法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-03-13
授权
授权
2016-01-20
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/11 申请日:20150820
实质审查的生效
2015-12-23
公开
公开
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定人类个体、人源细胞株性别的引物、试剂盒和方法。
背景技术
人类个体的性别鉴定在法医学判定、考古研究、运动员比赛等多个领域意义重大，另外，在科学探索领域，不同性别来源的细胞在许多细胞特性方面的表现也不一致，比如QiuP发现[QiuP,etal.Genderdependedpotentialityofdifferentiationofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsintooocyte-Likecellsinvitro.CellBiochemFunct.2013,31(5):365-373]：同样是人源脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)，来自女性个体的hUC-MSCs在向雌性生殖细胞诱导分化时，相对于来自男性个体的hUC-MSCs，表达雌性生殖分化的标志基因更快、形成的类卵细胞个体更大、培养上清液中雌激素的产生量更多；Ghasemzadeh-HasankolaeiM的研究[Ghasemzadeh-HasankolaeiMetal.Maleandfemaleratbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsaredifferentintermsoftheexpressionofgermcellspecificgenes.AnatSciInt.2015,90(3):187-196]表明：来自女性个体的间充质干细胞更趋向于向女性生殖细胞分化，而来自男性个体的间充质干细胞更趋向于向男性生殖细胞分化；我们研究组在实验中也发现：来自不同性别个体的hUC-MSCs生长速率存在差异。因此，为了全面认识个体特性、促进科学探索，性别鉴定至关重要。
利用PCR技术进行性别鉴定是目前应用最广泛的方法，包括普通PCR法、巢式PCR法、荧光定量PCR法。其中，荧光定量PCR方法(qPCR)因其简便、直观、灵敏度更高，具有广阔的应用前景。上述检测方法均是通过检测样本中是否含有Y染色体上片段来判断男女性别，由此带来一个突出的问题，即操作过程中女性样本可能污染少量男性DNA而导致假男性，影响判断结果的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可准确鉴定人类个体、人源细胞株性别的引物、试剂盒和方法。
本发明提供了SEQIDNO：1-2所示的引物对或SEQIDNO：3-4所示的引物对。
本发明还提供了SEQIDNO：1-2所示的引物对1和SEQIDNO：3-4所示的引物对2在鉴别人类个体、人源细胞株性别中的用途。
本发明还提供了SEQIDNO：1-2所示的引物对1和SEQIDNO：3-4所示的引物对2在制备鉴别人类个体、人源细胞株性别的试剂中的用途。
本发明鉴定人类个体、人源细胞株性别的试剂盒，包含SEQIDNO：1-2所示的引物对1和SEQIDNO：3-4所示的引物对2，用于分别扩增NROB1基因和Sry基因。
本发明提供了上述试剂盒在鉴定人类个体、人源细胞株性别中的用途。
本发明鉴定人类个体、人源细胞株性别的方法，包括如下步骤：
a、提取待检样本的DNA；
b、以待检样本的DNA为模板，用SEQIDNO：1-2所示的引物对1和SEQIDNO：3-4所示的引物对2分别进行定量PCR扩增NROB1和Sry基因；
c、结果分析：对扩增结果进行分析，根据NROB1、Sry基因扩增的CT值，计算待检样本中NROB1、Sry基因的相对表达量比值NROB1/Sry：若比值大于10为女性，比值小于10为男性。
CT值：英文Cyclethreshold，中文名为循环阈值，含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，CT值与qPCR反应体系的模板初始量呈负相关。
其中：步骤a所述的待检样本为人类个体或人源细胞株。
实验操作中难免轻微的交叉污染，如果女性样本中污染了少量男性样本，在使用常规方法检测时，会有来自男性样本轻微的染色体基因的信号，这时，操作者很可能因为看到这个信号而误认为这是男性样本，从而造成女性样本假男性现象。但是，如果使用本发明方法，少量污染的男性样本不会根本性改变比值的大格局，还是会远大于10，这时，根据比值，操作者仍然判断其为女性样本，从而避免了女性样本的假男性现象。
另外，使用本发明方法，还可以降低男性样本假女性现象。如果男性样本提取DNA不顺利，损失了较多DNA，这是PCR模板量会相应降低，如果用常规方法，y染色体上的基因信号会很弱，容易被操作者误认为没有信号，而判断其为女性，造成男性样本假女性现象，但是如果使用本方法，比值来自一个x染色体基因的信号和一个y染色体基因的信号，就算DNA模板量低，来自x染色体基因的信号和来自y染色体基因的信号同时降低，比值还是变化不大，这样根据比值，仍然判断为男性，从而避免了男性样本假女性现象。
本发明提供的引物、试剂盒和方法，通过荧光定量PCR计算待检样本中NROB1、Sry基因的相对表达量比值NROB1/Sry，比值大于10判断为女性，比值小于10判断为男性；本发明提供的引物灵敏度高、特异性强；利用本发明的引物、试剂盒和方法可以准确鉴定人类个体、人源细胞株性别，有效降低女性样本假男性现象，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1对取样男性的染色体分析结果。
图2qPCR反应条件。
图3qPCR扩增结果图；其中：A为不加入DNA模板时针对NROB1基因的阴性扩增曲线图，可见无明显信号；B为不加入DNA模板时针对Sry基因的阴性扩增结果，可见也无明显信号；C为针对NROB1基因的扩增曲线图；D为针对Sry基因的扩增曲线图；E为针对NROB1基因的融解曲线图；F为针对Sry基因的融解曲线图。
图4对取样女性的染色体分析结果。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明所用的实验试剂、仪器如下：
全血基因组DNA快速提取试剂盒(溶液型)DP1101：京百泰克生物技术有限公司；
iQSybrGreenSupermix：Bio-Rad，USA；
DMEM高糖培养液、细胞培养用双抗、新生小牛血清、细胞培养用胰蛋白酶、细胞培养用磷酸缓冲液：均来自成都哈里生物；
CFX96qPCR仪：Bio-Rad，USA。
实施例1本发明引物的设计
1、选定用于荧光定量PCR的基因
人X染色体的单一基因选定为NROB1，其位于X染色体的Xp21，2个外显子，1个内含子，编码细胞核受体超家族的一种孤儿蛋白质；
人Y染色体的单一基因选定为Sry，其位于Y染色体的Yp11.3，1个外显子，没有内含子，编码决定生物雄性性别的蛋白质。
2、引物设计
针对NROB1和Sry的引物信息见表1。
表1引物信息
3、引物进行荧光定量PCR的验证
1)制备DNA模板：
取健康男性的外周血，利用全血基因组DNA快速提取试剂盒(溶液型)提取血液DNA，得到男性DNA。
对取样的男性进行染色体分析，结果见图1。
由图1可见，取样的男性样本明显可见一条X性染色体和一条Y性染色体，确认DNA来源的个体确实为基因组意义上的男性。
2)荧光定量PCR：以提取的男性DNA为模板，分别采用NROB1引物和Sry引物，进行qPCR检测；反应按试剂盒iQSybrGreenSupermix的说明书进行：qPCR反应采用20μl体系，其中每个反应体系的DNA模板量为5ng，正向和反向引物的量都为20pg，iQSybrGreenSupermix的量为10μl，用无RNA酶和DNA酶的纯水补齐体积达到20μl。qPCR反应条件见图2。
3)引物扩增结果
本发明所用两对引物进行qPCR反应的扩增曲线、融解曲线见图3。
由图3可见，本发明用于扩增NROB1基因的引物对和用于扩增Sry基因的引物对，二者均对模板DNA的扩增效果明显，融解曲线为单峰，而且峰尖端明显，因此，本发明提供的荧光定量PCR引物特异性好，对NROB1基因和Sry基因的扩增结果可靠。
实施例2本发明鉴定性别的方法
1、提取待检测人的血液中白细胞的DNA或者待检测的人源细胞株的DNA；
2、以提取的DNA为模板，分别采用实施例1的NROB1基因的引物和Sry基因的引物，进行qPCR检测；反应按试剂盒iQSybrGreenSupermix的说明书进行：qPCR反应采用20μl体系，其中每个反应体系的DNA模板量为5ng，正向和反向引物的量都为20pg，iQSybrGreenSupermix的量为10μl，用无RNA酶和DNA酶的纯水补齐体积达到20μl。qPCR反应条件见图1。
3、qPCR检测后，对扩增结果进行分析，根据NROB1、Sry基因的扩增曲线CT值，计算待检样本中NROB1、Sry基因的相对表达量比值NROB1/Sry：若比值大于10为女性，比值小于10为男性。
以下用试验例的方式说明本发明的有益效果：
试验例1用人类个体验证本发明方法
一、实验材料
女性DNA：取健康女性的外周血，利用全血基因组DNA快速提取试剂盒(溶液型)提取血液DNA，得到女性DNA。
对取样的女性进行染色体分析，结果见图4。
图4可见，取样的女性样本明显可见两条X性染色体，确认DNA来源的个体确实为基因组意义上的女性。
男性DNA：同实施例1的男性DNA。
二、本发明方法
以提取的DNA为模板，分别采用实施例1的NROB1基因的引物和Sry基因的引物，进行qPCR检测；qPCR反应体系、反应条件及扩增结果分析方法同实施例2，qPCR结果见表2。
表2验证女性和男性的NROB1/Sry比值
由表2可见，女性的比值大于10000，而男性的比值小于10，利用本发明方法可准确鉴定人类个体的性别性的比。
二、稀释男性样本的DNA用量验证本发明方法
人为稀释男性样本的男性DNA，稀释倍数从5倍到20倍，除了DNA模板量外，qPCR反应体系、反应条件及扩增结果分析方法同实施例2，qPCR结果见表3。
表3稀释男性样本验证本发明方法
由表3可见，男性样本稀释倍数越高，NROB1基因和Sry基因的CT值越大，符合预期；当稀释量达到20倍时(是实际操作中较大的减少量了)，比值仍然在1附近，仍然小于10，仍然判断为男性，不会造成男性样本假女性现象，鉴定结果准确。
试验例2女性样本中混入男性DNA验证本发明方法
1、实验材料
女性DNA和男性DNA：同试验例1。
2、实验方法
在女性样本中人为混入一定量的男性DNA，混入量从占女性总DNA的2.5％到10％，除了DNA模板量外，qPCR反应体系、反应条件及扩增结果分析方法同实施例2，qPCR结果见表4。
表4女性样本避免假男性现象
由表4可见，女性样本中混入的男性DNA混入量越多，NROB1/Sry比值越低，符合预期；当混入量达到10％时(是实际操作中较大的污染量了)，比值为38.07，仍然大于10，判断为女性，避免了女性样本的假男性现象的现象，鉴定结果准确。
综上，本发明建立的NROB1/Sry比值法能鉴定女性和男性样本，本发明的
试验例3用人源细胞株验证本发明方法
1、实验材料
从女婴和男婴的脐带组织制备的脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)，分别提取DNA，得到女脐带间充质干细胞DNA(女-hUC-MSCs)和男脐带间充质干细胞DNA(男-hUC-MSCs)；
来自女性的外周血制备的诱导多能干细胞(IPS)，提取DNA，得到女性诱导多能干细胞DNA(女性IPS)；
从购买自四川大学细胞库的Hela细胞(女性宫颈癌细胞)中提取DNA，得到HelaDNA(女性Hela)；
DNA样本均使用全血基因组DNA快速提取试剂盒(溶液型)提取。
2、实验方法
qPCR反应体系、反应条件及扩增结果分析方法同实施例2。
3、实验结果
qPCR结果分别见表5、表6、表7。
表5对人hUC-MSCs的性别鉴定
表6对人女性IPS的性别鉴定
表7对Hela细胞的性别鉴定
由表5、表6、表7可知，对女性来源的细胞株hUC-MSCs、IPS、Hela，NROB1/Sry比值均大于10(>110.41)，对于男性hUC-MSCs，比值仅为0.68，小于10；使用了四种性别已知的人源细胞株可以验证本发明方法的准确性，利用本发明方法可准确鉴定人源细胞株的性别。
试验例4用本发明方法鉴定人293细胞的性别
1、实验材料
从购买自四川大学细胞库的293细胞中提取DNA，得到293细胞DNA；DNA样本使用全血基因组DNA快速提取试剂盒(溶液型)提取。
2、实验方法
qPCR反应体系、反应条件及扩增结果分析方法同实施例2，qPCR结果见表8。
表8对人293细胞的性别鉴定
由表8可见，293细胞的NROB1/Sry比值为68.75，大于10，所以判定为女性。人293细胞(ATCC编号：CRL-1573为人胚胎肾脏细胞)在科学研究中被广泛使用，但是这种细胞的性别不明，给科学研究带来不便，运用本发明建立的性别鉴定法可以准确、有效的鉴定293细胞的性别。
综上，本发明提供的引物、试剂盒和方法，可以准确鉴定人类个体、人源细胞株性别，有效降低女性样本假男性现象，操作简便、灵敏度高、特异性强，具有良好的应用前景。
机译： 用于确定人类个体中前列腺癌易感性，鉴定用于前列腺癌易感性评估中的标记以及对从患有癌症或被诊断患有癌症的人类个体获得的核酸样品进行基因分型以评估人类个体可能性的方法对治疗剂的反应的预防，预防和/或改善与前列腺癌有关的症状，预测诊断为癌症的个体的预后以及监测正在接受治疗的个体的治疗进展。用于前列腺癌的试剂盒，用于评估人类个体对前列腺癌的易感性的试剂盒，计算机可读寡核苷酸探针的用途以及用于确定人类个体的前列腺癌的遗传指标的设备。
机译： 低密度氧化脂蛋白免疫疗法的应用，在个体中诱导动脉粥样硬化斑块消退的方法，至少一种ldl抗体或ldl的至少一种氧化表位的使用，与动脉粥样硬化相关的心血管疾病的防治方法，至少一种抗体的使用分子和至少一种Idl的氧化表位和他汀类药物，药物制剂，部分试剂盒，鉴定在个体中诱导动脉粥样硬化斑块消退的抗体和鉴定在个体中诱导动脉粥样硬化斑块消退的药剂的方法，抗体，药物组合物和抗体用途
机译： 产生IL-13的人类Tr1-细胞的数量;产生IL-13和IL-10的人类TR1克隆;鉴定和富集人类Tr1细胞群体的方法;产生IL-13的人类Tr1细胞的丰富种群;产生IL-13的人类Tr1-细胞的鉴定试剂盒种群;产生IL-13的人类Tr1细胞的数量，用于预防和/或治疗免疫反应;测定产生IL-13的人类Tr1-细胞群体的方法;产生IL-13的人Tr1-细胞的人口数量;产生IL-13增强免疫反应的人Tr1-细胞的分离种群
