一种分步酶解发病异育银鲫制备不同分子量段抗氧化肽粉的方法

技术领域

本发明属于酶解制备抗氧化肽领域，特别涉及一种分步酶解发病异育银鲫制备不同分子量段抗氧化肽粉的方法。

背景技术

自由基可以造成机体的多种损伤及病变，加速机体的衰老；抗氧化剂可以清除体内多余的自由基，增加机体免疫力，延缓衰老，从而实现机体的自我保护。将蛋白质通过酶解制备成抗氧化活性肽是目前食品及药品科学界的研究热点，抗氧化肽具有清除机体内自由基，减轻机体所受氧化损伤及抗衰老的作用。国内外的科学工作者以各种动植物蛋白质为原料，通过酶解法制备抗氧化肽多有报道。

然而另一方面，由于开发技术的局限和人为的忽略，导致我国有很多优质的蛋白质资源没有得到很好地综合开发利用，而遭到浪费，并造成严重的环境污染。比如近年来由于鳃出血病的影响，江苏沿海养殖的异育银鲫出现大量的死亡，只2014年全年损失接近10亿元人民币，而死亡的鱼富含丰富的蛋白质资源，经过特殊处理后，再经过特定蛋白酶的酶解，可以制成抗氧化肽粉再生利用，并创造一定的经济效益。但沿海当地对于鳃出血死亡的病鱼多采取粗犷的处理方法，比如，掩埋或焚烧；这不仅造成蛋白质资源的大量浪费，而且造成环境的污染，影响当地的生态环境。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种分步酶解发病异育银鲫制备不同分子量段抗氧化肽粉的方法，该方法利用发病异育银鲫制备具有高活性的抗氧化肽粉，不仅可以解决发病异育银鲫蛋白质资源浪费及环境污染问题，而且可以变废为宝减少养殖户的损失，具有良好的应用前景。

本发明的一种分步酶解发病异育银鲫制备不同分子量段抗氧化肽粉的方法，包括：

(1)将发病异育银鲫去鱼头、鱼鳞、鱼皮及内脏，并将剩余的鱼身部分切段；将得到的鱼段在室温下于紫外灯下照射20-30min，以初步灭活病毒及细菌；

(2)将初步灭活病毒及细菌的鱼段按质量体积比1:20～30置于正丁醇中，于4～8℃下不断搅拌对鱼段进行脱脂24～32h，冲洗干净，最后用纯水浸泡；

(3)按质量体积比1g:3～5ml向鱼段中加入水，调节pH至7.0～8.0，并按鱼段质量的1～2％加入风味蛋白酶，加热至40～60℃，在搅拌的条件下酶解1-2h；随后调节酶解液pH至6.5～7.0，并按鱼段质量的0.5～1％加入菠萝蛋白酶，加热至45～50℃，在搅拌的条件下酶解1-2h；

(4)酶解完毕后于沸水浴中煮15-20min灭活蛋白酶及进一步灭活病毒和细菌，离心，收集上清液；

(5)于冰水浴条件下向步骤(4)的上清液中缓慢加入研磨细碎的硫酸铵至饱和度为85～88％，搅拌待硫酸铵溶解完全后，置于4～6℃过夜盐析；

(6)盐析后离心，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液复溶，得到复溶液；按体积向复溶液中加入0.5～1％的活性炭，于35～40℃下搅拌脱腥，离心，收集上清液；

(7)用截留分子量不同的超滤板于4～6℃下将步骤(5)的上清液分成#>10kDa、10kDa>#>5kDa、5kDa>#>3kDa和#>3kDa四段；将各段上清液于4～6℃透析脱盐，旋蒸浓缩，最后冷冻干燥制得不同分子量段抗氧化肽粉。

所述步骤(1)中的鱼身部分切成2-3cm段。

所述步骤(2)中的正丁醇浓度为10％。

所述步骤(2)中的脱脂每8h更换一次液体。

所述步骤(4)中的离心具体为：于4℃10000r/min条件下离心20min。

所述步骤(6)中的盐析后离心具体为：于4℃8000r/min条件下离心10min；脱腥后离心具体为：于室温5000r/min条件下离心10min。

所述步骤(6)中的磷酸盐缓冲液pH7.0，含0.15M氯化钠。

所述步骤(7)中的透析脱盐每12h更换一次透析液。

所述步骤(7)中的旋蒸浓缩温度为50℃。

本发明以发病异育银鲫为原料，以DPPH自由基清除率为抗氧化活性评价指标的不同分子量段抗氧化肽粉的制备。

有益效果

本发明利用发病异育银鲫制备具有高活性的抗氧化肽粉，不仅可以解决发病异育银鲫蛋白质资源浪费及环境污染问题，而且可以变废为宝减少养殖户的损失，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1的技术路线图；

图2为各酶酶解液的DPPH清除率；

图3为不同硫酸铵的饱和度盐析效果；

图4为1.0mg/mL不同分子量段抗氧化肽粉的DPPH清除效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)将10条发病异育银鲫去鱼头、鱼鳞、鱼皮及内脏，并将剩余的鱼身部分切成2-3cm段；

(2)将切段的鱼身在室温(25℃左右)下于紫外灯下照射20min，以初步灭活病毒及细菌；

(3)将初步灭活病毒及细菌的鱼段按质量体积比1:20置于10％正丁醇中，于4℃下不断搅拌对鱼段进行脱脂24h，期间每8h更换一次液体，再用自来水冲洗干净，最后用纯水浸泡一次；

(4)按质量体积比1g:3ml向鱼段中加入水，调节pH至7.0(酶解期间不断调整，保证pH值在此范围内)，并按鱼段质量的1％加入风味蛋白酶，加热至50℃，在搅拌的条件下酶解1h；

(5)将(4)中酶解液调节pH至6.5(酶解期间不断调整，保证pH值在此范围内)，并按鱼段质量的0.5％加入菠萝蛋白酶，加热至45℃，在搅拌的条件下酶解1h；

(6)将酶解液置于沸水浴中15min，以灭酶及进一步灭活病毒和细菌；

(7)于4℃10000r/min条件下离心20min，收集上清液；

(8)于冰水浴条件下向(7)上清液中缓慢加入事先研磨至细碎的硫酸铵粉末至饱和度为85％，期间用磁力搅拌器不断搅拌，待硫酸铵溶解完全后，置于4℃过夜盐析；

(9)于4℃8000r/min条件下离心10min，收集沉淀；

(10)用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0，含0.15M氯化钠)复溶(9)中沉淀蛋白质；

(11)按体积，向(10)复溶液中加入0.5％的活性炭，于35℃下，磁力搅拌30min脱腥，于室温5000r/min条件下离心10min，收集上清液；

(12)用截留分子量不同的超滤板于4℃条件下将(11)中的上清液分成#>10kDa，10kDa>#>5kDa、5kDa>#>3kDa和#>3kDa四段；

(13)将各不同分子量段上清液于4℃透析脱盐48h，期间每12h更换一次透析液，再将各段透析液于50℃条件下旋蒸浓缩，最后冷冻干燥制得不同分子量段的抗氧化肽粉。

由图2可以看出在各酶最适条件下，酶解上清液对DPPH清除率强弱顺序为：风味蛋白酶>菠萝蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶>碱性蛋白酶>胃蛋白酶>酸性蛋白酶>中性蛋白酶，所以选择风味蛋白酶和菠萝蛋白酶进行分步酶解。

由图3可以看出，随着硫酸铵饱和度的增加，上清液中的蛋白质浓度逐渐降低即大部分蛋白质被盐析出来，另一方面考虑到硫酸铵的利用率，所以将85％定为硫酸铵盐析的最终饱和度。

经检测，#>10kDa段、10kDa>#>5kDa段、5kDa>#>3kDa段和#>3kDa段抗氧化肽粉的产率分别为20.9％、14.3％、10.1％和7.4％；当各段浓度为1.0mg/mL时，其对应的DPPH清除率分别为43.89％、51.87％、71.03％和92.43％。