一种基于荧光定量法的下箴刺桐碱浓度测量方法

技术领域

本发明属于分子测量领域，特别涉及一种基于荧光定量法的下箴刺桐碱浓度测量方法。

背景技术

下箴刺桐碱又名海帕刺桐碱，CAS号487-58-1，分子式C₁₄H₁₈N₂O₂，是豆科相思子属和刺 桐属植物中常见的生物碱。下箴刺桐碱能明显抑制小鼠耳廓肿胀，减少小鼠耳廓重量；增加 小鼠胸腺、脾脏重量，提高小鼠血清溶血素水平；明显降低CCl₄和异硫氰酸萘酯所致的肝损 伤小鼠血清转氨酶活性及胆红素含量，保护肝损伤。小鼠实验提示海帕刺桐碱具有明显的抗 炎、增强免疫和降酶退黄、抗肝损伤作用，是鸡骨草等药材的有效成分之一，下箴刺桐碱的 结构与植物生长激素之一的生长素相似，均含吲哚基，但却是生长素拮抗剂，通过抑制植物 根毛的伸长而发挥作用。

色氨酸分子含有吲哚基，结构与下箴刺桐碱、生长素的相似，微溶于乙醇，不溶于氯仿、 乙醚，在稀酸或稀碱中溶解。

生长素、色氨酸、下箴刺桐碱的定量方法主要是液相色谱法、毛细管电泳法和酶连免疫 分析法。但这些方法存在仪器较贵或者检测费用高、样品处理步骤比较复杂、消耗时间比较 长等局限。

荧光光谱法是利用物质吸收较短波长的光波后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定 性或定量分析的方法，该方法灵敏度高，选择性强。

色氨酸的定量很早就已经运用荧光方法，通常用三氯醋酸除去蛋白质后添加甲醛与三氯 化铁使色氨酸的荧光衍产物生成后以激发波长350nm，发射波长450nm进行测量，作用原理是 色氨酸与甲醛缩合成环状，经三氯化铁氧化成荧光较强的去甲哈尔曼，但此法也没有考虑生 长素和下箴刺桐碱等其他含吲哚基物质对测定结果的影响。

下箴刺桐碱、色氨酸、生长素分子内都含吲哚基，均具天然荧光。单独存在时，各自的 荧光强度与其浓度具有良好的线性关系，但三者的荧光光谱几乎完全重叠，当激发波长280nm 时发射波长为350nm，因此三者混合时无法直接用荧光光谱法分别定量，虽然根据三者的的 亲水性可以用有机溶剂(乙酸乙酯)将生长素分离，但下箴刺桐碱与色氨酸的亲水性非常接 近，无法用常见的溶剂进行萃取分离，这样，在下箴刺桐碱的定量过程中，色氨酸成了一种 难以除去的杂质。

发明内容

本发明为在色氨酸杂质存在条件下一种基于荧光定量法的下箴刺桐碱浓度测量方法，其 前处理时间短、检测成本低、能快速大批量检测。

实现本发明目的的技术方案是：

一种基于荧光定量法的下箴刺桐碱浓度测量方法，包含如下步骤：

1)配制色氨酸标准溶液，绘制色氨酸标准曲线；

2)配制色氨酸标准溶液与下箴刺桐碱标准溶液，测定标准混合溶液的荧光强度，绘 制混标准合液的标准曲线；计算混合标准溶液中色氨酸质量浓度(A)与下箴刺桐碱 质量浓度(B)的比值U(U＝A/B)

3)线性关系曲线1的绘制

4)线性关系曲线2的绘制

5)推导下箴刺桐碱的浓度的计算公式

6)下箴刺桐碱溶液浓度的确定

步骤1)中配制一定浓度梯度的色氨酸溶液，测定其荧光强度，以浓度值为横坐标，对 应各浓度值的荧光强度为纵坐标绘制色氨酸溶液标准曲线；

步骤2)中配制色氨酸标准溶液与下箴刺桐碱标准溶液，并按一定体积比混合，计算混 合标准溶液中色氨酸质量浓度A与下箴刺桐碱质量浓度B的比值U并记录；

步骤3)中测定标准混合溶液的荧光强度X，空白对照组(蒸馏水)的荧光强度为X₀， 在试管中分别滴加甲醛，静置1小时，再测定添加甲醛后的混合溶液的荧光强度Y，空 白对照组(蒸馏水中滴加甲醛)的荧光强度为Y₀，

W＝Y/X(1)

式中W为横坐标，以色氨酸与下箴刺桐碱的质量浓度之比U为纵坐标，得到线性关系 曲线1；

步骤4)中使用步骤2)试管中色氨酸质量浓度在步骤1)中对应的荧光强度值记为Z， 空白对照组如蒸馏水的荧光强度为Z₀，计算减去空白值后的值Z′与减去空白值后的不 添加甲醛的色氨酸荧光强度值X′之比V，以每只试管添加甲醛与不添加甲醛的测量值 之比W′为横坐标，以V为纵坐标，得线性关系曲线2；

步骤5)中色氨酸标准曲线线性方程为

T′＝mA+n(2)

线性关系曲线1的线性方程为

U＝kW+j(3)

线性关系曲线2的线性方程为

V＝pW＇+q(4)

推导下箴刺桐碱的浓度ρ的计算公式为

ρ＝[V(X－X₀)－n]/mU(5)

即：

$\rho =\frac{[p(Y-Y_0)/(X-X_0)+q](X-X_0)-n}{m(kY/X+j)}---\left(6\right)$

其中X为不添加甲醛测得的待测液荧光强度，Y为添加甲醛后待测液的荧光强度，X₀、 Y₀分别为添加甲醛前后空白对照的荧光强度，ρ的浓度单位与测定色氨酸标准曲线时A 的单位相同，ρ的单位为μg/L。公式(6)的建立；

步骤6)中取1份体积的待测下箴刺桐碱溶液，加9份pH7.4磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓 冲溶液，试测此稀释液的荧光强度，荧光强度应在1000至4000范围内，若荧光强度过 高，可再适当稀释,并记录稀释倍数；测得合适的荧光强度X后，按步骤5)中的公式计 算出稀释后下箴刺桐碱溶液的浓度，再根据稀释倍数，计算出原溶液中下箴刺桐碱的浓 度。

有益效果

本发明为一种基于荧光定量法的下箴刺桐碱浓度测量方法，能直接用荧光光谱法在色氨 酸杂质存在条件下定量下箴刺桐碱的荧光量，避免色氨酸杂质对测试结果的影响，本法前处 理时间短、检测成本低、能快速大批量检测。

附图说明

图1为添加等体积的浓度为40％甲醛前后，下箴刺桐碱溶液的荧光光谱；

图2为添加等体积的浓度为40％甲醛前后，色氨酸溶液的荧光光谱；

图3为色氨酸的荧光标准曲线；

图4为线性关系曲线1；

图5为线性关系曲线2。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的阐述，但不是对本发明的限定。

实施例

一种基于荧光定量法的下箴刺桐碱浓度测量方法，包含如下步骤：

1)配制色氨酸标准溶液，绘制色氨酸标准曲线；

2)配制色氨酸标准溶液与下箴刺桐碱标准溶液，测定标准混合溶液的荧光强度，绘制混标 准合液的标准曲线；计算混合标准溶液中色氨酸质量浓度A与下箴刺桐碱质量浓度B的 比值U

3)线性关系曲线1的绘制

4)线性关系曲线2的绘制

5)推导下箴刺桐碱的浓度的计算公式

6)下箴刺桐碱溶液浓度的确定

步骤1)中配制一定浓度梯度的色氨酸溶液，测定其荧光强度，以浓度值为横坐标，对应各 浓度值的荧光强度为纵坐标绘制色氨酸溶液标准曲线；

步骤2)中配制色氨酸标准溶液与下箴刺桐碱标准溶液，并按一定体积比混合，计算混合标 准溶液中色氨酸质量浓度A与下箴刺桐碱质量浓度B的比值U并记录；

步骤3)中测定标准混合溶液的荧光强度X，空白对照组(蒸馏水)的荧光强度为X₀，在试 管中分别滴加甲醛，静置1小时，再测定添加甲醛后的混合溶液的荧光强度Y，空白对照组 (蒸馏水中滴加甲醛)的荧光强度为Y₀，

W＝Y/X(1)

式中W为横坐标，以色氨酸与下箴刺桐碱的质量浓度之比(U)为纵坐标，得到线性关系 曲线1；

步骤4)中使用步骤2)试管中色氨酸质量浓度在步骤1)中对应的荧光强度值记为Z，空白 对照组如蒸馏水的荧光强度为Z₀，计算减去空白值后的值Z′与减去空白值后的不添加甲醛 的色氨酸荧光强度值X′之比V，以每只试管添加甲醛与不添加甲醛的测量值之比W′为横 坐标，以V为纵坐标，得线性关系曲线2；

步骤5)中色氨酸标准曲线线性方程为

T′＝mA+n(2)

线性关系曲线1的线性方程为

U＝kW+j(3)

线性关系曲线2的线性方程为

V＝pW＇+q(4)

推导下箴刺桐碱的浓度ρ的计算公式为

ρ＝[V(X－X₀)－n]/mU(5)

即：

$\rho =\frac{[p(Y-Y_0)/(X-X_0)+q](X-X_0)-n}{m(kY/X+j)}---\left(6\right)$

其中X为不添加甲醛测得的待测液荧光强度，Y为添加甲醛后待测液的荧光强度，X₀、 Y₀分别为添加甲醛前后空白对照的荧光强度，ρ的浓度单位与测定色氨酸标准曲线时A 的单位相同，ρ的单位为μg/L。公式(6)的建立；

步骤6)中取1份体积的待测下箴刺桐碱溶液，加9份pH7.4磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓 冲溶液，试测此稀释液的荧光强度，荧光强度应在1000至4000范围内，若荧光强度过 高，可再适当稀释,并记录稀释倍数；测得合适的荧光强度X后，按步骤5)中的公式计 算出稀释后下箴刺桐碱溶液的浓度，再根据稀释倍数，计算出原溶液中下箴刺桐碱的浓 度。

下箴刺桐碱与色氨酸都具有天然荧光，在添加等体积的甲醛(浓度为40％)前后，下箴 刺桐碱溶液的荧光光谱如图1所示，可见荧光强度降低了一半。在添加等体积的甲醛(浓度 为40％)前后，色氨酸溶液的荧光光谱如图2所示，可见荧光强度基本不变(虽然浓度已经 下降一半)。本发明专利依据此现象进行下箴刺桐碱的荧光定量，且实验过程中发现，在测量 线性关系1时，不减去空白对照值时线性关系较好；在测量线性关系2时，减去空白对照值 时线性关系较好。具体操作如下。

实施例1

1.绘制色氨酸标准曲线

配制10mg/L的色氨酸标准溶液；取6只试管，一只作为空白对照，另外5只分别滴加 1μL、2μL、3μL、4μL、5μL的色氨酸标准溶液；分别滴加100μL的pH7.4磷酸氢二钠/ 磷酸二氢钠缓冲溶液；用蒸馏水定容至1ml，分别测定其荧光强度(激发波长280nm，发射 波长350nm)，结果如表1所示，空白对照组(蒸馏水)的荧光强度Z₀＝489；以色氨酸质量 浓度A为横坐标，减去空白后的相对荧光强度T′为纵坐标，绘制出色氨酸标准曲线，结果 如图3所示。

表1

2标准混合溶液配制

配制10mg/L的色氨酸标准溶液与10mg/L的下箴刺桐碱标准溶液；取25只试管，按表 2所示浓度滴加两种标准溶液，计算混合标准溶液中色氨酸质量浓度A与下箴刺桐碱质量浓 度B的比值U(该浓度为定容到1mL后的浓度)。

表2

3.测定

表2各试管分别滴加pH7.4的100μL磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液；用蒸馏水定容至 1mL，分别测定其荧光强度X(激发波长280nm，发射波长350nm)；把测定色氨酸标准曲线 时的空白试管并入表2试管组(共26只细管)，在26只试管中分别滴加1mL甲醛(浓度为 40％)，静置1小时，再分别测定其荧光强度Y(激发波长280nm，发射波长350nm)。测定 所得荧光强度数据如表3所示。空白对照组的荧光强度X₀＝489，Y₀＝515。

表3

4.线性关系曲线1的绘制

计算每只试管添加甲醛前后的测量值之比W；以W为横坐标，以色氨酸与下箴刺桐碱的 质量浓度之比(U)为纵坐标，得线性关系曲线1，如图4所示。

5.线性关系曲线2的绘制

25只试管中色氨酸质量浓度对应的荧光强度值记为Z，计算出减去空白值后的此值Z′ 与减去空白值后不添加甲醛的荧光强度值X′之比V；以每只试管添加甲醛前后的测量值之 比W′为横坐标，以V为纵坐标，得线性关系曲线2，如图5所示。计算数据如表4所示。

表4

6.公式

记前后两次测量值为X，Y；前后两次测量的空白值为X₀，Y₀

记色氨酸标准曲线线性方程为

T′＝mA+n

记线性关系曲线1的线性方程为

U＝kW+j

记线性关系曲线2的线性方程为

V＝pW＇+q

则下箴刺桐碱的浓度ρ为

ρ＝[V(X－X₀)－n]/mU

即

$\rho =\frac{[p(Y-Y_0)/(X-X_0)+q](X-X_0)-n}{m(kY/X+j)}$

其中X为不添加甲醛测得的待测液荧光强度，Y为添加甲醛后待测液的荧光强度，X₀、 Y₀分别为添加甲醛前后空白对照的荧光强度。ρ的浓度单位与测定色氨酸标准曲线时A的单 位相同。

在本实施例中

$\rho =\frac{[0.53(Y-Y_0)/(X-X_0)-0.14](X-X_0)+20}{5.48(11.15Y/X-5.23)}$

ρ的单位为μg/L。

7.对未知溶液的测定

取未知溶液900μL，滴加100μL的pH7.4磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液，试测其荧 光强度X(本发明适用荧光强度范围为1000至4000)，若强度过高，可进行适当的稀释，之 后再取900μL，添加100μL的pH7.4磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液进行测量；滴加1mL 甲醛(浓度为40％)，静置1小时后测定其荧光强度Y；滴加甲醛前后的空白对照值分别为 X₀，Y₀；直接由公式计算出下箴刺桐碱的浓度。

把色氨酸标准液与下箴刺桐碱标准液配制成若干比例不同的混合液，用本发明方法进行 测量，平均回收率为98％。

实施例2

彩色豆马勃菌丝浸出液中的下箴刺桐碱与色氨酸含量测定

彩色豆马勃是一种能合成下箴刺桐碱的真菌，其浸出液先经氯仿与乙酸乙酯萃取，去除 吲哚乙酸。取水相900μL，滴加100μL的pH7.4磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液后，进行 试测(激发波长280nm，发射波长350nm)，测得荧光强度为X＝3081，位于本发明的适用范 围。滴加1mL甲醛后，静置1小时，测得荧光强度Y＝2013。空白对照X₀＝419，Y₀＝525；代 入公式可得，刺桐碱的浓度为38.71μg/L，在900μL待测液中的质量为3.87×10^-8g。

以上实施例中的测量均采用日立F-7000荧光分光光度计，电压450V，狭缝10nm。考 察共存离子对10μg/L浓度的下箴刺桐碱与色氨酸的影响，当相对误差在±5％的范围内，共 存离子允许量(μg/L)：Cu²⁺(2)、Fe³⁺(36)、Mn²⁺(75)、Na⁺(4000)、Mg²⁺(2500)、K⁺(4000)、Ca²⁺(1250)、Zn²⁺(3000)、Cl^－(2800)、SO₄^2－(5000)、CO₃^2－(4000)。吲哚乙酸的荧 光光谱与下箴刺桐碱、色氨酸相似，会严重影响测量，可通过乙酸乙酯萃取去除。酪氨酸与 苯丙氨酸均有天然荧光，但酪氨酸与苯丙氨酸的荧光比色氨酸弱，且荧光发射峰非350nm， 在本发明方法的测量范围内，与待测色氨酸浓度相似的这两种氨基酸不会影响测量。其他的 氨基酸无天然荧光，不影响测量。对于其他的常见物质，只要没有天然荧光，一般不会对本 发明方法造成影响。