用于确定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法

技术领域

本发明涉及用于确定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法，以及微流体设 备的用途，所述微流体设备包括至少一个特定微流体芯片并且适配于用交流电 (AC)实施阻抗式流式细胞术(IFC)。

背景技术

细胞活力的分析，特别是花粉粒的细胞活力的分析，在植物育种以及通过 种子的植物产生过程的各个方面扮演重要角色。

未成熟的花粉粒(小孢子)的活力的分析对于纯合的亲本系的产生及其特定 方案或方法的开发是重要的。从花粉粒中产生亲本系使得育种循环的许多代安 全，并因此被认为对于有效亲本系产生是至关重要的。然而，为了这些系的最 佳产生，它们的供体植物必须在最佳条件下生长。

花粉质量的分析在雄性不育母系的选择期间扮演重要角色。基于只通过雌 性遗传的细胞质雄性不育性的雄性不育母系的使用，不仅在虫媒和风媒授粉物 种中是优选的，而且在人工授粉物种中也是优选的。由于花粉丢失，雄性不育 母系不能自授粉，这防止了F1种子被母系材料污染，并且具有可以省去劳动密 集型去雄步骤的优点。

高质量的花粉对于有效的F1杂交种子的产生至关重要。高花粉质量将带来 最大结籽率(seedset)，而较低的质量将导致较低的产量，并因此导致每粒种子的 更高生产成本。花粉质量受其遗传组成、植株生长条件的影响，但也受杀虫剂 的影响。在产生过程之前和产生过程期间施用杀虫剂以保持结果植物 (fruit-bearingplants)健康是常规实践，因为这可以在可以分别收获果实和种子之 前的长达两个月开始。因此，花粉的活力应该在种子产生期间被持续监测，分 别以预示/预测和控制产生，以估计授粉的最佳时间点，例如，施用杀虫剂之后， 或者测试哪种杀虫剂是不合适的，或者检查其他化学制品(例如，化肥)的效果， 或者生长情况。

育种和F1杂交种子产生以及种质保存程序中的另一种常规实践是使用储 存的花粉进行。对于任何储存程序，应该使用最高质量的花粉。该领域中的常 规花粉活力分析将允许储存方案和后续过程的优化。

当前，不存在有效、高通量且容易实施的技术来原地(on-site)分析花粉质量。

通常，通过各种经典方法，如染色技术或者体外萌发测定来确定花粉活力。 然而，来自各种染色技术的结果不总是与体外萌发相关，并且其不适用于所有 物种。该染色技术基于酶促反应，该酶促反应可能不是在所有植物物种的花粉 中存在，并且体外花粉萌发高度取决于正确的条件，该条件需要单独调整。现 有分析花粉活力和萌发的方法均受限于在特定时间范围内可以分析的细胞的数 量，并且它们在制备和分析中是耗时的。

另外，当前技术接下来需要特定的化学制品，各种特定设备，如，荧光显 微镜、培养箱，以及本领域技术人员。通常，这意味着这些分析在分析实验室 中实施，而不能在温室或旷野的植物之间“原地”实施。最终，由于这些分析 实施起来相当复杂并且涉及从样品制备到分析的数个易错步骤，所以它们的再 现性在跨越整个种子产生过程的不同位置(即急需这些数据的不同地点)变化巨 大。因此，经验显示，在不同地理位置和甚至在密切相关的分析实验室中获得 的花粉活力数据也不总是可比较的，并且遭受主观误差。

对于评价花粉和植物质量的可靠装置和方法的需求被广泛认可。WO 2012/129199A2公开了此类用于鉴别和分选花粉以及确定花粉活力的方法。对 于这些分析，需要常规的基于荧光的流式细胞仪或者光密度测量。对于基于荧 光的分析，遗传标记物的存在/不存在是强制性的，以便当特定染料结合于各个 细胞时允许鉴别。即使该技术提供了统计数据，其仍不适合于原地分析，并且 只有在此类遗传标记物可用时才起作用。另一方面，光密度测量提供了一种用 于鉴别正在分裂的花粉(lysingpollen)的手段，但如果花粉细胞处于具有潜在变化 的光密度和仍然活性特征的不同发育阶段，则该光密度测量可能提供混淆数据。 在这方面，WO2012/129199A2没有公开支持数据。

就节约生产和后续成本而言，例如即将用在F1杂交种子产生中的花粉细胞 的“原地”分析具有巨大的商业利益。在低质量(低活力)花粉的情况下，可以决 定不将其用于授粉，减少花粉储存程序、大规模人工授粉、培育材料直到果实 收获，种子摘取和进一步处理的后续努力。育种材料的花粉的“原地”分析允 许简单且直接地选择雄性可育/雄性不育、耐热和/或耐盐植物，使得选择过程更 有效以及减少培育和维持选择的个别植物的劳动。

不仅种子产生，而且果实产生，均依赖于用良好质量花粉的花的受精。一 方面杀虫剂的未知影响以及另一方面对大规模人工授粉的需求(例如由于各种昆 虫的灭绝)需要简单的工具以确定花粉质量。

因此，本发明要解决的问题是克服现有技术的缺陷，并提出了在植物育种 和/或种子产生过程中以有效且可靠的方式简单且快速的分析植物细胞的方法。 另外，所述分析应该允许在特定过程内的标准化并且在不同位置可适用，在同 样的研究/产生地点(温室、旷野、实验室)或在不同的地理区域也是如此，因为 种子制造商通常全球操作。

用于上述过程的植物细胞分析的高度复杂性这一问题通过如方法权利要求 1和用途权利要求中要求保护的本发明而解决。更多有利的实施方式在各个从属 权利要求(subclaims)中要求保护。

发明内容

根据权利要求1，用于确定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法，包括：

从花中机械移取未成熟或成熟的花粉粒；

在导电的、特定的且明确定义的缓冲液中重悬花粉粒，用于使所述植物细 胞保持活性；

将花粉悬浮液通过具有适合于微流体设备的孔径的适当的过滤器，所述微 流体设备适配于实施阻抗式流式细胞术(IFC)；

将过滤的悬浮液通过针对各个花粉类型校准的微流体设备，并以预定频率 测量花粉粒的阻抗；

存储测量的各花粉的阻抗值以及测量频率，所述阻抗值具有幅值和其相关 相位角；

计数过滤的悬浮液中的花粉粒；以及

根据振幅和/或相位值，通过手工或自动设定合适的门控以鉴别花粉粒，并 确定分析的花粉群的活力比或成熟度。

具体实施方式

本发明描述了在导电的、特定的且明确定义的缓冲液中重悬收获的花粉粒， 用于使所述植物细胞保持活性，以及使用射频阻抗分析用于原地花粉质量确定， 以及将其整合进相关蔬菜和果实植物的植物育种和种子产生过程中。导电、特 定的且明确定义的缓冲液必须具有使细胞在制备和测量期间保持存活的能力， 以及为通过使用射频阻抗分析的所述测量提供充分导电性的能力。因此，该缓 冲液必须适合于被分析物种的细胞类型。

通过该方法，不仅可以容易地原地区分活的和死的花粉细胞，而且还可以 以高效的方式区别发育中花粉的不同发育阶段。该分析方法能够在植物育种过 程以及种子产生期间施用，且通过以下有助于植物育种：通过选择雄性不育系， 通过经由监测花粉活力的健康分析改善加倍的单倍体产生(doubledhaploid production)，和通过两个亲本系的花粉分析来优化F1杂交种子产生。另外，该 方法可以用于在胁迫条件下选择育种系，且有助于控制用于种质保存的花粉的 质量。也可以在植物发育期间应用该方法，以控制植物健康(fitness)以调整用于 果实或种子产生的最佳生长条件。紧接着花粉活力的分析，所述技术也允许检 测植物病原体和它们的活力，提供了一种新的植物病原体的监测系统。由于与 植物细胞的细胞差别，植物病原体的细胞具有不同的阻抗值。单细胞的阻抗分 析通常可以应用到所有植物物种，并不限于本发明中所述的物种。

特别地，本发明基于以下事实：任何来源的细胞被细胞膜和/或细胞壁包围， 以及该细胞膜和/或细胞壁当暴露于电场时展示出比电容(specificcapacities)。可 以测量这些电容，给出反映细胞膜、细胞壁和细胞质的生理状态的电容值。

在本发明中，通过阻抗式流式细胞仪分析植物细胞电容。常规库尔特计数 器使用直流电(DC)或低频交流电(AC，最高1kHz)测量阻抗，允许可靠的细胞计 数和细胞尺寸鉴别。EP1335198B1公开了一种具有电极排列的微流体方法， 所述电极排列允许在宽频率范围内(100kHz--20MHz)对细胞进行阻抗分析。高频 分析超出了简单的细胞计数和尺寸测量并且询问细胞的介电性能，这允许各种 应用(例如细胞分化)中的细胞鉴别，或分别动物、真菌和细菌细胞活力 (Schade-Kampmann等，标题：ON-CHIPNON-INVASIVEANDLABEL-FREE CELLDISCRIMINATIONBYIMPEDANCESPECTROSCOPY，CellProlif. (2008)，41(5)，第830-840页)。与常规库尔特计数器测量(其中信号振幅用于计 数细胞和测量细胞尺寸)相反，高频分析提供了关于细胞膜电容和细胞质导电 性的信息，所述细胞膜电容和细胞质导电性是细胞生理状态的重要指标。在最 高达0.1MHz的频率范围内对单细胞的阻抗分析允许分割振幅和相位角分量，并 允许从非细胞颗粒中区分细胞以及区分活/死细胞(Conrad等，标题： IMPEDIMETRICANDOPTICALINTERROGATIONOFSINGLECELLSINA MICROFLIDICDEVICEFORREAL-TIMEVIABILITYANDCHEMICAL RESPONSEASSESSMENT，BiosensorsandBioelecrtonics(2008)，23，845-851)。然 而，Conrad等为该分析所用的装置在测量阻抗信号前捕获单细胞，并因此不适 合于在短时间内快速分析数千个细胞，而所述分析为统计分析提供了合理基础。

所述方法的适宜性或适用性取决于植物细胞尺寸、细胞类型、分析缓冲液、 以及阻抗式流式细胞仪。必须针对各个花粉类型关于其通道宽度(channelwidth) 和使用的缓冲液校准微流体设备，悬浮液中的花粉粒通过所述通道宽度移动。

本发明提供了允许不依赖于染色技术分析活性的方法，该分析是可再现且 可靠的，其不需要非常特别的设备，可以在任何位置应用，并且可以由任何人 在短期培训后实施。

本文中的“活力”是指细胞或生物体是生理活性的。生理活性的是指该细 胞或生物体能够分裂、繁殖、萌发、与另一细胞融合(fuse)或融合(melt)和/或进 一步发育。

分析的植物细胞可以被植物细胞壁、膜或者外壁(exine)包围。该细胞壁、膜 或外壁包围着植物的典型细胞内含物，所述内容物包含细胞质、一个或多个液 泡、一个或多个细胞核、质体、内质网、高尔基体等。

具有外壁的植物细胞是作为细胞壁的非常特定类型的植物细胞。具有外壁 的植物细胞被称为花粉粒，其属于来源于成熟植物的生殖植物细胞类别。生殖 植物细胞通过不同的发育步骤发育成卵细胞或花粉粒。

花粉，哺乳动物精子细胞的植物等价物，也被称作生殖细胞或孢子，对所 有植物物种的有性生殖是至关重要的。花粉在花芽的花药内从小孢子母细胞经 由两次细胞分裂(二分体(两个二倍体细胞)和四分体(四个单倍体细胞形式))发育 成单倍体未成熟的花粉粒或小孢子。从四分体释放后，小孢子经由不同的阶段 发育成可用于授粉的成熟花粉粒。只有与柱头接触的物种相关的、健康且有活 性的花粉才会萌发，并形成朝向植物卵细胞(胚珠)的花粉管，花粉管顶端进入珠 孔(microphylla)后，植物卵细胞(胚珠)受精。双受精之后，胚乳(等同于哺乳动物 胎盘)和合子胚将形成并在种皮(seedcoat)内成熟。大部分的花粉粒具有单倍体核 内容物(一组染色体)，但其也可以是二倍体(两组染色体)或多倍体或非整倍体。

本文中的“成熟植物”是指已经达到发育的晚期阶段以使得该植物产生至 少一个生殖器官，优选多个此类器官的植物，其中，从此类生殖器官中可以获 得活性后代。此生殖器官可以是性生殖器官，例如花，或营养生殖器官(vegetative reproductiveorgan)，例如块茎、匍匐枝、根茎、球茎、球芽或鳞茎。

本文中花可以是单性的，即具有至少一个雄性生殖器官(雄蕊)或者至少一个 雌性生殖器官(雌蕊)；或者在本文中花可以是双性的，即具有至少一个雄性生殖 器官和至少一个雌性生殖器官。

本文中花可以是可育的或是不育的。在可育花的情况下，此花产生功能性 花粉和一个或多个功能性卵细胞，其随后能够产生活性后代。具有功能性花粉 和一个或多个功能性卵细胞的花可以不仅通过自花受精、而且通过异花受精产 生一个或多个种子。在不育花的情况下，由于分别不存在任何花粉或存在无功 能性花粉，此花不通过自花受精产生种子，但可以通过异花受精产生种子。此 花可以是雄性不育或雌性不育的。然而，雄性不育花可以通过来自另一花的功 能性花粉而受精。雌性不育花的花粉可用于使另一花受精。此花的雄性不育性 可以是细胞质雄性不育性(CMS)、孢子体自交不亲和性(sporophytic self-incompatibility)、配子体自交不亲和性(gametophyticself-incompatibility)或任 何其他不育系统的结果。上述生物学术语以其领域认可的含义使用。

本文中术语“植物细胞”是指任何源自植物或植物材料(包括藻类)的细胞。 也指原生质体或来自液体悬浮液的任何细胞，等等。本文中术语“植物材料”是 指任何外植体，源于来自植物的任何结构、组织或器官的块(piece)或插条 (cutting)。本文中的植物材料也可指植物的任何组织或器官。从中得到所述外植 体、块或插条的所述植物组织或器官包括子叶、下胚轴、上胚轴、种子、愈伤 组织、叶、根、枝条(shoot)、花、花药、花粉、胚珠、卵细胞、果实、分生组织、 原基、花序、叶柄、原生质体、库组织(sinktissue)、源组织、苗(seedling)、库器 官(sinkorgan)、源器官、块茎、合子胚、体细胞胚或源自单倍体的加倍的单倍体 的胚。在这方面还包括细胞培养物，例如单细胞培养物、悬浮液、促成雄性性 状的培养物(androgenicculture)、促成雌性性状的培养物(gynogeniccultures)。特 别地，术语植物材料是指源自花或花芽的组织、培养中的细胞、以及地面胚 (groundembryo)和种子组织。

根据本发明的一个实施方式，植物细胞在阻抗式流式细胞仪(IFC)中的特定 微流体芯片内暴露于交流电(AC)场中，所述交流电(AC)场的频率范围为 0.1-600MHz，优选为0.25-30MHz。利用这些参数，可以获得所需要的结果。

详细地，根据本发明的特定实施方式，为了鉴定植物细胞是活性(活的)还是 非活性的(死的)，该方法包括将存储的具有幅值和相位角值的阻抗值排列在x-y- 矩阵中；确定具有较低相位角和较高相位角的值阵列之间的门控；计数两个云 中的花粉粒阻抗值；计算阻抗值的相位角低于门控的花粉量和阻抗值的相位角 高于门控的花粉量之间的比率；将所述比率与包含各花粉数据的数据库的各比 率比较，用于确定花粉的活力是否足以用于给定的特定目的；以及展示该分析 群体的结果。

根据本发明的另一实施方式，该方法还包括通过以下鉴定成熟度：确定幅 值和/或角度值，作为测量频率的函数；将所述幅值和/或角度值与包含各花粉的 数据的数据库的各值比较；将所述植物细胞鉴定为属于特定的发育阶段；以及 展示该分析群体的结果。

在另一个实施方式中，分析的植物细胞根据其不同的阻抗信号而分开，并 用于下游过程，例如用于育种、种子和/或果实生产目的。

在进一步的实施方式中，所述结果用于控制植物细胞产生过程，检测细胞 培养物的状态以及植物细胞生产过程中的细菌或其他污染。

在另一个进一步的实施方式中，所述结果用于选择用于雄性可育性/不育 性、耐热性、耐盐性和/或胁迫耐性的植物育种材料。

根据另一个优选的实施方式，所述结果用于优化获得具有最大活力的花粉 所需的植物生长条件(例如温室中的照明和湿度参数)。

为了特定目的，有利的是确定触发参数，所述触发参数通常由测量的阻抗 分量(真实或虚构部分、振幅和相位角)之一及其值(＝触发水平)构成，用于鉴定 花粉的特征以便仅从具有确定特征的花粉测量阻抗。

优选地，确定分析的花粉群的活力或成熟度是实时实施的。

进一步，根据本发明，在选择用于雄性可育性/不育性、耐热性、耐盐性和 /或胁迫耐性的植物育种材料期间，在种子产生过程期间使用微流体设备，以分 别通过鉴定植物细胞是活性(活的)还是非活性的(死的)和/或将植物细胞鉴定为 属于特定的发育阶段而控制植物细胞产生过程，或检测植物产生过程中的细菌、 真菌或其他污染，所述微流体设备包括至少一个特定微流体芯片并且适配于用 交流电(AC)场实施阻抗式流式细胞术(IFC)，所述交流电(AC)场的频率范围为0.1 到600MHz，优选为0.1到200MHz，最优选为0.25到30MHz。

本发明的一个优点是，植物细胞不必染色用于活力分析，该方法是非侵入 式、非破坏性的，并且可以在短时间范围内分析大量细胞。

本发明的另一个优点包括追踪植物细胞的发育过程的可能性和它可以应用 到所有植物物种。植物细胞可以是体细胞或生殖细胞来源的。

本发明的一个进一步优点是，通过分析植物细胞，指示植物的生理健康或 活力。

本发明的一个进一步优点是，实施分析的设备可以紧挨着植物使用，提供 直接结果。

本发明的一个进一步优点是，实施分析的设备可以根据各种植物的特性 (specifications)进行优化。

本发明的一个重要的优点是，该分析可以被标准化并因此在不同位置应用， 通过使用针对各个花粉类型优化的缓冲液和针对各个花粉类型特别校准的微流 体设备提供可比较和可再现的结果。可能一种缓冲液和一种校准可用于几种不 同的花粉类型。

根据本发明的方法的应用导致独立于物种的植物细胞的有效且可靠的活力 分析。

为了实现前述和相关目的(relatedends)，然后本发明包括在下文中充分描述 并在权利要求中特别指出的特征。下述说明和附图详细阐明了本发明的特定说 明性实施方式。然而，这些实施方式仅指示了其中可以利用本发明原理的各种 方式中的几种。当与附图一起考虑时，本发明的其他目的、优点和新颖特征将 从本发明的如下详细描述中变得显而易见。

附图说明

图1显示了样品制备和上样程序的流程图。

图2示出了基于不同阻抗相位信号分离非活性花粉群和活性花粉群。

图3以芸苔属(Brassica)为例示出了通过IFC分析的花粉的不同发育阶段的鉴 别。

图4示出了IFC对选择细胞质雄性不育系、以萝卜属(Raphanus)为例对检测 害虫或老化的影响、和以番茄为例对检测杀虫剂处理对花粉活力的影响的适合 性。

图5以番茄为例显示了通过IFC确定的花粉活力与所得结籽(其代表每个果 实的胚的相对量)之间的典型相关性。

图6以番茄为例显示了用于授粉的花粉质量(活力)对所得果实尺寸的影响。

图7显示了IFC在用于种子生产或种质保存的花粉处理期间的用途。

实施例

本方法设想将收获的花粉粒重悬于液体标准IFC缓冲液中，通过具有合适筛 孔尺寸的筛过滤，并上样到机器上。图1给出了用于IFC测量的样品制备的流程 图的实例。标准IFC包括任何允许植物细胞保持活性的导电和液体缓冲液。用IFC 测量阻抗后，根据获得的测量结果，将接收值以如图2和图3所示的各自格式 进行存储，用于下面的与数据库中的相同植物物种的各自数据的比较。结果或 者直接显示测量值，或者仅显示与数据库比较的结果，例如，仅是花粉适合于 或不适合于确定目的的信息。

图2显示了通过以0.5MHz进行的IFC的花粉活力分析的两个点状图。图A 描述了对典型的辣椒(Capsicumannuum(pepper))的新鲜花粉样品的分析，所述样 品含有活性和非活性的花粉，且每个点代表一个花粉粒的阻抗信号(x轴＝相位 角，y轴＝信号振幅)。为了将死的花粉亚群鉴定为具有较低相位角值的那些花粉 粒，将同样的样品热失活并再次分析。通过设定合适的门控(线性、多边形 (polygonal)，等)，可以容易地确定活性花粉的比率并因此评价收获的花粉样品 是否适合于随后的授粉。由于死的和活的亚群的清楚分开，门控设定也可以不 需要用户介入而自动发生，这进一步简化了分析过程。

通过IFC对花粉质量的确定是可再现且高度灵敏的。例如，利用甘蓝(Brassica oleracea)(花椰菜)和西红柿(Solanumlycopersicum)(番茄)花粉的死的和活的花粉 的明确混合物，获得了预期的和测量的活力之间的显著相关性。

花粉的阻抗分析不仅可以用于活力确定，而且可用于区分发育阶段。图3a 显示了花粉粒在其发育期间遇到的各个阶段的示意图。细胞维度和细胞内含物 (液泡的尺寸)的变化可以分别影响阻抗信号的振幅和相位角两者。这在图3b(其 中相位角变化由于不同的液泡尺寸导致)和图3c(其中振幅变化由于不同的细胞 尺寸导致)中得到证明。该分析利用从指示尺寸(4-7mm)的花芽(buds)中获得的甘 蓝花粉粒进行。

图4示出了收集自细胞质雄性不育系(CMS1-6)以及完全可育系(对照1-3)的 萝卜属花芽的花粉的活力。该分析显示较小的植物(4周，对照3)比较老的植物 (12周，对照1和2)具有更高的花粉活力——一种育种者描述但之前没有分析 过的现象。被食花粉的昆虫如蓟马(Thrips)(其也影响植物的整体健康)的感染加 上杀虫剂的应用(“老的植物”和“蓟马感染的”)也显著降低了对照和CMS系两 者中的花粉活力。

图5a和5b显示了通过以12MHz的IFC分析的花粉活力与种子产生的相关 性。番茄花被不同花粉数量(％活性花粉)授粉，并分析相关的活性种子(包含胚的 种子)的量以产生成功授粉的数据(图5a)。用活力高于25％的花粉授粉的花显示 高于可以在每个果实中获得的最大种子量的50％的结籽，如每个果实通过天然 自交获得的活性种子的数量所估计。用低活力花粉(例如低于2.5％)授粉的花成 功生产出可能胚珠的仅10-20％。非常低活力的花粉或者失活的花粉分别导致最 小量的种子或导致根本没有种子，如图5b所示。只有包含胚的种子将产生新植 物。

图6a和6b显示了花粉质量对果实发育的影响。图6a显示了胚分析前授粉后 3周收获的番茄果实的图像。测量每个收获果实的直径，并计数每个果实的胚数。 相比于较低质量(图6a，中间行；6b，灰线)，已用最高花粉质量(31％)进行授粉 的花具有显著更大的果实和更高的每个果实的胚数(图6a，上行；6b，黑线)。用 活力为0.2％进行授粉的花不产生任何果实并因此没有种子。因此，IFC的使用 也可以是在果实产生过程中的重要工具。

图7显示了用于授粉和种质保存目的的方法的原理和应用。单一步骤描述 在框图中。花粉的阻抗分析可以在温室、田野(＝原地)中实施，主要用于生产过 程控制或种质保存程序，或在实验室环境中实施，用于进一步的育种或存储应 用(花粉基因库)。标准化程序的使用允许独立于位置和操作者的分析，并因此导 致可比较的结果。这对于种子生产商和育种者代表了巨大改进，因为花粉活力 数据可以在种子产生或种质保存过程(这经常在地理上不同的位置发生)的全部 各个步骤中进行追踪。因此，该花粉分析方法首次满足了全球运作的种子生产 商的需求。