基于两步法PCR的甲烷/氨氧化细菌群落结构分析方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及是一种可以广泛应用于各种生态环境样品中特定功能微生物群落结构分析的方法。

背景技术

依赖于培养的实验方法曾经作为传统微生物学的主要研究手段。可是环境微生物样品通常情况下微生物的种类数目庞大而每一种的丰度较低，大部分微生物难以摸索培养条件甚至无法获得纯培养，所以不依赖培养的分子检测手段已经成为研究环境微生物群落结构的主流方法，而针对特定基因的PCR并分析序列信息是其中的一种重要手段。常规实验方法是对环境样品进行总微生物基因组DNA抽提，之后针对某个基因进行PCR扩增，并通过测序得到多种类群微生物该基因的序列，然后进行序列分析以获得环境中与该基因相关的微生物群落结构信息。常用的PCR目的基因包括16SrRNA基因和各种功能基因。

甲烷氧化细菌（methaneoxidizingbacteria,MOB）和氨氧化细菌（ammoniaoxidizingbacteria,AOB）作为全球碳循环/氮循环过程中的重要微生物，在农业生产和环境保护等发面发挥着重要作用。它们的功能基因，颗粒性甲烷单加氧酶α亚基（particulatemethanemonooxygenaseA,pmoA）和氨氧化单加氧酶α亚基（ammoniamonooxygenaseA,amoA）是研究这两种微生物类群的标识基因，而且这两类基因是同源的。针对pmoA/amoA这两种基因的引物有很多，但是除了A189和A682之外，其他引物都不能同时扩增pmoA/amoA这两种基因，而引物对A189/A682扩增效率较低，并已被证实存在严重非特异扩增。

为了设计能同时扩增pmoA/amoA这两种基因的引物，我们需要寻找这两个基因的保守区，并引物序列中加入简并。常规引物是某特定的核苷酸序列，而简并引物则是许多特定核苷酸序列的混合物。举例说明，在简并的符号中R和V各代表A/G或A/C/G，序列ARVC就是指六种序列（AAAC,AGAC,AACT,AGCT,AAGT,AGGT）的等量混合。可是引物中引入简并之后，必然导致这些引物的混合物中有部分引物是不发挥作用，而且简并的程度越大，不发挥作用的引物就越多，发挥作用的引物含量指数减少；所以简并程度的增加会使有效引物浓度缺少，导致PCR扩增效率的下降。因PCR扩增效率的低下，高简并引物未能在微生物群落结构研究中应用。

本发明引入一种新的PCR策略，将PCR分为两步，并在简并引物的5’端延伸20碱基长度的序列，称之为tag；tag序列本身没有严格限制，但是应注意不能与目的基因匹配。第一步PCR使用加tag的简并引物并且其循环数较少。由于简并的存在，引物扩增效率较低，但是在前几轮循环中还是可以扩增少量的目标基因片段，并且扩增出的片段两端已经加长了tag以及其互补序列对应核苷酸。随后纯化PCR产物，去除引物，仅留下少量扩增得到的加入了tag的片段，避免剩余引物在第二步扩增过程中的干扰。然后以此为模板，以tag序列作为引物进行第二步PCR。因第二步PCR引物不含简并，长度适中，情况和普通的PCR一样，所以能把上一轮PCR的产物大量扩增。如果在tag序列5‘端加barcode序列的话，可根据barcode序列来区分不同样品来源序列，所以可同时通过高通量测序来分析大量样品。综上，这种加tag的简并引物两步PCR方法在兼顾扩增效率的前提下提高了引物覆盖度。

加tag简并引物的两步法PCR是对传统的一步法PCR的改进。加tag的简并引物的两步法PCR也可以应用于其他功能基因相关环境微生物群落结构研究，如硫酸盐还原菌，硝化细菌，反硝化细菌，产甲烷菌等对生态环境中起重要作用的功能微生物类群；并能在此过程中发现一些以前未发现过的功能微生物种类。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能准确同时反映环境样品中氨氧化或甲烷氧化相关细菌的群落结构的分析方法。

本发明提供的关于微生物群落结构的分析方法，是对环境样品抽提DNA后，使用加tag的简并引物和tag引物对环境样品DNA进行两步法PCR扩增，并通过测序分析其菌群组成。具体步骤如下：

（1）设计能覆盖大部分氨氧化或甲烷氧化细菌pmoA/amoA相关基因的高简并加tag引物，具体来说：

a.确定检测的目的基因，查找相关数据，在pmoA/amoA相关基因的上下游保守区域设计高覆盖度高简并引物，使之能覆盖大多数相关的微生物类群；

b.在所设计上下游引物序列的5’端各连接一段长为15-25个碱基的核苷酸序列，该序列要避免与样品DNA结合，称之为tag序列；

（2）使用高简并加tag的引物对环境样品DNA进行PCR扩增；

（3）将PCR产物进行纯化，去除未参加反应的剩余的引物；

（4）将纯化产物作为模板，使用tag序列作为新的引物进行第二步PCR；如果要将多个样品同时进行高通量测序分析，可在tag序列5‘端加6-10碱基barcode序列来区分不同样品；

（5）对PCR产物进行相关的分子生物学分析（包括测序或指纹图谱分析），得到该环境样品的基于某特定基因的相关微生物群落结构信息。

本发明中，所设计的高简并引物，是从数据库下载相关各类微生物的目的功能基因序列信息，进行比对，并在基因上下游找到对各类微生物相对保守的位点，然后设计简并引物提高覆盖度。

本发明中，所述tag序列要求与模板DNA不匹配，无其它要求，可以自主设计，其目的是为了给第二轮PCR引入引物结合区。

本发明中，所述使用高简并加tag的引物对环境样品进行PCR，也就是两步法PCR中的第一步PCR，对PCR的体系和程序并没有特殊要求，循环数可以比较少，一般为2-10。经过摸索对大部分环境样品适用的循环数为10。

本发明中，所述PCR产物进行纯化，可以使用PCR体系纯化试剂盒，其目的是去除第一步PCR反应中没有参加反应的的加tag简并引物。

本发明中，所述tag序列作为新的引物进行第二轮的PCR，直接使用tag序列作为普通引物，对PCR体系和程序没有特殊要求，一般循环数为20-40，典型的循环数为35。

本发明中，所述对PCR产物进行相关的分子生物学分析，包括对PCR产物的测序和序列分析，这些步骤均与常规的基于PCR扩增的研究微生物群落结构和多样性的分子生物学方法一样。

本发明使用加tag的简并引物的两步法PCR方法，可以显著提高引物覆盖度以及PCR效率，是对常规的基于PCR扩增的研究MOB/AOB相关微生物群落结构和多样性的分子生物学方法的改进。

本方法也可应用于其它功能微生物群落结构分析。

本发明具有以下优点：

（1）本发明可以显著提高引物覆盖度。加入了简并的引物可以覆盖更多的微生物类群，提高保守程度比较低的目的基因的扩增效果，同时由于引物覆盖度的提高，该方法也具有发现新的微生物类群甚至新的功能基因的潜力；

（2）本方法可以保持PCR效率。使用tag作为引物进行的第二步PCR由于引物中不含简并，所以PCR效率可以得到保障，对丰度比较低的基因/微生物类群依然可以扩增得到。

附图说明

图1为简并引物加tag两步法扩增的原理图示。

图2为加tag简并引物的两步法PCR（纯化/未纯化）以及常规的一步法PCR应用于环境样品DNA的电泳照片。左右两边泳道为D2000marker，中间的泳道分为3组，自左起分别为两步法PCR纯化，两步法PCR不纯化和一步法PCR。各组内顺序左起为A光滩表土(tidalflat)，B湖泊沉积物(lakesediment)，C水稻田土(paddysoil)，D垃圾填埋场表土(landfill)以及N阴对照(negativecontrol)。

图3为用质粒混合样品检验加tag简并引物的两步法PCR保真性结果。其中，横坐标表示混合物中每种质粒的浓度，纵坐标表示测序得到的序列数在混合物中的比例。4种颜色表示4个混合物，4种形状表示4种质粒。

图4是将加tag简并引物的两步法PCR和常规一步法PCR应用于环境样品的细菌群落结果比较。分别为对高原土壤(mountainsoil)，稻田土壤(paddysoil)，淡水河沉积物(riversediment)以及海水(coastalwater)这4种样品的扩增结果，柱形的高度对应该样品含有的该类型微生物的数量。

具体实施方式

使用两步法PCR对多种环境样品进行甲烷氧化相关微生物多样性分析。

1．设计第一步PCR的引物，即针对pmoA/amoA相关基因的高简并加tag引物(引物方向5’→3’)

forward:A189-tag:GCCGGAGCTCTGCAGATATCGGNGACTGGGACTTCTGG（SEQIDNO.1）；

reverse:mb616-tag:GCCGGAGCTCTGCAGATATCAYCWKVCKNAYRTAYTCVGG（SEQIDNO.2）。

2．设计第二步PCR的引物，即tag

tag:（5’-GCCGGAGCTCTGCAGATATC-3’）（SEQIDNO.3）注：第二步PCR的forward和reverse引物相同，均为tag序列。

3．第一步PCR体系以及程序

PCR试剂盒2×TaqPCRMasterMix(TIANGEN)；

PCR扩增采用50μL体系，包括：2×TaqPCRMasterMix25μL，引物A189f-tag和mb616-tag（终浓度0.2μM)，环境样品基因组DNA。

PCR循环程序为:

表1加tag简并引物的两步法PCR中第一步PCR循环程序。

4．PCR产物的纯化

这一步的目的是去除第一步PCR中剩余的简并引物，仅仅保留扩增出来的序列作为第二步的模板，以免引物二聚体影响第二步PCR的扩增效率。

使用MOBIO公司的UltraCleanPCRClean-upKit，简略步骤如下：

（1）在PCR体系中加入5倍体积的spinbind溶液；

（2）混匀，将所有液体转移到过滤柱（spinfilter）中；

（3）10000g离心30s，弃滤液；

（4）加入300μLspincleanbuffer；

（5）10000g离心30s，弃滤液；

（6）过滤柱放回离心管，10000g离心1min；

（7）过滤柱放入干净的2mL离心管，在过滤柱中央小心地加入50μLelutionbuffer；

（8）10000g离心1min；

（9）弃过滤柱，PCR纯化产物已经溶于离心管底部的elutionbuffer中。

该步骤结束后第一步PCR的产品溶解为50μL的体系，从中取出2μL作为第二步PCR的模板。

5．第二步PCR体系以及程序

PCR试剂盒2×TaqPCRMasterMix(TIANGEN)

PCR扩增采用50μL体系，包括：2×TaqPCRMasterMix25μL，引物tag（5’-GCCGGAGCTCTGCAGATATC-3’），在应用于高通量测序的环境样品时，在tag序列的5’端增加8碱基的barcode序列以区分样品。Tag-barcode同时作为正向以及反向引物（终浓度0.4μM)，模板为纯化后的第一步PCR产物2μL

表2加tag简并引物的两步法PCR中第二步PCR循环程序。

6．常规一步法扩增pmoA基因

PCR试剂盒2×TaqPCRMasterMix(TIANGEN)

PCR扩增采用50μL体系，包括：2×TaqPCRMasterMix25μL，引物A189f（5’-GGNGACTGGGACTTCTGG-3’）（SEQIDNO.4）和mb661（5’-CCGGMGCAACGTCYTTACC-3’）（SEQIDNO.5）（终浓度0.2μM，若应用于混合样品的高通量测序，在这对引物5’端增加区分样品的barcode)，加环境样品基因组DNA。

PCR循环程序为:

表3A198f/mb661r扩增pmoA基因PCR循环程序。

7．加tag简并引物的两步法PCR的效果的电泳检测

将第二步所得的PCR产物与针对基因pMMO常规的一步法PCR产物（引物对为A198f/mb661r，样品为A光滩表土，B湖泊沉积物，C水稻田土，D垃圾填埋场表土和N对照组）进行电泳检测（图2），可以发现中间有纯化步骤的两步法有清晰条带，而不纯化的两步法和常规一步法没有条带或者弥散很明显，可见两步法PCR提高了引物覆盖度，使得一步法不能覆盖的类群可以扩增出来。第一步PCR结束后的纯化步骤能去除第一步PCR剩余引物对第二步PCR的干扰，是十分必要的。

8．加tag简并引物的两步法PCR的保真性检验

为了检验加tag简并引物进行两步法PCR的保真性，也就是该方法扩增得到的序列各个类群的比例能否体现样品中对应模板的比例，我们将α变形菌纲的甲烷氧化微生物，β变形菌纲的氨氧化微生物，特殊的甲烷氧化类群Crenothrix，以及γ变形菌纲的甲烷氧化微生物的pmoA/amoA相关基因构建入pMD18-T载体并依次将这4种载体命名为α-pmoA，amoA，crenothrix和γ-pmoA。将它们按照4种特定比例混合（图3），将质粒混合样品进加tag简并引物的两步法PCR后测序，4个混合体系测序得到序列数分别为901条，1687条,960条和539条。将测序结果中4种质粒的比例与已知样品进行比较（图3），表明加tag简并引物的两步法PCR可以比较真实的反应原样品中不同类群的比例关系。

9．加tag简并引物的两步法PCR应用于多个环境样品的结果

由于加tag简并引物的两步法PCR的保真性比较理想，所以我们把该方法用于高原湿地土壤，稻田土壤，淡水河沉积物以及海水这4种环境样品，并与常规的一步法PCR（引物对为A198f/mb661r）进行比较，将两种PCR方法得到的序列进行454高通量测序，得到有效序列共9008条，将序列进行NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）本地BLAST后使用MEGAN软件（http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan5/）分析不同样品的甲烷氧化/氨氧化相关微生物群落结构(图4)，可以看到一步法PCR只能扩增到α变形菌纲和γ变形菌纲的甲烷氧化菌pmoA基因，而两步法PCR可以在覆盖上述两种类型的前提下，还能扩增到包括各种氨氧化细菌（如，亚硝化单胞菌，亚硝化螺菌），并且能包括奇异甲烷氧化细菌crenothrix，乙烷氧化相关Gram阳性菌。可见加tag简并引物的两步法PCR显著的提高了引物覆盖度。

<110>复旦大学

<120>基于两步法PCR的甲烷/氨氧化细菌群落结构分析方法

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