CCN1（Cyr61）在治疗皮肤损伤及皮肤萎缩相关疾病中的应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体地说，是CCN1(Cyr61)在治疗皮肤损 伤及皮肤萎缩相关疾病中的应用。

背景技术

皮肤创面可以大致分为两类，一类是由创伤、烫伤、烧伤、手术、感染等 造成的急性皮肤创面，第二类是由糖尿病及各种慢性疾病引起的皮肤溃疡及各 种皮肤难愈性创面。中国国家统计局数据显示，2013年我国住院手术人次达 3982.76万人次，术后伤口亟需有效的护理。据WHO统计，2014年全球18 岁以上人口中有9％患有糖尿病，有13％患有肥胖症。随着全球人口老龄化的 进程以及糖尿病、肥胖等各种慢性疾病的增加，导致慢性皮肤伤口的治疗成为 很大的一个社会经济负担。

皮肤创伤愈合是一个极其复杂的过程，涉及到多种细胞，细胞因子以及细 胞外基质的协同作用以及精细的调控。皮肤创伤愈合的过程主要分为四个时 期：血栓形成期、炎性渗出期，细胞增殖期，组织重塑期(Sun,B.K.,Z.Siprashvili, andP.A.Khavari,Advancesinskingraftingandtreatmentofcutaneouswounds. Science,2014.346(6212):p.941-5.)。在增殖期，角质形成细胞以及巨噬细胞等 分泌EGF、FGF、PDGF、TGF-b等生长因子促进表皮细胞的增殖(Enyedi,B.and P.Niethammer,Mechanismsofepithelialwounddetection.TrendsCellBiol,2015. 25(7):p.398-407.)。最新的研究表明，创面的治疗主要着重于营养支持、戒烟、 血液灌注、创面引流、控制感染以及机械保护几个方面。主要理念是要通过敷 料维持创面处在一个洁净并且湿润的环境下，来加速创面的再上皮化以及改善 炎症环境来帮助创面愈合(Sen,C.K.,etal.,Humanskinwounds:amajorand snowballingthreattopublichealthandtheeconomy.WoundRepairRegen,2009. 17(6):p.763-71.)。

皮肤萎缩是由于多种因素导致的生理性或病理性的皮肤组织退行性变，主 要为皮肤营养障碍所致的全部或部分皮肤组织减少或缩小及功能障碍的一种 现象。皮肤萎缩的病理变化一般为表皮变薄，棘细胞层萎缩，表皮突变平。真 皮变薄，胶原纤维呈均质化变性，弹力纤维碎裂、稀少；皮肤附属器如毛囊、 汗腺和皮脂腺也萎缩，并且伴发皮肤功能障碍。

CCN1(Cyr61)是一种细胞外基质的蛋白，最早被用来包被细胞培养皿， 从而促进细胞的生长(Grzeszkiewicz,T.M.,etal.,CYR61stimulateshumanskin fibroblastmigrationthroughIntegrinalphavbeta5andenhancesmitogenesis throughintegrinalphavbeta3,independentofitscarboxyl-terminaldomain.JBiol Chem,2001.276(24):p.21943-50.)。各种生长因子、机械张力、紫外线等都可 促进组织中CCN1的表达(Chen,C.C.andL.F.Lau,Functionsandmechanismsof actionofCCNmatricellularproteins.IntJBiochemCellBiol,2009.41(4):p. 771-83.)。近几年的研究表明，CCN1蛋白通过与不同整合素结合从而发挥促 进细胞增殖、分化、迁移以及血管化、上皮间质转化的不同作用(Lau,L.F., CCN1/CYR61:theverymodelofamodernmatricellularprotein.CellMolLifeSci, 2011.68(19):p.3149-63.Leu,S.J.,S.C.Lam,andL.F.Lau,Pro-angiogenic activitiesofCYR61(CCN1)mediatedthroughintegrinsalphavbeta3and alpha6beta1inhumanumbilicalveinendothelialcells.JBiolChem,2002.277(48): p.46248-55.Li,Z.Q.,etal.,Cyr61/CCN1isregulatedbyWnt/beta-catenin signalingandplaysanimportantroleintheprogressionofhepatocellularcarcinoma. PLoSOne,2012.7(4):p.e35754.)。也有研究显示，CCN1具有抑制成纤维细胞 的过度增殖，从而抑制组织纤维化及瘢痕形成的作用(Jun,J.I.andL.F.Lau,The matricellularproteinCCN1inducesfibroblastsenescenceandrestrictsfibrosisin cutaneouswoundhealing.NatCellBiol,2010.12(7):p.676-85.Quan,T.,etal., Cysteine-richprotein61(CCN1)mediatesreplicativesenescence-associated aberrantcollagenhomeostasisinhumanskinfibroblasts.JCellBiochem,2012. 113(9):p.3011-8.Borkham-Kamphorst,E.,etal.,Theanti-fibroticeffectsof CCN1/CYR61inprimaryportalmyofibroblastsaremediatedthroughinductionof reactiveoxygenspeciesresultingincellularsenescence,apoptosisandattenuated TGF-betasignaling.BiochimBiophysActa,2014.1843(5):p.902-14.)。这些结果 均提示，CCN1蛋白在创伤愈合及治疗皮肤萎缩性疾病中可能具有的重要作用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种以Cyr61基因 /CCN1(Cyr61)蛋白作为药物作用靶点的药物在制备治疗皮肤损伤及皮肤萎缩 相关疾病药物中的应用。

本发明的再一的目的是，提供一种含重组人CCN1蛋白的凝胶制剂以及一 种含重组人CCN1蛋白的注射针剂，为药物开发的主要制剂。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：以Cyr61基因作为药物作用 靶点的药物在制备治疗皮肤损伤及皮肤萎缩相关疾病药物中的应用。

以CCN1(Cyr61)蛋白作为药物作用靶点的药物在制备治疗皮肤损伤及 皮肤萎缩相关疾病药物中的应用。

Cyr61基因序列如SEQIDNO.1所示。

CCN1(Cyr61)蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

CCN1(Cyr61)蛋白的氨基酸序列包括四个结构域，四个结构域的氨基酸 序列分别为SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6。

所述的皮肤损伤相关疾病包括：皮肤急性损伤，皮肤慢性损伤和其他皮肤 损伤相关疾病及应用。

所述的皮肤急性损伤包括但不限于因创伤、烧伤、烫伤、冷伤、咬蛰伤、 感染等引起的皮肤损伤。

所述的皮肤慢性损伤包括但不限于因糖尿病、肥胖、营养不良、慢性感染、 免疫因素等引起的慢性皮肤溃疡及其他类型的皮肤损伤。

所述的其他皮肤损伤包括但不限于放射性溃疡，药物引起的皮肤损伤，机 械张力引起的皮肤损伤，以及其他各种原因引起的皮肤创面，皮肤溃疡、糜烂 等。

所述的皮肤萎缩相关疾病包括：生理性皮肤萎缩(如衰老性皱纹)，机械 张力诱导的皮肤萎缩，药物所致的皮肤萎缩以及其他皮肤萎缩性疾病。

所述的应用范围主要在于促进皮肤创面愈合以及皮肤增殖方面的应用，主 要针对皮肤创面、溃疡、糜烂、萎缩。而不包括皮肤增殖性疾病的应用如皮肤 肿瘤等恶性疾病、银屑病、炎性增生性疾病等。

所述的以Cyr61基因或CCN1(Cyr61)蛋白作为药物靶点的药物是干预 Cyr61基因或CCN1(Cyr61)蛋白的表达与功能的激动剂或CCN1(Cyr61) 重组蛋白。

所述的干预Cyr61基因或CCN1(Cyr61)蛋白的表达与功能的激动剂是 指：以慢病毒、腺病毒、质粒作为载体构建的Cyr61基因过表达体系、小分子 激动剂、多肽激动剂等；所述的CCN1(Cyr61)重组蛋白是指：基于氨基酸 序列SEQIDNO.2合成的重组蛋白，或基于SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQ IDNO.5、SEQIDNO.6四个结构域中，任何一个或多个结构域的氨基酸序列 合成的重组蛋白。

所述的以Cyr61基因或CCN1(Cyr61)蛋白作为药物作用靶点的药物可 以促进哺乳动物表皮细胞增殖及去分化，并且可以促进真皮中胶原的合成与分 泌，从而促进皮肤创伤愈合及缓解皮肤萎缩之症状。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种组合物，所述的组合物包括药学上可接受的载体和CCN1(Cyr61) 重组蛋白；所述的CCN1(Cyr61)重组蛋白是指：基于氨基酸序列SEQIDNO.2 合成的重组蛋白，或基于SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQID NO.6四个结构域中，任何一个或多个结构域的氨基酸序列合成的重组蛋白。

所述的载体包括但不限于脂质体、壳聚糖、微乳等。

一种凝胶制剂，所述凝胶剂的制备方法为：以重组人CCN1蛋白(rhCCN1) 为主要生物活性成分，混合以人血白蛋白、甘油、羟甲基纤维素钠、卡波姆、 注射用水等制成凝胶制剂；所述的CCN1(Cyr61)重组蛋白是指：基于氨基 酸序列SEQIDNO.2合成的重组蛋白，或基于SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、 SEQIDNO.5、SEQIDNO.6四个结构域中，任何一个或多个结构域的氨基酸 序列合成的重组蛋白。

所述的人血白蛋白为0.01％-0.1％人血白蛋白(质量体积比，w/v)；所述 的甘油为1％-20％甘油(体积体积比，v/v)；所述的羟甲基纤维素钠为0.01％-2％ 羟甲基纤维素钠(质量体积比，w/v)；所述的卡波姆为0.1％-2％卡波姆(质量 体积比，w/v)。

一种注射针剂，所述注射针剂的制备方法为：以重组人CCN1蛋白 (rhCCN1)为主要生物活性成分，混合以人血白蛋白、甘油、甘露醇、注射 用水等开发为注射针剂；所述的CCN1(Cyr61)重组蛋白是指：基于氨基酸 序列SEQIDNO.2合成的重组蛋白，或基于SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQ IDNO.5、SEQIDNO.6四个结构域中，任何一个或多个结构域的氨基酸序列 合成的重组蛋白。

所述的人血白蛋白为0.01％-0.1％人血白蛋白(质量体积比，w/v)；所述 的甘油为1％-20％甘油(体积体积比，v/v)；所述的甘露醇为0.1-10％甘露醇(质 量体积比，w/v)。

所述的组合物、凝胶制剂或注射针剂在制备经皮给药及皮内给药重组蛋白 药物中的应用。

所述的经皮给药及皮内给药重组蛋白药物是治疗皮肤损伤及皮肤萎缩相 关疾病的药物中的应用。

本发明优点在于：

1、本发明提供了一种利用重组CCN1(Cyr61)蛋白治疗各种临床疾患的 方法。这些疾患包括(1)皮肤损伤相关疾病，包括不限于：由创伤、烫伤、 烧伤、手术造成的皮肤损伤，糖尿病及各种慢性疾病引起的皮肤溃疡及各种皮 肤难愈性创面；(2)皮肤萎缩相关疾病，包括但不限于：生理性皮肤萎缩(如 衰老性皱纹)，机械张力诱导的皮肤萎缩，药物所致的皮肤萎缩以及其他皮肤 萎缩性疾病。

2、通过干预细胞外基质蛋白CCN1，从而调节组织再生能力。一个实例 是使用重组人CCN1(Cyr61)蛋白，显著促进了表皮细胞增殖及去分化，刺 激了胶原新生，增加皮肤厚度，加快了皮肤组织修复与再生。从而说明，使用 重组人CCN1(Cyr61)蛋白能够促进皮肤创面愈合，改善皮肤萎缩。

附图说明

图1：角质形成细胞在rhCCN1(0.2mg/ml)干预72小时后，通过细胞免 疫荧光技术检测Ki67的表达(绿色：Ki67；蓝色：DAPI)。图1A、B可以看 出rhCCN1干预后Ki67表达明显升高，这代表细胞增殖活跃。图1C为细胞凋 亡的流式检测，rhCCN1干预后，角质细胞抗早期凋亡的能力明显增高，细胞 活力增加。

图2：细胞免疫荧光结果中可以看出，在rhCCN1干预后，角质形成细胞 Vimentin表达显著升高，Ecadherin表达降低(图2A)(绿色：Vimentin；红色： Ecadherin蓝色：DAPI)。在WesternBlot与PCR的结果中(图2B，2C)，同 样证明了Ecadherin表达降低，Vimentin表达升高；并且，EMT过程中关键的 转录因子——Snail也出现了明显的升高。说明rhCCN1诱导了人角质形成细胞 发生上皮间质转化。

图3：从WesternBlot结果看以看出，rhCCN1蛋白干预后，角质形成细胞 的β-Catenin蛋白总量增加，并且发生了核转移(图3A)。图3B是CCN1蛋白 作用于细胞的信号通路模式图。CCN1蛋白主要与细胞表面的整合素(Integrins) 结合，激活其下游的整合素激酶(ILK)，促使β-Catenin蛋白发生核转移，从 而转录下游的一系列蛋白，使得间质及干细胞标志物表达增高，而上皮标志物 的表达则受到抑制，细胞发生EMT改变。

图4：大鼠皮内注射rhCCN1(2mg/ml)后，通过组织切片及Masson染色 观察皮肤组织病理改变。图4A为ImageJ软件测量的空白对照组及rhCCN1 组的表皮厚度；图4B左为空白对照组；图4B右为rhCCN1干预组。可以看出， rhCCN1干预后表皮细胞发生明显增殖，厚度增加。

图5：大鼠皮内注射rhCCN1(2mg/ml)后，通过组织切片及组织免疫荧 光技术检测Ki67、K5、K10的表达。图5A：相比较于空白对照组，rhCCN1 组表皮基底层细胞Ki67表达增加，细胞增殖活跃(绿色：Ki67；蓝色：DAPI)。 图5B：空白对照组中，未分化标志物K5仅表达在表皮基底层，且表达量少， 基底层以上的表皮细胞均表达分化标志物K10；rhCCN1干预组中，表皮基底 层及基底层以上的棘细胞均表达K5，表达量增多，表皮细胞K10表达量减少 (绿色：K5；红色：K10；蓝色：DAPI)。说明，rhCCN1干预后，表皮细胞 增殖活跃，发生去分化，干性增加。

图6：大鼠皮内注射rhCCN1(2mg/ml)后，通过组织切片及Masson染色 观察皮肤组织病理改变。图6A为ImageJ软件测量的空白对照组及rhCCN1 组的皮肤全层厚度；图6B左为空白对照组；图6B右为rhCCN1干预组。可以 看出，rhCCN1干预后真皮层发生明显增殖，厚度增加，血管丰富。

图7：大鼠皮内注射rhCCN1(2mg/ml)后，通过组织RT-PCR检测目的 基因的相对表达量。结果显示，Ⅰ型和Ⅲ型胶原前体(COL1a、COL3a)、金 属蛋白酶9(MMP9)、波形蛋白(Vimentin)以及转录因子snail、twist的相对 表达量明显增加(图5)。Vimentin为间质细胞标志物，而转录因子snail、twist 为上皮间质转化(EMT)标志物。说明CCN1可诱导细胞发生EMT，促进组 织结构重塑及胶原的合成与分泌增加。

图8：小鼠创伤愈合夹板模型。BC组：空白凝胶；EGF组：易孚；bFGF 组：贝复新；CCN1组：空白凝胶+2μg/mLrhCCN1。分别在伤后1、4、7、10 天进行伤口照相与测量，图8A示照相结果。图8B示伤口愈合率折线图。 rhCCN1在伤后第7天开始发挥出明显的疗效(P＝0.007)，其效果从第7天开 始持续至第10天(P＝0.008)，直到伤口愈合的第14天(P<0.001)。伤后第14 天，rhCCN1组整体愈合率达94.5％，其效果明显。

图9：小鼠创伤愈合夹板模型，伤后第14天，组织切片Masson染色结果。 对照组创面上皮化未完成，炎性浸润明显；EGF组表皮移行并融合，表皮层增 厚，出现明显的分层，炎性浸润较轻，胶原排列紊乱；bFGF组表皮同样出现 移行并融合，表皮层增厚，但未出现明显的分层，炎性浸润较轻，胶原排列紊 乱；rhCCN1组表皮已形成完整的基底膜，出现明显的分层，可见表皮细胞角 化，炎性浸润最轻，已有成熟的胶原形成，并且结构排列清晰。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1.实验材料

1.1重组人CCN1蛋白及试剂：

重组人CCN1蛋白(rhCCN1)，从PEPROTECH公司购买，货号120-25， 由大肠杆菌表达，分子量为39.5kDa，由357个氨基酸残基组成。使用前用0.1％ 人血白蛋白(w/v)溶解重组人CCN1蛋白冻干粉，使其浓度为0.2mg/ml，分装， 于-20℃保存。

1.2rhCCN1针剂注射液的配置：

以工程菌生产的重组人CCN1蛋白(rhCCN1)为主要生物活性成分，混 合以2％-20％甘油、0.5-5％甘露醇、0.01％-0.03％人血白蛋白开发为注射针剂。

具体实施方式：取1g甘油、100mg甘露醇溶于10ml灭菌注射用水中，混 匀。取2mg人血白蛋白，20μgrhCCN1，溶于上述溶液中。震荡混匀，0.22μm 滤器过滤，制成注射针剂，4度保存(空白注射液为不添加rhCCN1的注射针 剂)。

1.3rhCCN1凝胶制剂的配置：

以工程菌生产的重组人CCN1蛋白(rhCCN1)为主要生物活性成分，混 合以0.01％-0.03％人血白蛋白、1％-10％甘油、0.1％-1％羟甲基纤维素钠、 0.1％-1％卡波姆开发为凝胶制。

具体实施方式：取200mg甘油、50mg卡波姆、5mg羟甲基纤维素钠加灭 菌注射用水至5ml，搅拌混匀，溶胀过夜，得到凝胶溶液备用。将pH调节剂 加入溶液中将凝胶溶液调制中性。121℃高温蒸汽灭菌30min，冷却至室温， 得到凝胶备用。将20μgrhCCN1和2mg人血白蛋白溶于5ml灭菌注射用水中， 0.22μm滤器过滤后，加入备用凝胶中混合均匀，分装到铝管中制成rhCCN1 凝胶制剂，4度保存(空白凝胶为不添加rhCCN1的凝胶制剂)。

2.实验方法

2.1细胞培养：

人类角质形成细胞培养与传代：外科手术切下的包皮经常规处理后剪成条 状(3-10mm)，浸入0.25％Dispase液中4℃过夜(16h)。分离表、真皮，表皮置于 0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA液中，37℃继续消化10min，小心吸去上层消化 液，加适量含10％胎牛血清的DMEM(Gibco公司购置)终止消化，并反复吹 打成细胞悬液，滤去残渣，离心，沉淀用KSFM液吹打成单细胞悬液，调整细 胞数为5×l0⁵/ml，接种于培养瓶。37℃5％CO₂培养箱中培养，每3天更换1 次培养液。原代细胞长至70％融合时，弃去培养液，加0.02％EDTA+0.25％胰 蛋白酶(1:1)室温消化至细胞间出现间隙，弃消化液，用D-hanks液洗1～2次， 加入0.25％胰蛋白酶继续消化至细胞间隙增加，细胞收缩变圆，立即加入与胰 蛋白酶等量的含10％胎牛血清的DMEM终止消化。用弯头吸管反复吹打成单 细胞悬液，低速离心，沉淀重悬于KSFM液中，转于新的培养瓶中。

2.2rhCCN1干预实验：

将融合率为80％的角质形成细胞分为对照组(BC组)和实验组(rhCCN1 组)。对照组加入5％胎牛血清的DMEM；实验组加入含有rhCCN1的5％胎牛 血清的DMEM，使得rhCCN1的浓度为0.2μg/ml。常规培养，72h后进行免疫 荧光及细胞凋亡检测。

2.3免疫荧光：

2.3.1细胞免疫荧光染色：

24孔板中的角质形成细胞去除培养基，用4％多聚甲醛固定10min，PBS 洗三次，每次5min。用含0.5％TritonX-100及3％BSA的PBS室温破膜及封 闭30min。加入特异性第一抗体，4℃孵育过夜。PBS洗三次，之后加入荧光 第二抗体，37℃避光孵育45min，PBS清洗。DAPI染细胞核5min，PBS清洗 三次，抗淬灭荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察采集图像，ImageJ软件测 量阳性细胞比例。

2.3.2组织免疫荧光染色：

新鲜取材的标本在室温下4％多聚甲醛固定24h，石蜡包埋，进行石蜡切 片，片厚5μm，常规脱蜡、水化。根据抗体说明书要求进行抗原修复，PBS清 洗三遍，每次5min。用含0.5％TritonX-100和3％BSA的PBS室温破膜及封 闭30min。加入特异性第一抗体，4℃孵育过夜。PBS清洗三遍，之后加入荧 光第二抗体，37℃避光孵育45min。PBS清洗，DAPI染细胞核5min，PBS清 洗三遍，抗淬灭荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察并采集图像。

2.4流式细胞术：细胞凋亡检测

角质形成细胞分为对照组与实验组，干预方法如2.2所述，37℃5％CO₂培养箱中培养72h。使用AnnexinV-FITC/PI试剂盒检(购自碧云天公司)测细 胞凋亡。把细胞培养液吸出至一离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量 0.25％胰蛋白酶消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时， 吸除胰蛋白酶消化液。加入收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，300g 离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5-10万重 悬的细胞，300g离心5分钟，弃上清，加入195μlAnnexinV-FITC结合液轻轻 重悬细胞。加入5μlAnnexinV-FITC，轻轻混匀。加入10μl碘化丙啶染色液， 轻轻混匀。室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。孵育过程中 重悬细胞2-3次以改善染色效果。流式细胞仪分析：FITC最大激发波长为488 nm，最大发射波长525nm，FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI-DNA复合 物的最大激发波长为535nm，最大发射波长为615nm，PI的红色荧光在FL2 或FL3通道检测。用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图(two-colordot plot)，FITC为横坐标，PI为纵坐标。

2.5实时定量PCR检测：

细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加 入1mlTrizol(Invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5mlRNasefreeEP管中 使细胞充分裂解，室温静置5min。组织样品用液氮充分研磨，加入 1mlTrizol(Invitrogen)溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；加入200μl 氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；4℃ 下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的 RNasefreeEP管；沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8 次)。4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清；用75％乙醇洗涤 两次(12,000g离心5min)。超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易 溶解，过湿则乙醇残留。视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。

使用RNase-free的DNaseI(Promega)，按以下体系配置反应液，37℃消 化30min，65℃灭活10min。

然后按以下步骤操作：

1)加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min后14,000rpm， 离心15min，取上清。

2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min， 取上清。

3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)，-20℃静置15min；

4)4℃下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清；5)用75％乙 醇洗涤两次(12,000g离心5min)，超净台风干；6)加入适量DEPC水(至少 15ul)溶解沉淀。

纯度检测：取1μlRNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值， OD260/OD280的比值应大于1.8。

总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min， EB染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5srRNA，18srRNA 和28srRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。

计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。总的体系配好后，在振 荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中。

cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为1:20稀释，如遇到基因表达低 的样品，则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后，即可 加至刚配好的反应体系中。加样完毕。把各排八连管放在掌上离心机上离心数 秒，随后上机检测。

表1.实时定量PCR特异性引物序列表

2.6Masson染色

皮肤组织常规4％多聚甲醛固定过夜后脱水石蜡包埋，切片后常规脱蜡至 水。依次自来水和蒸馏水洗。用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核 5-10min。充分水洗，如过染可盐酸酒精分化。蒸馏水洗。用Masson丽春红酸 性复红液5-10min。以2％冰醋酸水溶液浸洗片刻。1％磷钼酸水溶液分化 3-5min。不经水洗，直接用苯胺蓝染5min。以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻。 95％酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。

2.7Westernblot检测

蛋白抽提：总蛋白抽提时，细胞培养至所需要的密度时，细胞经预冷的 PBS漂洗3次，加入450μl裂解液(碧云天公司提供)，细胞刮刀收集，用移 液器转移至离心管中，反复吹打。所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超 声时为5S，间歇时间为10S，功率为100-120W至溶液清澈无粘稠为止，处理 过程在水浴中进行，后4℃12000rpm离心，上清液样品置100℃水浴箱里水浴 加热3-5分钟，12000rpm离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中。 膜蛋白抽提使用Mem-PER^TM膜蛋白抽提试剂盒(赛默飞公司提供)，并 按说明书进行。细胞胞浆蛋白及核蛋白抽提使用NE-PER核蛋白-胞浆 蛋白抽提试剂盒(赛默飞公司提供)，并按说明书进行。

蛋白定量：

①Bradford法浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95％ 乙醇，加入100ml浓磷酸；然后，用蒸馏水补充至200ml；此染液放4℃至少6 个月保持稳定。

②标准曲线蛋白质样本的制备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作 为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准，如果待测样品是未知的， 也可用抗体作为标准蛋白，通常在20μg-150μg/100μl之间绘制标准曲线。

③将待测样本溶于100μl缓冲溶液中，该缓冲溶液相同(最好用PBS)。

④按照1:5用水稀释浓燃料结合溶液，如果出现沉淀，过滤除去。

⑤每个样品加5ml稀释的染料结合溶液，作用5-30分钟，染料与蛋白结 合，将由红色变为兰色，在595nm波长下测定其吸光度，注意显色反应不超 过30分钟。

⑥根据标准曲线计算待测样品的浓度。

制做分离胶、浓缩胶：

①按比例配制分离胶，轻缓地摇动溶液(8-10下)，使激活剂混合均匀， 将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇， 以阻止氧气进入凝胶溶液中，然后静置90min。

②同前按比例配制浓缩胶，但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧 气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶 液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制90min以上以保证完 全聚合。

加样：预电泳后依次加入标准品和待分析样品，注意加样时间要尽量短， 以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。

电泳：加样完毕，盖好电泳槽的盖子并选择适当的电压进行电泳，通常在 连续系统中，上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳电压，使样品更好的 进入凝胶，电泳时，应采用恒压的模式，这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁 移率。一般采用恒压浓缩胶80V，分离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下至 凝胶末端处，即停止电泳。

转膜：

①Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗 数秒。取凝胶方法：用刀片将两玻璃板分开，将多余的凝胶划去，上部以浓缩 胶为准全部弃去，下部以分子量标准最小分子带下一点全部划去，取一10ml 注射器注满转印缓冲液，插入玻璃板与凝胶之间注水，使水的压力将两者自然 分开，边推边进，反复多次注水，直至凝胶从玻璃板上滑落下来。

②将PVDF膜和滤纸切出与凝胶一样大小，置转移缓冲液中湿润5-10min.

③按照以下顺序放置滤纸，凝胶和PVDF膜到半干槽中。

④每层之间的气泡要全部去除。可以用10ml吸管轻轻在上一层滚动去除 气泡，然后用一绝缘的塑料片中间挖空与凝胶一样大小或略小一点，以防电流 直接从没有凝胶处通过造成短路，盖好加上阳极电极板。

膜的封闭：

1)洗转印膜：室温漂洗3次x10min，以尽量洗去转印膜上的SDS，防止 影响后面的抗体结合。

2)取漂洗的转印膜，放入5％Non-fatmilk的封闭液内，摇床震动，室温 封闭2h，也可在4度过夜。

3)用1xTBST，PH7.6洗液，室温漂洗3次x10min.

抗体孵育：

1)封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀释第一抗体至说明 书推荐浓度，封口，4℃孵育过夜；

2)1xTBST液洗膜3次x10min；

3)HRP标记的第二抗体室温1h，洗膜3x10min。

检测：

①DAB显色液的配制：按照1mlH2O加显色剂A，B，C各1滴，混匀。

②显色：将适量DAB显色液平铺在第二抗体杂交后的印迹膜上，室温放 置观察，可出现明显的棕褐色蛋白显色带。

③终止：用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应。

2.8rhCCN1促进皮肤增殖体内实验：

实验对象为Lewis大鼠20只，随机分为对照组10只，实验组10只。采 用5％水合氯醛(250mg/kg)腹腔注射麻醉，预先一天用剃毛器及脱毛膏脱去 大鼠背部毛发。在大鼠背部正中皮肤区域皮内注射给药。对照组给予空白针剂 注射液；实验组给予含rhCCN1的针剂注射液(如1.2所述)。每日注射，第5 天取注射部位全层皮肤进行切片观察Masson染色，免疫荧光染色Ki67、K5、 K10，并通过RT-PCR检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原前体，金属蛋白酶9，和部分间质 指标的基因相对表达量(方法如上所述)。

2.9小鼠伤口愈合实验：

SPF级健康雄性C57BL/6小鼠20只，体重25-30g，平均28g,5％水合氯醛 (250mg/kg)进行腹腔麻醉。预先一天用剃毛器及脱毛膏脱去小鼠背部毛发。 根据伤口用药的不同，随机分为对照组、EGF组、FGF组、CCN1组，每组各 5只。小鼠背部用酒精棉球消毒三遍后，采用打孔器(直径4mm)在小鼠背部 正中打孔钻取全层皮肤。将准备好的圆环夹板用胶水粘贴至小鼠皮肤打孔处， 使夹板内环正好与皮肤伤口吻合。打孔后，周围皮肤发生牵拉，使伤口直径略 大于4mm。用5-0缝线，采用间断缝合将硅胶圆环缝合固定在皮肤上(图1)。 每日涂抹50μL药物于伤口表面(对照组：空白凝胶；EGF组：易孚；bFGF 组：贝复新；CCN1组：空白凝胶+2μg/mLrhCCN1)，具体凝胶制备方法如1.3 所述。用敷贴将伤口表面贴住，并用弹力绷带进行覆盖固定。具体实验步骤参 照WangSH等推荐的伤口愈合夹板模型的步骤(Wang,X.,etal.,Themouse excisionalwoundsplintingmodel,includingapplicationsforstemcell transplantation.NatProtoc,2013.8(2):p.302-9.)。

每日观察小鼠的存活率以及活动、饮食、饮水状况，于1天、4天、7天、 10天、14天进行伤口直径的测量及伤口照相，ImageJ软件测量伤口面积，重 复3次取平均值。按下列公式计算：伤口愈合率＝(1－伤口测量面积/伤口原 始面积)×100％。伤后14天，牺牲动物，用8mm皮肤打孔器于伤口及周缘全 层取材，进行Masson常规染色，进行组织病理学评价，观察伤口宽度、深度、 再上皮化程度以及胶原合成情况。

2.10统计学分析：

采用GraphPadPrism6.01进行作图及统计学分析，数据采用平均值(Mean) ±标准差(SD)表示，组间比较采用t检验，P值小于0.05为存在统计学差异。

3.实验结果

3.1rhCCN1在体外促进角质形成细胞增殖、抗凋亡能力

Ki67是一种细胞增殖相关的标志物，正常情况下Ki67表达水平较低，Ki67 表达升高提示细胞增殖活跃。我们用人重组CCN1蛋白(rhCCN1)干预人角 质形成细胞72小时后，通过免疫荧光染色发现细胞中Ki67阳性细胞明显增多 (P＝0.0004)，角质形成细胞增殖活跃(图1A，1B)。提示rhCCN1可促进角 质形成细胞的增殖。在细胞凋亡的流式检测中，rhCCN1干预后，可显著增加 细胞早期的抗凋亡能力，增加细胞的生存活力(图1C)。

3.2rhCCN1诱导人角质形成细胞发生上皮-间质转化

上皮-间质转化(EMT)，是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型 细胞的生物学过程。在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维 化疾病中发挥了重要作用，其主要的特征有细胞黏附分子(如E-Cadherin)表达 的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白(Vimentin)为主的细胞骨架及 形态上具有间充质细胞的特征等。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失 去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞 外基质的能力等间质表型。

细胞免疫荧光结果中可以看出，在rhCCN1干预后，角质形成细胞蛋白表 达发生改变，Vimentin表达显著升高，Ecadherin表达降低(图2A)。在Western Blot与PCR的结果中(图2B，2C)，我们也同样看到Ecadherin表达降低， Vimentin表达升高；并且，EMT过程中关键的转录因子——Snail也出现了明 显的升高。这说明：rhCCN1诱导了人角质形成细胞发生上皮间质转化。

3.3rhCCN1通过激活Wnt/β-Catenin信号通路诱导角质形成细胞发生 EMT

本发明发现，CCN1蛋白能够与细胞表面的整合素受体(Integrin)结合， 从而激活Wnt/β-Catenin信号通路，使β-Catenin蛋白核转移能力增加(图3A)， 从而转录下游的一系列蛋白，使得间质及干细胞标志物表达增高，而上皮标志 物的表达则受到抑制(图3B)。

3.4rhCCN1在体内促进大鼠表皮细胞增殖

通过Masson染色可以观察到(图4)，大鼠皮内注射rhCCN1可使表皮细 胞发生明显增殖，表皮变厚(P<0.0001)；同时细胞增殖标志物Ki67在表皮基 底层明显增加，进一步肯定了在动物体内rhCCN1可促进表皮细胞增殖(图 5A)。

3.5rhCCN1诱导大鼠表皮细胞去分化

角质素5(Keratin5，K5)是主要表达在表皮基底层细胞、表皮干细胞的 角蛋白，是表皮细胞去分化的标志物；而角质素10(Keratin10，K10)主要表 达在角化的表皮细胞中，是表皮细胞分化的标志物。从图5B中可看出，在大 鼠皮内注射rhCCN1后，表皮组织中K5表达明显增多，K10表达显著降低。 这说明，rhCCN1可诱导表皮细胞去分化，干性增加。

3.6rhCCN1促进真皮层增厚，胶原合成、分泌增加

图6显示，相比于对照组而言，在大鼠皮内注射rhCCN1后，皮肤发生明 显增厚(P<0.001)，同时真皮层发生明显增厚，间质细胞增多，胶原的合成与 分泌增加。

RT-PCR结果说明，大鼠皮内注射rhCCN1后，Ⅰ型和Ⅲ型胶原前体 (COL1a、COL3a)、金属蛋白酶9(MMP9)、波形蛋白(Vimentin)以及转录 因子snail、twist的相对表达量明显增加(图7)。Vimentin为间质细胞标志物， 而转录因子snail、twist为上皮间质转化(EMT)标志物。

发生这种现象的机制是：上皮细胞在rhCCN1的作用下发生了一系列转化， 从而穿过基底膜，转化为间质细胞，参与真皮的组成，并且合成和分泌胶原， 参与组织修复与组织重塑。即rhCCN1诱导表皮细胞发生了上皮-间质转化。

3.7rhCCN1促进皮肤伤口愈合

小鼠伤口愈合实验显示，相比于空白对照，EGF和bFGF在伤口第14天 可明显促进伤口愈合。其中EGF组愈合率为82.1％(P＝0.037)；bFGF组愈合 率为83.1％(P＝0.018)，并且，bFGF从第10天开始出现效果。由此可见，bFGF 起效快，在伤口愈合中的总体疗效优于EGF(图8)。然而，rhCCN1在伤后第 7天就开始发挥出明显的疗效(P＝0.007)，其效果从第7天开始持续至第10 天(P＝0.008)，直到伤口愈合的第14天(P<0.001)。伤后第14天，rhCCN1 组整体愈合率达94.5％。

bFGF是目前国际公认的在创面治疗中最能有效促进愈合的生长因子。根 据本治疗组的动物实验结果，bFGF在4,7,10,14天的伤口愈合率分别为18.0％， 53.2％，71.5％，83.1％。该结果与此前的文献报道总体一致。rhCCN1疗效明 显优于bFGF，在4,7,10,14天的伤口愈合率分别为21.9％，60.0％，80.1％，94.5％。 其起效快，作用时间长，更有效的促进了创面的愈合。

伤后第14天的组织Masson染色显示，对照组创面上皮化未完成，炎性浸 润明显；EGF组表皮移行并融合，表皮层增厚，出现明显的分层，炎性浸润较 轻，胶原排列紊乱；bFGF组表皮同样出现移行并融合，表皮层增厚，但未出 现明显的分层，炎性浸润较轻，胶原排列紊乱；rhCCN1组表皮已形成完整的 基底膜，出现明显的分层，可见表皮细胞角化，炎性浸润最轻，已有成熟的胶 原形成，并且结构排列清晰(图9)。

4.讨论

皮肤损伤及皮肤萎缩相关性疾病治疗的关键在于如何让皮肤组织实现再 生与修复。

皮肤创面的有效愈合中关键的环节就是创面边缘的表皮迁移、增殖、再生， 即再上皮化。再生的表皮细胞作为皮肤组织修复的“种子细胞”，与细胞外基质 (ECM)、整合素(Integrin)、生长因子协同作用，共同实现创面的修复(Enyedi, B.andP.Niethammer,Mechanismsofepithelialwounddetection.TrendsCellBiol, 2015.25(7):p.398-407.)。再上皮化启动于伤后24小时，创缘的表皮细胞感应 到机械应力以及局部微环境的改变，首先发生转化，获得干性，迁移与增殖能 力增加，表皮层不断增厚，并且能够覆盖创面。随着表皮细胞的不断迁移与增 殖，部分表皮细胞转化成间质细胞，干性增加；并且迁移到真皮层，分泌胶原、 金属蛋白酶和细胞外基质成分，参与组织重塑。随着基底膜的形成，从表皮细 胞转化而来的间质细胞再次发生转化，发生间质-上皮转化(MET)，形成次级 表皮细胞，并进一步分化，构成完整分化的表皮层。因此，皮肤创面的再生修 复的动力来自于表皮细胞的不断的上皮-间质转化(EMT)和间质-上皮转化 (MET)的过程中。CCN1(CYR61)是一种细胞外基质(ECM)蛋白，根据文 献报道及本课题组的研究证明，CCN1可以促进细胞发生上皮间质转化(EMT) (Haque,I.,etal.,Cyr61/CCN1signalingiscriticalforepithelial-mesenchymal transitionandstemnessandpromotespancreaticcarcinogenesis.MolCancer,2011. 10:p.8.Chai,J.,etal.,CCN1inducesareversibleepithelial-mesenchymal transitioningastricepithelialcells.LabInvest,2010.90(8):p.1140-51.)。CCN1可 促进表皮细胞发生增殖，并在体内促使表皮细胞去分化，干性增加。在创伤愈 合过程中，CCN1是促进愈合的关键因子之一，其作用机制是诱导表皮细胞的 增殖、迁移和上皮-间质转化，从而促进再上皮化及组织重塑，最终促使创面 有效愈合。

皮肤萎缩主要是由各种因素导致的的皮肤营养障碍与皮肤干细胞衰竭。本 发明研究证明，rhCCN1能够促使表皮细胞发生间质转化，从而增加了真皮内 间质细胞的数量，并且刺激了胶原的合成与分泌，使得皮肤厚度增加，皮肤完 整性得以重建。本发明还发现，rhCCN1能够促进表皮细胞去分化，增加表皮 细胞的再生活力。ManiSAetal证明了发生EMT的细胞具有干细胞的特性 (Mani,S.A.,etal.,Theepithelial-mesenchymaltransitiongeneratescellswith propertiesofstemcells.Cell,2008.133(4):p.704-15.)。因此，rhCCN1的作用机 制主要是促进表皮细胞发生EMT从而获得干性，进而刺激皮肤组织再生，缓 解皮肤萎缩的症状。

综上所述，本发明提出：(1)重组人CCN1蛋白能够有效促进创面的愈合， 可用于治疗各种皮肤损伤性疾病；(2)重组人CCN1蛋白能够有效促进皮肤组 织再生，可用于治疗各种皮肤萎缩性疾病。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些 改进和补充也应视为本发明的保护范围。