检测黄连分子标记多态性的物质在鉴定或辅助鉴定黄连属植物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中检测黄连分子标记多态性的物质在鉴定或辅助鉴定黄 连属植物中的应用。

背景技术

黄连是我国传统医学广泛使用的一种中药材，全世界黄连属(Coptis)植物有16 种，其中我国有6种类，分别为黄连、三角叶黄连、云南黄连、峨嵋黄连、五裂黄连 和五叶黄连。作为多基源的中药材，药典上规定来源黄连、三角叶黄连和云南黄连的 干燥根茎为正品，上述3种黄连的商品名分别为“味连”、“雅连”和“云连”。由于生 长周期较长，价格较高，市场上常见以单叶升麻的根茎和酸模的根伪充黄连使用；此 外，黄连伪品还有定木香、滇豆根、山黄连、岩黄连、箭叶淫羊藿、铁破锣、马尾黄 连和峨嵋黄连等等。黄连真品与伪品的化学成分、功效、主治等有很大差异，因此开 发一种系统全面的黄连真品和伪品的鉴定方法具有重要意义。

目前，黄连真伪品的鉴定大多利用形态和化学手段进行，具有通量低、成本高和 重复性差的缺点。主要方法有组织学鉴定方法、红外鉴定方法、核磁共振氢谱法和高 效液相色谱法等。组织学鉴定方法需要做大量的切片和显微观察，通量低、耗费大量 的人力和物力，同时具有不准确性；红外鉴定方法、核磁共振氢谱法和高效液相色谱 法都需要提取样品的药效成分，同样具有通量低和耗费大的缺点；此外，由于黄连有 效成分受环境因素的影响，不同产地黄连的有效成分含量和比例可能存在极大的差异， 因此这种以测定有效成分为基础的鉴定方法同样具有不可靠性和不准确性。针对于饮 片或粉碎后的黄连药材，上述鉴定方法非常困难，甚至无法鉴定。

DNA分子标记(DNAmolecularmarkers)是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为 基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。

目前还没有一个系统详尽的鉴定黄连属植物的分子标记方法。利用真核生物rDNA 的内部转录间隔区2(internaltranscribedspacer2,ITS2)序列，孙涛等研究了 不同黄连属植物间的进化关系，同时利用黄连属植物间ITS2序列位点的差异作为一个 鉴定黄连真品和伪品的分子标记(孙涛等，2013)。但由于ITS2序列在同一个黄连属 植物间的保守性，导致该序列不能有来区分不同的黄连亚种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定不同的黄连属植物。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述1)或2)或3)的应用：

1)黄连分子标记或所述黄连分子标记的多态性在鉴定或辅助鉴定黄连属植物中的 应用；

2)检测所述黄连分子标记的多态性的物质在鉴定或辅助鉴定黄连属植物中的应用；

3)检测所述黄连分子标记的多态性的物质在制备鉴定或辅助鉴定黄连属植物的产 品中的应用；

所述黄连分子标记，为下述A1-A4：

A1、以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对037A4进行扩增得到的DNA 分子；

所述引物对037A4由与SEQIDNo.1的第430位上游特异结合的单链DNA和与SEQ IDNo.1的第440位下游特异结合的单链DNA组成；

A2、以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对034H11进行扩增得到的DNA 分子；

所述引物对034H11由与SEQIDNo.2的第154位上游特异结合的单链DNA和与 SEQIDNo.2的第368位下游特异结合的单链DNA组成；

A3、以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对006G4进行扩增得到的DNA 分子；

所述引物对006G4由与SEQIDNo.3的第31位上游特异结合的单链DNA和与SEQ IDNo.3的第350位下游特异结合的单链DNA组成；

A4、以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对008H3进行扩增得到的DNA 分子；

所述引物对008H3由与SEQIDNo.4的第120位上游特异结合的单链DNA和与SEQ IDNo.4的第240位下游特异结合的单链DNA组成。

上述应用中，所述SEQIDNo.1的第430位上游可为与SEQIDNo.1第430位对 应的黄连属植物基因组DNA中那位核苷酸的上游；

所述SEQIDNo.1的第440位下游可为与SEQIDNo.1第440位对应的黄连属植 物基因组DNA中那位核苷酸的下游；

所述SEQIDNo.2的第154位上游可为与SEQIDNo.2第154位对应的黄连属植 物基因组DNA中那位核苷酸的上游；

所述SEQIDNo.2的第368位下游可为与SEQIDNo.2第368位对应的黄连属植 物基因组DNA中那位核苷酸的下游；

所述SEQIDNo.3的第31位上游可为与SEQIDNo.3第31位对应的黄连属植物 基因组DNA中那位核苷酸的上游；

所述SEQIDNo.3的第350位下游可为与SEQIDNo.3第350位对应的黄连属植 物基因组DNA中那位核苷酸的下游；

所述SEQIDNo.4的第120位上游可为与SEQIDNo.4第120位对应的黄连属植 物基因组DNA中那位核苷酸的上游；

所述SEQIDNo.4的第240位下游可为与SEQIDNo.4第240位对应的黄连属植 物基因组DNA中那位核苷酸的下游。

上述应用中，所述扩增可为PCR扩增。

上述应用中，所述A1的多态性可为下述A11-A13：

A11为对应于SEQIDNo.1第433-435位所述A1的核苷酸为GTA或TCC，将该分 子标记命名为037A4-1；

A12为对应于SEQIDNo.1的第438-440位所述A1的核苷酸为TCC或GTA，将该 分子标记命名为037A4-2；

A13为对应于SEQIDNo.1的第430-440位间所述A1的同源染色体相比较有或无 核苷酸的替换，将该分子标记命名为037A4-3；

所述A2的多态性可为下述A21-A24：

A21为对应于SEQIDNo.2的第154位所述A2的核苷酸为G或A，将该分子标记 命名为034H11-1；

A22为对应于SEQIDNo.2的第285位和第286位间所述A2有或无核苷酸的插入， 将该分子标记命名为034H11-2；

A23为对应于SEQIDNo.2的第359-360位所述A2的核苷酸为CC或TT，将该分 子标记命名为034H11-3；

A24为对应于SEQIDNo.2的第320-330位间所述A2有或无核苷酸插入和/或删 除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同，将该分子标记命名为034H11-4；

所述A3的多态性可为下述A31-A35：

A31为对应于SEQIDNo.3的第254位所述A3的核苷酸为G或A，将该分子标记 命名为006G4-1；

A32为对应于SEQIDNo.3的第286位所述A3的核苷酸为C或T，将该分子标记 命名为006G4-2；

A33为对应于SEQIDNo.3的第225-245位间所述A3有或无核苷酸插入和/或删 除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同，将该分子标记命名为006G4-3；

A34为对应于SEQIDNo.3的第325-345位间所述A3有或无核苷酸插入和/或删 除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同，将该分子标记命名为006G4-4；

A35为对应于SEQIDNo.3的第31-50位间所述A3有或无核苷酸插入和/或删除， 造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同，将该分子标记命名为006G4-5；

所述A4的多态性可为下述A41-A43：

A41为对应于SEQIDNo.4的第126位所述A4的核苷酸为A或G，将该分子标记 命名为008H3-1；

A42为对应于SEQIDNo.4的第130-150位间所述A4有或无核苷酸插入和/或删 除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同，将该分子标记命名为008H3-2；

A43为对应于SEQIDNo.4的第220-240位间所述A4有或无核苷酸插入和/或删 除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同，将该分子标记命名为008H3-3。

上述应用中，所述引物对037A4可为由SEQIDNo.1的第17-40位所示的单链DNA 和与SEQIDNo.1的第519-538位反向互补的单链DNA组成的引物对；

所述引物对034H11可为由SEQIDNo.2的第15-36位所示的单链DNA和与SEQID No.2的第557-576位反向互补的单链DNA组成的引物对；

所述引物对006G4可为由SEQIDNo.3的第9-30位所示的单链DNA和与SEQID No.3的第776-795位反向互补的单链DNA组成的引物对；

所述引物对008H3可为由SEQIDNo.4的第10-32位所示的单链DNA和与SEQID No.4的第573-595位反向互补的单链DNA组成的引物对。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述黄连分子标记。

为解决上述技术问题，本发明还提供了检测所述黄连分子标记多态性的物质。

本发明所提供的检测所述黄连分子标记多态性的物质，为所述引物对037A4、所 述引物对034H11、所述引物对006G4和/或所述引物对008H3。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定黄连属植物的产品。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定黄连属植物的产品含有检测所述黄连分子标记多 态性的物质。

上述产品中，所述检测黄连分子标记多态性的物质为所述引物对037A4、所述引 物对034H11、所述引物对006G4和/或所述引物对008H3。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述产品在鉴定或辅助鉴定黄连属植物中 的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定黄连属植物的方法。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定黄连属植物的方法，包括如下步骤：分别以黄连、 峨眉黄连、云南黄连、短萼黄连、三角叶黄连和待鉴定黄连属植物的基因组DNA为模 板，采用所述引物对037A4、所述引物对034H11、所述引物对006G4和所述引物对008H3 分别进行PCR扩增，分别得到037A4的PCR扩增产物，034H11的PCR扩增产物，006G4 的PCR扩增产物和008H3的PCR扩增产物，根据这四种PCR扩增产物的序列进行0/1 分型：

若所述037A4的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.1第433-435位为GTA，将所述 037A4-1定义为1，若所述037A4的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.1第433-435位为 TCC，将所述037A4-1定义为0，若所述037A4的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.1第 433-435位的同源染色体比较为GTA与TCC的杂合型，将所述037A4-1定义为0；

若所述037A4的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.1第438-440位为TCC，将所述 037A4-2定义为1，若所述037A4的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.1第438-440位为 GTA，将所述037A4-2定义为0；

若所述037A4的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.1第430-440位的同源染色体比 较无核苷酸的替换，将所述037A4-3定义为1，若所述037A4的PCR扩增产物对应于 SEQIDNo.1第430-440位的同源染色体比较有核苷酸的替换，将所述037A4-3定义 为0；

若所述034H11的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第154位为G，将所述 034H11-1定义为1，若所述034H11的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第154位为 A，将所述034H11-1定义为0；

若所述034H11的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第285位和第286位间无核 苷酸的插入，将所述034H11-2定义为1，若所述034H11的PCR扩增产物对应于SEQID No.2的第285位和第286位间有核苷酸的插入，将所述034H11-2定义为0；

若所述034H11的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第359-360位为CC，将所 述034H11-3定义为1，若所述034H11的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第359-360 位为TT，将所述034H11-3定义为0；

若所述034H11的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第320-330位间无核苷酸插 入和/或删除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度相同，将所述034H11-4定义为1， 若所述034H11的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第320-330位间有核苷酸插入和 /或删除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同，将所述034H11-4定义为0；

若所述006G4的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第254位为G，将所述006G4-1 定义为1，若所述006G4的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第254位为A，将所 述006G4-1定义为0；

若所述006G4的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第286位为C，将所述006G4-2 定义为1，若所述006G4的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第286位为T，将所 述006G4-2定义为0；

若所述006G4的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第31-50位间有核苷酸插入 和/或删除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同，将所述006G4-3、所述006G4-4 和所述006G4-5分别定义为1、1和0；若所述006G4的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3 的第31-50位间无核苷酸插入和/或删除，同源染色体对应核苷酸区段长度相同，将所 述006G4-5定义为1；

在所述006G4-5为1时，若所述006G4的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第 225-245位间有核苷酸插入和/或删除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同，将 所述006G4-3和所述006G4-4分别定义为0、1；若所述006G4的PCR扩增产物对应于 SEQIDNo.3的第225-245位间无核苷酸插入和/或删除，造成同源染色体对应核苷酸 区段长度相同，将所述006G4-3定义为1；

在所述006G4-5为1且在所述006G4-3为1时，若所述006G4的PCR扩增产物对 应于SEQIDNo.3的第325-345位间无核苷酸插入和/或删除，造成同源染色体对应核 苷酸区段长度相同，将所述006G4-4定义为1，若所述006G4的PCR扩增产物对应于 SEQIDNo.3的第325-345位间有核苷酸插入和/或删除，造成同源染色体对应核苷酸 区段长度不同，将所述006G4-4定义为0；

若所述008H3的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第126位为A，将所述008H3-1 定义为1，若所述008H3的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第126位为G，将所述 008H3-1定义为0；

若所述008H3的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第130-150位间无核苷酸插 入和/或删除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度相同，将所述008H3-2定义为1， 若所述008H3的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第130-150位间有核苷酸插入和/ 或删除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同，将所述008H3-2定义为0；

若所述008H3的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第220-240位间无核苷酸插 入和/或删除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度相同，将所述008H3-3定义为1， 若所述008H3的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第220-240位间有核苷酸插入和/ 或删除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同，将所述008H3-3定义为0；

对所述黄连、所述峨眉黄连、所述云南黄连、所述短萼黄连、所述三角叶黄连和 所述待鉴定黄连属植物的0/1分型结果进行聚类分析，所述待鉴定黄连属植物与所述 黄连聚为一类，所述待鉴定黄连属植物为或候选为黄连；所述待鉴定黄连属植物与所 述峨眉黄连聚为一类，所述待鉴定黄连属植物为或候选为峨眉黄连；所述待鉴定黄连 属植物与所述云南黄连聚为一类，所述待鉴定黄连属植物为或候选为云南黄连；所述 待鉴定黄连属植物与所述短萼黄连聚为一类，所述待鉴定黄连属植物为或候选为短萼 黄连；所述待鉴定黄连属植物与所述三角叶黄连聚为一类，所述待鉴定黄连属植物为 或候选为三角叶黄连；所述待鉴定黄连属植物与所述黄连、所述峨眉黄连、所述云南 黄连、所述短萼黄连和所述三角叶黄连均不聚为一类，所述待鉴定黄连属植物不为或 候选不为黄连、峨眉黄连、云南黄连、短萼黄连和三角叶黄连。

进行所述聚类分析的软件可为常用的聚类分析软件，如NTsys-pc2.1。所述聚 类分析可利用UPGMA算法进行。

本发明中，所述黄连属植物为黄连(Coptischinensis)、短萼黄连(Coptis chinensisvar.Brevisepala)、三角叶黄连(Coptisdeltoidea)、云南黄连(Coptis teeta)、峨嵋黄连(Coptisomeiensis)、五裂黄连(CoptisquinquesectaW.T.Wang) 和五叶黄连(CoptisquinquefoliaMiq.)中的至少一种。

实验证明，在黄连属植物中，黄连分子标记037A4的037A4-1、037A4-2和037A4-3 在不同黄连属植物间存在差异；黄连分子标记034H11的034H11-1、034H11-2、 034H11-3和034H11-4在不同黄连属植物间存在差异；黄连分子标记006G4中的 006G4-1、006G4-2、006G4-3、006G4-4和006G4-5在不同黄连属植物间存在差异；黄 连分子标记008H3的008H3-1、008H3-2和008H3-3在不同黄连属植物间存在差异。 对黄连分子标记037A4、034H11、006G4和008H3的各多态性的0/1分型结果进行聚类 分析发现，黄连属植物中相同种聚为一类，黄连属植物中不同种不聚为一类。

在实际应用中，可将检测黄连分子标记多态性的物质与其它物质(如检测其它的 黄连分子标记多态性的物质)联合在一起制备鉴定或辅助鉴定黄连属植物的产品。

其中，检测黄连分子标记多态性的物质可为通过DNA测序确定黄连分子标记多态 性所需的试剂和/或仪器。其中，利用DNA测序确定黄连分子标记多态性所需的试剂和 /或仪器包括PCR引物对、进行PCR反应所需试剂和仪器、进行DNA测序所需试剂和仪 器。

所述产品可为试剂或试剂盒，还可为由试剂或试剂盒与仪器组成的系统，如由引 物、PCR试剂、DNA测序试剂、PCR仪和/或DNA测序仪组成的系统或试剂盒，由包含 引物、PCR试剂、DNA测序试剂、PCR仪和/或DNA测序仪的系统或试剂盒与进行序列 分析所需软件或模块以及DNA测序所需要的其他试剂组成的系统。

本发明的一个实施例中，采用DNA测序确定黄连分子标记多态性。所述PCR引物 对在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括黄连分子标记037A4、034H11、006G4 或008H3在内的基因组DNA片段即可，扩增出包括黄连分子标记037A4在内的基因组 DNA片段的PCR引物对为SEQIDNo.1的第17-40位所示的单链DNA和与SEQIDNo.1 的第519-538位反向互补的单链DNA，扩增出包括黄连分子标记034H11在内的基因组 DNA片段的PCR引物对为SEQIDNo.2的第15-36位所示的单链DNA和与SEQIDNo.2 的第557-576位反向互补的单链DNA，扩增出包括黄连分子标记006G4在内的基因组 DNA片段的PCR引物对为SEQIDNo.3的第9-30位所示的单链DNA和与SEQIDNo.3 的第776-795位反向互补的单链DNA，扩增出包括黄连分子标记008H3在内的基因组 DNA片段的PCR引物对为SEQIDNo.4的第10-32位所示的单链DNA和与SEQIDNo.4 的第56-78位反向互补的单链DNA。

进行PCR反应所需仪器可为MasterCycler(Eppendorf)，进行PCR反应所需试剂 为10×buffer、10mMdNTP和Taq酶。所述10×buffer、所述10mMdNTP和所述 Taq酶均为宝生物工程(大连)有限公司产品。

进行序列分析所需软件可为DNAMAN-v5.2。

本申请中所述分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA 片段。

本发明发现本发明的黄连分子标记037A4、034H11、006G4和008H3在不同的黄连 属植物间具有位点的多态性，这些多态性的位点能够用来区分不同的黄连属植物，同 时进一步还可以用来鉴定黄连属植物的真伪。利用本发明的黄连分子标记037A4、 034H11、006G4和008H3鉴定黄连属植物，可以提高黄连属植物的鉴定效率并可降低 鉴定成本，并具有高效、快速、便捷、高通量、特异性强和不受环境和其他因素影响 的特点，具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1为部分黄连属植物黄连分子标记037A4的测序结果。其中，A为CcJF03的 PCR扩增产物对应于SEQIDNo.1的第421-444位的测序结果，B为CcES08的PCR 扩增产物对应于SEQIDNo.1的第421-444位的测序结果。

图2为部分黄连属植物的黄连分子标记037A4的部分序列比对结果。其中，037A4 表示SEQIDNo.1。

图3为部分黄连属植物黄连分子标记034H11的测序结果。其中，A为CdDY05的 PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第314-339位的测序结果，B为CHS03的PCR扩 增产物对应于SEQIDNo.2的第314-339位的测序结果。

图4为部分黄连属植物的黄连分子标记034H11的部分序列比对结果。其中，034H11 表示SEQIDNo.2。

图5为部分黄连属植物黄连分子标记006G4的测序结果。其中，a1和a3分别为 CcLD04和CHS03的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第222-248位的测序结果，a2 和a4分别为OTZ17和CdSD13的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第222-248位 的测序结果；b1为CcLD04的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第315-341位的测 序结果，b2、b3和b4分别为OTZ17、CHS03和CdSD13的PCR扩增产物对应于SEQID No.3的第315-341位的测序结果；c1、c3和c4分别为CcLD04、CHS03和CdSD13 的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第179-205位的测序结果，c2为OTZ17的PCR 扩增产物对应于SEQIDNo.3的第222-248位的测序结果。

图6为部分黄连属植物的黄连分子标记006G4的部分序列比对结果。其中，006G4 表示SEQIDNo.3。

图7为部分黄连属植物黄连分子标记008H3的测序结果。其中，a3为CdSD13的 PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第123-149位的测序结果，a1和a2分别为CcBX01 和OTZ17的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第123-149位的测序结果；a1和a3 分别为CcBX01和CdSD13的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第215-241位的测序 结果，a2为OTZ17的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第215-241位的测序结果。

图8为不同黄连属植物的黄连分子标记008H3的部分序列比对结果。其中，008H3 表示SEQIDNo.4。

图9为黄连分子标记多态性0/1分型的聚类分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的峨眉黄连(Coptisomeiensis)(魏屹等，HPLC指纹图谱法研究 峨眉黄连与三角叶黄连，华西药学杂志，2012，27(2)∶193～195)公众可从申请人 处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的短萼黄连(Coptischinensisvar.Brevisepala)(张莉等，安 徽短萼黄连种群特性及其濒危机制探讨，应用生态学报，2005年8月第16卷第8 期)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作 为其它用途使用。

下述实施例中的云南黄连(Coptisteeta)、三角叶黄连(Coptisdeltoidea)和 黄连(Coptischinensis)(王立群等，生态技术栽培黄连的红外指纹图谱分析与表征， 光谱学与光谱分析，2006年6月第26卷第6期)公众可从申请人处获得，该生物 材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的10×buffer、10mMdNTP和Taq酶均为宝生物工程(大连)有 限公司产品，货号为R001A(包含10×buffer、10mMdNTP和Taq酶)。

实施例1、黄连分子标记能用来鉴定不同的黄连属植物

1.基因组DNA的PCR扩增

提取表1中各黄连属植物的基因组DNA，利用引物对037A4、引物对006G4、引 物对008H3和引物对034H11分别对每个黄连属植物的基因组DNA进行PCR扩增。

037A4引物对的正向引物为5′-TTTATTCGGCAAGACGTAGTAGTC-3′，反向引物为 5′-AAAAGCACGCACCAGTCACA-3′；

034H11引物对的正向引物为5′-TATTTTCCAACATTGGGACGTG-3′，反向引物为 5′-GGCTGCTGCACTGTCAACTG-3′；

006G4引物对的正向引物为5′-GTCCGTTTGTAAGACAGGTTCC-3′，反向引物为 5′-CTTGTGAAGTGGTCGGGCTA-3′；

008H3引物对的正向引物为5′-CCATGTAAATTGGACAGCGTACT-3′，反向引物为 5′-CACCAAGTTGTCAAAGTTTTCCT-3′。

表1、黄连属植物信息

PCR反应体系均为：10×buffer5μL,10mMdNTP4.5μL,正向引物(10μM)1.25 μL,反向引物(10μM)1.25μL，基因组DNA50ng,Taq酶1μL，然后用去离子 水补至50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s,57℃退火30s, 72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸2min。PCR仪为MasterCycler(Eppendorf)。

将上述PCR扩增的产物分别吸取5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增良好， 条带清晰。将上述PCR扩增的产物送INVITROGEN公司进行测序，并进行序列分析， 进行序列分析所需软件为DNAMAN-v5.2。

2.差异位点的分析

2.1037A4的PCR扩增产物

用037A4引物对的正向引物分别对步骤1的037A4引物对的每个PCR扩增产物 进行测序，部分植物的部分测序结果如图1所示，图1中A为CcJF03的PCR扩增 产物对应于SEQIDNo.1的第421-444位的测序结果，测序结果有双峰；图1中B为 CcES08的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.1的第421-444位的测序结果，测序结果无 双峰。然后对测序结果利用ClustalW的方法同SEQIDNo.1一起进行多序列比对， 部分植物对应于SEQIDNo.1的第427-444位的序列比对结果如图2所示。测序结 果和序列比对结果显示，不同黄连属植物间037A4引物对的PCR扩增产物有差异， 将用037A4引物对对黄连属植物进行PCR扩增得到的DNA分子命名为黄连分子标记 037A4。

序列比对结果显示，不同黄连属植物PCR扩增产物对应于SEQIDNo.1的第 433-435位的核苷酸为GTA或TCC，将该分子标记命名为037A4-1；不同黄连属植物 PCR扩增产物对应于SEQIDNo.1的第438-440位的核苷酸为TCC或GTA，将该分子 标记命名为037A4-2；不同黄连属植物PCR扩增产物对应于SEQIDNo.1的第430-440 位间同源染色体比较有或无核苷酸的替换，将该分子标记命名为037A4-3。

分别对不同黄连属植物的037A4-1、037A4-2和037A4-3进行0/1分型：将037A4-1 为GTA时定义为1，将037A4-1为TCC时定义为0，037A4的PCR扩增产物对应于SEQ IDNo.1第433-435位的同源染色体比较为GTA与TCC的杂合型时，也将037A4-1定 义为0；将037A4-2为TCC时定义为1，将037A4-2为GTA时定义为0；对于037A4-3， 将PCR扩增产物对应于SEQIDNo.1的第430-440位核苷酸同源染色体间序列相同时 定义为1，不同时定义为0，各黄连属植物的黄连分子标记037A4多态性的0/1分型 结果如表2、表3和表4所示。

测序结果显示，当037A4-3为1时，PCR扩增产物对应于SEQIDNo.1的第430-440 位核苷酸的测序结果无双峰，当037A4-3为0时，PCR扩增产物对应于SEQIDNo.1 的第430-440位核苷酸的测序结果有双峰。

2.2034H11的PCR扩增产物

用034H11引物对的正向引物分别对步骤1的每个034H11引物对的PCR扩增产 物进行测序，部分植物的部分测序结果如图3所示，图3中A为CdDY05的PCR扩 增产物对应于SEQIDNo.2的第314-339位的测序结果，有双峰；图3中B为CHS03 的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第314-339位的测序结果，无双峰。然后对 测序结果利用ClustalW的方法同SEQIDNo.2一起进行多序列比对，部分植物对 应于SEQIDNo.2的第273-301位的序列比对结果如图4所示。测序结果和序列比 对结果显示，不同黄连属植物间034H11引物对的PCR扩增产物有差异，将用034H11 引物对对黄连属植物进行PCR扩增得到的DNA分子命名为黄连分子标记034H11。

序列比对结果显示，不同黄连属植物PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第154 位的核苷酸为G或A，将该分子标记命名为034H11-1；不同黄连属植物PCR扩增产物 对应于SEQIDNo.2的第285位和第286位间有或无核苷酸的插入，将该分子标记命 名为034H11-2；不同黄连属植物PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第359-360位 核苷酸为CC或TT，将该分子标记命名为034H11-3；不同黄连属植物PCR扩增产物对 应于SEQIDNo.2的第320-330位间有或无核苷酸的插入和/或删除，造成同源染色体 对应片段长度不同或相同，将该分子标记命名为034H11-4。

分别对不同黄连属植物的034H11-1、034H11-2、034H11-3和034H11-4进行0/1 分型：将034H11-1为G时定义为1，将034H11-1为A时定义为0；对于034H11-2， 将PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第285位和第286位间无核苷酸的插入定义为 1，将PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第285位和第286位间有核苷酸TCTCCAAG 的插入定义为0；将034H11-3为CC时定义为1，将034H11-3为TT时定义为0；对 于034H11-4，将PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第320-330位核苷酸同源染色 体对应片段长度相同时定义为1，将PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第320-330 位核苷酸同源染色体对应片段长度不同时定义为0，各黄连属植物的黄连分子标记 034H11多态性的0/1分型结果如表2、表3和表4所示。

测序结果显示，当034H11-4为1时，PCR扩增产物对应于SEQIDNo.2的第 320-330位核苷酸的测序结果无双峰，当034H11-4为0时，PCR扩增产物对应于SEQ IDNo.2的第320-330位核苷酸的测序结果有双峰。

2.3006G4的PCR扩增产物

用006G4引物对的正向引物分别对步骤1的每个006G4引物对的PCR扩增产物 进行测序，部分植物的部分测序结果如图5所示，图5中a1和a3分别为CcLD04 和CHS03的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第222-248位的测序结果，无双峰； 图5中a2和a4分别为OTZ17和CdSD13的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第 222-248位的测序结果，有双峰；图5中b1为CcLD04的PCR扩增产物对应于SEQID No.3的第315-341位的测序结果，无双峰；图5中b2、b3和b4分别为OTZ17、CHS03 和CdSD13的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第315-341位的测序结果，有双峰； 图5中c1、c3和c4分别为CcLD04、CHS03和CdSD13的PCR扩增产物对应于SEQID No.3的第179-205位的测序结果，无双峰；图5中c2为OTZ17的PCR扩增产物对应 于SEQIDNo.3的第222-248位的测序结果，有双峰。然后对测序结果利用Clustal W的方法同SEQIDNo.3一起进行多序列比对，部分植物对应于SEQIDNo.3的第 243-294位的序列比对结果如图6所示。测序结果和序列比对结果显示，不同黄连 属植物间006G4引物对的PCR扩增产物有差异，将用006G4引物对对黄连属植物进 行PCR扩增得到的DNA分子命名为黄连分子标记006G4。

序列比对结果显示，不同黄连属植物PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第254 位的核苷酸为G或A，将该分子标记命名为006G4-1；不同黄连属植物PCR扩增产物 对应于SEQIDNo.3的第286位的核苷酸为C或T，将该分子标记命名为006G4-2； 不同黄连属植物PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第225-245位间有或无核苷酸的 插入和/或删除，造成同源染色体对应片段长度不同或相同，将该分子标记命名为 006G4-3；不同黄连属植物PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第325-345位间有或 无核苷酸的插入和/或删除，造成同源染色体对应片段长度不同或相同，将该分子标记 命名为006G4-4；不同黄连属植物PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第31-50位间 有或无核苷酸的插入和/或删除，造成同源染色体对应片段长度不同或相同，将该分子 标记命名为006G4-5。

分别对不同黄连属植物的006G4-1、006G4-2、006G4-3、006G4-4和006G4-5进 行0/1分型：将006G4-1为G时定义为1，将006G4-1为A时定义为0；将006G4-2 为C时定义为1，将006G4-2为T时定义为0；在PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3 的第31-50位间有核苷酸插入和/或删除造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同时， 将006G4-3、006G4-4和006G4-5分别定义为1、1和0；在PCR扩增产物对应于SEQID No.3的第31-50位间无核苷酸插入和/或删除造成同源染色体对应核苷酸区段长度相 同时将006G4-5定义为1；在006G4-5为1时，在PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3 的第225-245位间有核苷酸插入和/或删除造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同 时，将006G4-3和006G4-4分别定义为0、1；在PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的 第225-245位间无核苷酸插入和/或删除造成同源染色体对应核苷酸区段长度相同时 将006G4-3定义为1；在006G4-5为1且006G4-3为1时，在PCR扩增产物对应于SEQ IDNo.3的第325-345位间无核苷酸插入和/或删除造成同源染色体对应核苷酸区段长 度相同时，将006G4-4定义为1，在PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第325-345 位间有核苷酸插入和/或删除造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同时将006G4-4 定义为0。各黄连属植物的黄连分子标记006G4多态性的0/1分型结果如表2、表3 和表4所示。

测序结果显示，当006G4-5为0时，PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第31-50 位核苷酸的测序结果有双峰，当006G4-5为1时，PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3 的第31-50位核苷酸的测序结果无双峰；在006G4-5为1且006G4-3为1时，PCR扩 增产物对应于SEQIDNo.3的第225-245位核苷酸的测序结果无双峰，在006G4-5为 1且006G4-3为0时，PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第225-245位核苷酸的测 序结果有双峰；在006G4-5为1、006G4-3为1且006G4-4为1时，PCR扩增产物对 应于SEQIDNo.3的第325-345位核苷酸的测序结果无双峰，在006G4-5为1、006G4-3 为1且006G4-4为0时，PCR扩增产物对应于SEQIDNo.3的第325-345位核苷酸的 测序结果有双峰。

2.4008H3的PCR扩增产物

用008H3引物对的正向引物分别对步骤1的每个008H3引物对的PCR扩增产物 进行测序，部分植物的部分测序结果如图7所示，图7中a3为CdSD13的PCR扩增 产物对应于SEQIDNo.4的第123-149位的测序结果，有双峰；图7中a1和a2分别 为CcBX01和OTZ17的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第123-149位的测序结果， 无双峰；图7中a1和a3分别为CcBX01和CdSD13的PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4 的第215-241位的测序结果，有双峰；图7中a2为OTZ17的PCR扩增产物对应于SEQ IDNo.4的第215-241位的测序结果，无双峰。然后对测序结果利用ClustalW的 方法同SEQIDNo.4一起进行多序列比对，部分植物对应于SEQIDNo.4的第112-131 位的序列比对结果如图8所示。测序结果和序列比对结果显示，不同黄连属植物间 008H3引物对的PCR扩增产物有差异，将用008H3引物对对黄连属植物进行PCR扩 增得到的DNA分子命名为黄连分子标记008H3。

序列比对结果显示，不同黄连属植物PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第126 位的核苷酸为A或G，将该分子标记命名为008H3-1；不同黄连属植物PCR扩增产物 对应于SEQIDNo.4的第130-150位间有或无核苷酸的插入和/或删除，造成同源染色 体对应片段长度不同或相同，将该分子标记命名为008H3-2；不同黄连属植物PCR扩 增产物对应于SEQIDNo.4的第220-240位间有或无核苷酸的插入和/或删除，造成 同源染色体对应片段长度不同或相同，将该分子标记命名为008H3-3。

对不同黄连属植物的008H3-1、008H3-2和008H3-3进行0/1分型：将008H3-1 为A时定义为1，将008H3-1为G时定义为0；对于008H3-2，将PCR扩增产物对应 于SEQIDNo.4的第130-150位核苷酸同源染色体对应片段长度相同时定义为1，将 PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第130-150位核苷酸同源染色体对应片段长度不 同时定义为0；对于008H3-3，将PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第220-240位 核苷酸同源染色体对应片段长度相同时定义为1，将PCR扩增产物对应于SEQIDNo. 4的第220-240位核苷酸同源染色体对应片段长度不同时定义为0，各黄连属植物的黄 连分子标记008H3多态性的0/1分型结果如表2、表3和表4所示。

测序结果显示，当008H3-2为1时，PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4的第130-150 位核苷酸的测序结果无双峰，当008H3-2为0时，PCR扩增产物对应于SEQIDNo.4 的第130-150位核苷酸的测序结果有双峰；当008H3-2为1时，PCR扩增产物对应于 SEQIDNo.4的第220-240位核苷酸的测序结果无双峰，当008H3-2为0时，PCR扩 增产物对应于SEQIDNo.4的第220-240位核苷酸的测序结果有双峰。

表2、不同黄连属植物分子标记的0/1分型

表3、不同黄连属植物分子标记的0/1分型

表4、不同黄连属植物分子标记的0/1分型

3.差异位点的聚类分析和黄连属植物分类

根据步骤2的不同黄连属植物的037A4-1、037A4-2、037A4-3、034H11-1、 034H11-2、034H11-3、034H11-4、006G4-1、006G4-2、006G4-3、006G4-4、006G4-5、 008H3-1、008H3-2和008H3-3的0/1分型结果，利用软件NTsys-pc2.1进行聚类分 析，算法为UPGMA，结果如图9所示。

按照聚类分析结果，可将这25种黄连属植物分成5大类，一类为黄连，一类为 峨眉黄连，一类为云南黄连，一类为短萼黄连，一类为三角叶黄连。结果表明，黄连 属植物中相同种聚为一类，黄连属植物中不同种不聚为一类，且种之间无交叉现象， 说明037A4、006G4、008H3和034H11这4个分子标记能够用来区分不同的黄连属 植物。