CLA主要存在于牛奶、羊奶、牛肉等瘤胃动物来源的食品中，但含量很少。随着人们对健康饮食的重视，CLA的需求不断增加，高纯度CLA的大量生产势在必行。目前，工业生产上利用化学异构法制备可食用的达到营养要求的共轭亚油酸产品很困难，且成本高、价格昂贵，而利用生物技术方法(即亚油酸异构酶转化法)生产CLA产品，可以很好的解决化学法生产中的问题，具有转化率高、发酵周期短、产品安全稳定等优点。亚油酸异构酶(Conjugatedlinoleicacidisomerase，EC5.2.1.5)是能特异的催化亚油酸转化为CLA的一类酶，该酶主要存在于一些能合成CLA的微生物细胞中，近年来大量工作围绕亚油酸异构酶克隆表达展开，特别是疮疱丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)中亚油酸异构酶基因(pai)因其可溶性和高催化活性成为异源表达的首选。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种t10,c12-共轭亚油酸工程菌株所含的重组表达质粒。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述t10,c12-共轭亚油酸工程菌株。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述t10,c12-共轭亚油酸工程菌株的构建方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述t10,c12-共轭亚油酸工程菌株的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种t10,c12-共轭亚油酸工程菌株所含的重组表达质粒，为含有亚油酸异构酶基因pai的重组表达质粒，该亚油酸异构酶基因pai插入载体pFGL59-PgpdA-Ttrpc中，即所述重组表达质粒包括启动子PgpdA、亚油酸异构酶基因pai和终止子Ttrpc的真菌表达载体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc，所述启动子PgpdA的序列为序列表<400>1所示序列，所述亚油酸异构酶基因pai的序列为序列表<400>3所示序列，所述终止子Ttrpc的序列为序列表<400>2所示序列，所述pFGL59的序列为序列表<400>4所示序列。

一种t10,c12-共轭亚油酸工程菌株，含有上述重组表达质粒，所述工程菌的宿主菌为拉曼被孢霉，所述拉曼被孢霉的保藏号为GIM3.244(购买自广东微生物菌种保藏中心)，该工程菌株为M.ramanniana-pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc，其保藏号为CGMCCNO.10761。

上述t10,c12-共轭亚油酸工程菌株的构建方法，具体步骤为：将构建含有启动子PgpdA、基因pai和终止子Ttrpc的真菌表达载体pFGL59-PgpdA-Ttrpc先电转化进农杆菌(农杆菌编号为AGL-1)，再通过所述农杆菌的介导转化，利用拉曼被孢霉工程菌株孢子在含有潮霉素的PDA平板上筛选转化子，潮霉素终浓度500ug/ml，通过PCR方法来验证表达载体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc是否成功插入到拉曼被孢霉基因组中。

优选的，上述t10,c12-共轭亚油酸工程菌株的构建方法，所述农杆菌的介导转化方法为：共培养温度为28℃，共培养72h，拉曼被孢霉孢子浓度为1×10⁷/μL，农杆菌培养诱导后菌体的OD₆₀₀为0.8，且拉曼被孢霉与农杆菌的孢子数比为2:1。

优选的，上述t10,c12-共轭亚油酸工程菌株的构建方法，所述拉曼被孢霉工程菌株孢子接种到PDA平板上的方法为：28℃黑暗培养4-5d，将孢子洗下后将孢子浓度调整到1×10⁸/μL并接种到种子培养基，28℃、200rpm培养24h，按10％接种量接种到发酵培养基中28℃、200rpm发酵培养5d。

优选的，上述t10,c12-共轭亚油酸工程菌株的构建方法，所述种子培养基按g/L计为：葡萄糖30，酵母膏6，KH₂PO₄2，MgSO₄·7H₂00.5，NaNO₃2，PH＝6.0，121℃灭菌20min。

优选的，上述t10,c12-共轭亚油酸工程菌株的构建方法，所述发酵培养基按g/L计为：葡萄糖50，酵母浸出物10，KH₂PO₄2，MgSO₄·7H₂01，PH＝6.0，121℃灭菌20min，其中葡萄糖配制50％，115℃灭菌20min，发酵培养条件：发酵培养基中28℃、200rpm发酵培养5d。

上述t10,c12-共轭亚油酸工程菌株在生产t10,c12-共轭亚油酸方面的应用。

优选的，上述t10,c12-共轭亚油酸工程菌株的应用，具体为：直接利用拉曼被孢霉内源底物亚油酸作为催化底物，一步法合成t10,c12-共轭亚油酸，降低生产成本。

本发明的有益效果是：

1、本发明将来源于痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)的亚油酸异构酶基因pai插入载体pFGL59-PgpdA-Ttrpc中，构建了表达载体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc，并将它导入拉曼被孢霉GIM3.244中，获得含有表达载体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc的拉曼被孢霉工程菌株M.ramanniana-pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc，该工程菌株经发酵培养后，通过气相色谱在菌丝体中能检测到单一活性异构体t10,c12-CLA。

2、本发明首次建立和优化了产油霉菌拉曼被孢霉的遗传转化系统并在其中异源表达了亚油酸异构酶，使得对拉曼被孢霉进行遗传改造成为可能，丰富了被孢霉属的遗传工具。

3、本发明能产生单一异构体t10,c12-CLA，无论对于将来CLA用于临床药物试验还是膳食添加不同CLA异构体的合理配比，单一异构体的大量合成为共轭亚油酸在医学和营养学上功能的应用奠定了重要基础。

4、本发明中使用的产油霉菌-拉曼被孢霉(Mortierelaramanniana)能产生多种不饱和脂肪酸，在以葡萄糖为主要碳源的培养基中，发酵产生的油脂含量占菌体干重的39.547％，其中亚油酸的含量为3.25g/L(图5，具体测量方法见实施例3)，是工业化生产微生物油脂的最适宜的出发菌株。采用基因过表达及基因整合技术，通过农杆菌介导途径，将来源于痤疮丙酸杆菌中的亚油酸异构酶基因导入到亚油酸的优质产生菌拉曼被孢霉中，使其在真菌特有的组成型启动子的控制下高效表达，一步法催化合成CLA，提高LA到CLA的转化效率，能进一步降低CLA生产成本，对微生物发酵法合成CLA具有很大的推动作用。

附图说明

图1为本发明真菌整合型表达载体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc的结构示意图:亚油酸异构酶编码基因pai在强启动子PgpdA的作用下高效表达。

图2为本发明将真菌表达载体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc转入M.ramanniana的得到的转化子：筛选平板长出的转化子与共培养所用孢子数的比例即转化率为3*10^-5。

图3为本发明拉曼被孢霉遗传转化体系的优化，其中，图3-1至图3-3为三个主要影响因素包括共培养温度、共培养时间及拉曼被孢霉孢子与农杆菌的比例。结果表明：共培养温度为28℃，最优共培养时间72h，拉曼被孢霉孢子浓度为1×10⁷，农杆菌培养诱导后菌体的OD₆₀₀为0.8，且二者混合比例2:1是最优混合比例。

图4为本发明真菌整合型表达载体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc转化拉曼被孢霉的转化子PCR验证电泳图：随机挑取的10个转化子全部能扩增出大小为1275bp的特异条带(其中1号转化子条带较弱)，结果表明均为阳性转化子。

图5为本发明重组工程菌株M.ramanniana-pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc发酵产物的气相色谱图：结果表明与野生株相比，重组菌株能成功合成t10,c12-CLA单一活性异构体。

图6为气相色谱检测到的重组菌株发酵产物中t10,c12-CLA的质谱图：进一步确定了气相图中与标品出峰时间一致的峰为t10,c12-CLA。

保藏信息

分类名词：拉曼被孢霉(Mortiereleramenniana)

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年4月23日

保藏号：CGMCCNO.10761

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。

实施例中

一、构建含有启动子PgpdA、基因pai和终止子Ttrpc真菌表达载体pFGL59-PgpdA-Ttrpc；

二、构建含有真菌表达载体pFGL59-PgpdA-Ttrpc拉曼被孢霉工程菌株，拉曼被孢霉的保藏号为：GIM3.244，本发明实用的拉曼被孢霉不仅限于该菌株，所有拉曼被孢霉均能够实现本发明；

三、含有真菌表达载体pFGL59-PgpdA-Ttrpc拉曼被孢霉工程菌株表达异源基因生产t10,c12-CLA，将基因工程菌株孢子接种到发酵培养基，28℃、200rpm震荡培养5-7天，发酵结束后真空抽滤收集菌体，50℃条件下烘干。

具体论述如下：

本发明所述的启动子PgpdA、终止子Ttrpc均来源于构巢曲霉(Aspergilusnidulans)，其核苷酸序列分别如序列表<400>1、序列表<400>2所示，所述的天然亚油酸异构酶基因(pai)来源于痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)，菌株保藏编号为ATCC6919，该基因的GenBank号为AX062088.1，其核苷酸序列如序列表<400>3所示。所述的表达质粒为依次将PgpdA基因、PAI基因、Ttrpc基因插入到pFGL59中，该pFGL59的序列为序列表<400>4所示序列，构建真菌表达载体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc，并通过农杆菌介导的方法将其转到拉曼被孢霉M.ramannianaGIM3.244获得基因工程菌M.ramanniana-pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc。

该菌株经发酵后菌体内能积累t10,c12-CLA。

拉曼被孢霉M.ramanniana-pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc发酵积累t10,c12-CLA的方法是：将M.ramanniana-pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc在PDA平板上培养5天后的孢子浓度调整到1×10⁸(/μL)接种到种子培养基(种子培养基按g/L计为：葡萄糖30，酵母膏6，KH₂PO₄2，MgSO₄·7H₂00.5，NaNO₃2，PH＝6.0，121℃灭菌20min)培养24h后按10％的接种量转接到发酵培养基(发酵培养基按g/L计为：葡萄糖50，酵母浸出物10，KH₂PO₄2，MgSO₄·7H₂01，PH＝6.0，121℃灭菌20min，其中葡萄糖配制50％，115℃灭菌20min，发酵培养条件：发酵培养基中28℃、200rpm发酵培养5d)中，发酵培育5-7d后收集菌体。所述的培养条件是28℃、200rpm。

具体的M.ramanniana-pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc构建过程如下：

实施例1

一、表达载体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc的构建

1、启动子PgpdA的获得

以构巢曲霉(Aspergilusnidulans)基因组为模板，利用表1的引物扩增启动子PgpdA。

PCR扩增体系为：2×PCRBuffer(含Mg²⁺)10μl，dNTP(2.5mM)2μl，上游引物PgpdA-F和下游引物PgpdA-R(10μM)各1μl，模板(构巢曲霉全基因组DNA)1μl，KODFxDNA(购自TOYOBO公司，货号KFX-101)聚合酶0.5μl，加无菌水至终体积为20μl。

PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性15s，58℃退火30s，68℃延伸60s，反应35个循环，68℃后延伸10min。

PCR结束后获得完整的目的片段核苷酸序列，其序列见序列表<400>1。

表1所用引物序列

将已获得的DNA片段PgpdA用KpnI进行酶切，回收后与同样内切酶处理过的质粒片段pFGL59进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有卡那霉素抗性(100μg/ml)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验证，获得表达载体pFGL59-PgpdA。

2、终止子Ttrpc的获得

以构巢曲霉(Aspergilusnidulans)基因组为模板，利用表2的引物扩增终止子Ttrpc。

PCR扩增体系为：2×PCRBuffer(含Mg²⁺)10μl，dNTP(2.5mM)2μl，上游引物Ttrpc-F和下游引物Ttrpc-R(10μM)各1μl，模板(构巢曲霉全基因组DNA)1μl，KODFxDNA(购自TOYOBO公司，货号KFX-101)聚合酶0.5μl，加无菌水至终体积为20μl。

PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性15s，58℃退火30s，68℃延伸50s，反应35个循环，68℃后延伸10min。

PCR结束后获得完整的目的片段核苷酸序列，其序列见序列表<400>2。

表2所用引物序列

将已获得的目的基因Ttrpc用EcoRI和BamHI进行双酶切，回收后与同样内切酶处理过的质粒片段pFGL59-PgpdA进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有卡那霉素抗性(100μg/ml)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验证，获得表达载体pFGL59-PgpdA-Ttrpc。

3、亚油酸异构酶基因pai的获得

本发明以痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)的基因组为模板，利用表3中的引物进行PCR扩增。

PCR反应体系为：2×PCRBuffer(含Mg²⁺)10μl，dNTP(25mM)5μl，上游引物PAI-F和下游引物PAI-His6-R(10μM)各1μl，模板1μl，KODFxDNA聚合酶(购自TOYOBO公司，货号KFX-101)0.5μl，加无菌水至终体积为20μl。

PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸90s，反应35个循环，68℃再延伸10min。

PCR结束后获得的亚油酸异构酶基因pai核苷酸序列，其序列见序列表<400>3。

表3所用引物序列

将已获得的目的基因pai用SpeI进行单酶切，回收后去磷酸化与经SpeI单酶切处理过的质粒片段pFGL59-PgpdA-Ttrpc进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有卡那霉素抗性(100μg/ml)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验证，获得表达载体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc(图1)。

实施例2

二、含有表达载体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc拉曼被孢霉工程菌株的构建

1、将重组质粒pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc纯化后先电转化进农杆菌，再通过农杆菌的介导转化如拉曼被孢霉，并整合到基因组上。转化过程如下：

农杆菌的电转化

⑴取1.5μL重组质粒，加入到70μL农杆菌感受态细胞中，混合均匀，转入预冷的电转杯中，置于冰上。

⑵将电转杯放入Bio-rad电转仪中，电击后，取出电转杯迅速加入900μL预冷的LB液体培养基，充分混匀，吸出菌液转移至无菌的EP管中，于28℃，200r/min活化培养4h，吸取100μL菌液，涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB平板，28℃培养2d。

⑶待LB筛选平板上的转化子菌落长到1-2mm时，用枪头从上述平板上随机粘取若干个转化子作为菌落PCR模板，分别以PAI-F和PAI-His6-R引物进行PCR扩增验证。阳性对照以质粒pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc为模板。

农杆菌介导的拉曼被孢霉的转化

1.霉菌孢子的制备

⑴用接菌环挑取PDA斜面上的霉菌点接于PDA平板上，28℃培养4-5d。

⑵在PDA平板上加入5mL无菌生理盐水，用涂布器缓慢摩擦菌丝体表面，收集拉曼被孢霉孢子。

⑶用无菌Miracloth滤布过滤孢子悬液，将过滤后的孢子悬液分装于无菌的EP管中。

⑷用血球计数板计算孢子的浓度，调整拉曼被孢霉孢子浓度至终浓度为1-2×10⁷/mL。

2.农杆菌的准备

⑴挑取农杆菌单菌落接种于3mL含有100μg/mLKana的LB液体培养中，28℃，200r/min振荡过夜培养，约20h。

⑵取2mL的过夜培养的菌液于无菌EP管中，4000r/min离心10min，弃掉上清液后加入IM液体培养基清洗菌体，重悬菌体，4000r/min离心5min后弃掉上清液。再1mL的IM液体培养基重悬菌体移至无菌的试管中，加入4mL的IM液体培养基，于28℃、100r/min，活化培养5h。

⑶在600nm下测定培养液的OD值，调整OD值约为0.8，此时农杆菌细胞浓度为4～5×10⁸个/mL。

3.拉曼被孢霉与农杆菌的共培养

⑴用无菌镊子将0.45μM的微孔滤膜放置于含有AS和Kana的IM平板上，尽量避免产生气泡。

⑵将100μl诱导的OD₆₀₀值约0.8的农杆菌和100μL浓度为1×10^7/mL的拉曼被孢霉孢子悬液混合均匀。

⑶将农杆菌与拉曼被孢霉孢子的混合液缓慢滴加到铺有滤膜的IM平板上，菌液尽量集中滴加到滤纸中央。

⑷待风干后，将平板于25℃培养箱中培养2-3d。

(5)每个平板约长出100-300个转化子(图2)，为了得到更多的转化子，后期又对共培养温度、共培养时间及霉菌孢子与农杆菌的比例进行了优化(图3)。

4.转化子的筛选

⑴用无菌镊子将附着菌体的微孔滤膜转移到无菌平板中，加入1mL生理盐水，用涂布器缓慢摩擦微孔滤膜，将菌体洗涤下来。

⑵将菌液转移至含有100μg/mL氨苄霉素、100μg/mL链霉素、200μmol/L头孢噻肟钠、800μg/mL潮霉素的PDA平板上。

⑶将平板置于28℃下，培养2-3d，直到菌落出现。

⑷将上述转化子转接到液体培养基中28℃、200rpm培养2-3d，直到有足够的菌丝体长出。

⑸用纱布过滤菌丝体，并用蒸馏水清洗两遍，用液氮研磨法将菌丝体研磨成粉末状，将得到的粉末加到2mL离心管中。基因组的提取使用基因组提取试剂盒。

5.转化子的验证

以提取转化子的基因组为模板，野生型菌株的基因组为阴性对照，质粒pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc为阳性对照进行PCR验证。

PCR反应体系为：10×PCRBuffer2μl，dNTP(10mM)0.4μl，上游引物PAI-F和下游引物PAI-His6-R(10μM)各0.4μl，模板1μl，TaqDNA聚合酶(购自Fermentas公司,货号EP0405)0.4μl，加无菌水至终体积为20μl。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，96℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，反应35个循环，72℃再延伸10min。

结果如图4所示，与阴性对照菌株相比，拉曼被孢霉转化子菌株能够扩增出1275bp的条带，说明表达载体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc已经成功插入到拉曼被孢霉基因组中。

培养基及相关溶液配方：

诱导培养基IM：

其中Kbuffer、MNbuffer和IMtrace分别为：

Kbuffer

K₂HPO₄1.25M

KH₂PO₄1.25M

将1.25mol/LK₂HPO₄加入到1.25mol/LKH₂PO₄，调pH为4.8；121℃灭菌20min；

MNbuffer

Mg₂SO₄·7H₂O3％

NaCl1.5％

121℃灭菌20min；

IMtrace

121℃灭菌20min；

1％CaCl₂：称取1gCaCl₂，加水至100mL，121℃灭菌20min；

50％甘油：加50mLglycerol至50mL水中，121℃灭菌20min；

20％NH₄NO₃：称取20gNH₄NO₃溶于蒸馏水中并定容至100mL，121℃灭菌20min；

20％葡萄糖：称取20g葡萄糖溶于蒸馏水中定容至100mL，115℃灭菌20min；

0.01％FeSO₄：称取0.1gFeSO₄至1L水中，过滤除菌；

1mol/LMES：称取195.24gMES，加水至1L；用NaOH调节pH至5.5；过滤除菌；4℃保存。

实施例3

三含有表达载体拉曼被孢霉发酵产物的分析

将拉曼被孢霉转化子和野生型菌株接种到PDA平板上，28℃黑暗培养4-5d，将孢子洗下后将孢子浓度调整到1-2×10⁸(/μl)接种到种子培养基，28℃、200rpm培养24h，按10％接种量接种到发酵培养基中28℃、200rpm发酵培养5d。发酵结束后真空抽滤收集菌体，将菌体于50℃烘干至恒重。

培养基配方如下：

种子培养基：葡萄糖30g，酵母膏6g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂00.5g，NaNO₃2g，

PH＝6.0，121℃灭菌20min。

发酵培养基：葡萄糖50g，酵母浸出物10g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂01g，PH＝6.0，

121℃灭菌20min。其中葡萄糖配制50％，115℃灭菌20min。

样品处理方法如下：

取干菌体0.1g，进行油脂的提取

⑴加入2mL浓HCl剧烈振荡重悬菌体，并将湿菌体转入具塞试管中，剧烈振荡1min。

⑵70℃消化1～1.5h，直至菌体完全溶解(可每隔15min剧烈振荡混匀1次)。

⑶加入1.5mL10％盐酸甲醇溶液，剧烈振荡1min。

⑷62℃酯化2h，冷却后加入3mL正己烷，剧烈振荡1min。

⑸4℃、6000r/min离心5min。

⑹吸取上层用0.22有机滤膜过滤到样品瓶中。

⑺立即用气相色谱仪对脂肪酸甲酯进行分析。

气相色谱条件：

用气相色谱仪配以氢火焰离子检测器FID和气相色谱柱(TR-WasMS，30m×0.25mm×0.25μm)，载气为氮气，燃气为氢气。柱前压为14.543Pa，柱流速1mL/min，分流比50:1。升温程序为：初始温度120℃保持5min，以10℃/min升温到200℃，保持5min，再以3℃/min升温到230℃，保持10min，总时间为38min。进样口温度为250℃，检测器温度为260℃。进样量1μl。

结果如图5所示，B和C是两个不同转化子的气相色谱图与A野生型相比，多出一个色谱峰，发酵液中的含量为0.64mg/L，此峰的保留时间与t10,c12-CLA相一致。质谱结果进一步确认所得峰为t10,c12-CLA(图6)，说明亚油酸异构酶在拉曼被孢霉中成功得到表达并具有催化活性。

可见，最终产物为单一异构体，相对于多异构体难分离的情况，单一异构体可以简化工艺，且不需额外添加底物，降低成本。

上述参照实施例对该t10,c12-共轭亚油酸工程菌株及其重组表达质粒与构建方法和应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。