一类基于热致延迟长寿命荧光有机材料纳米颗粒的制备方法及其时间分辨生物成像应用

技术领域

本发明涉及合成具有热致延迟荧光(TADF)特性的长寿命有机荧光分子及其水溶性长寿命纳米颗粒的制备方法和生物成像应用。属于有机发光材料及纳米生物探针与成像领域。

背景技术

荧光显微成像技术作为一种无损伤生物传感技术，在细胞成像、活体、体外组织成像中成为一种必不可少的关键技术。荧光显微成像技术的核心是发展具有荧光效率高、光稳定性好的荧光发色团。目前常见的荧光发色团包括：传统荧光素、罗丹明、花菁类有机染料、无机半导体纳米晶、共轭聚合物等。其中传统有机小分子荧光染料因其可设计性强，成为生物传感和临床应用的主要选择。然而现有的有机染料仍面临一些问题如疏水性、易聚集、易于光漂白等。而，无机半导体纳米晶，如量子点等，虽然具有高亮度、高光稳定性的优势，但是自身毒性却亟待解决。此外，一般的荧光染料在生物成像中应用易受生物体系内源背景荧光的干扰、灵敏度和信噪比均相对较低、信号易受环境影响。由于生物体内源荧光一般寿命为几个纳秒或者零点几个纳秒，这样，发展具有长荧光寿命的荧光发色团，可利用时间分辨技术规避样品中荧光背景的干扰，从而实现高灵敏、高信噪比的成像。

目前，长寿命荧光成像主要基于无机稀土材料、稀土配合物及贵、重金属的磷光发射，然而这种磷光长寿命信号往往因为需要在乏氧条件下才能保持。因此，发展空气或者氧气气氛下具有长寿命荧光、高荧光量子效率、水溶性好的荧光探针具有重要的科学研究和市场价值。

近年来，纳米技术日益成为科学技术向前发展的主导技术。将有机小分子荧光染料与纳米技术相结合，通过负载有机小分子染料的纳米颗粒或染料小分子自聚集形成纳米颗粒，利用形成的纳米结构控制、影响并提高材料的相关性能从而使之得到更好的应用是有机小分子荧光染料发展的重要方向。

发明内容

发明目的：本发明目的之一是提供一种具有长寿命荧光的有机半导体荧光材料；目的之二是提供该有机小分子染料包覆于水溶性的DSPE-PEG2000中以形成水溶性荧光纳米颗粒的方法；目的之三是提供该纳米有机小分子染料纳米颗粒在细胞成像、活体成像中应用的范例。

技术方案：为克服现有技术的不足，我们选择设计、合成用具有热致延迟荧光特性的有机半导体发光材料，并选择适当手段使之具有水溶性和长荧光寿命，从而据有水溶性好、荧光寿命长、荧光效率高、荧光光谱稳定性好等特点的荧光显微成像发色团。该纳米材料的特征在于：将有机小分子荧光材料与纳米技术结合，得到的纳米颗粒稳定性高，荧光寿命长，荧光量子产率高，并具有好的生物相容性和低的生物毒性。

本发明给出一类基于热致延迟荧光有机荧光材料的水溶性长寿命荧光纳米颗粒的组成结构，其中本发明所述的纳米结构如附图1所示，TADF材料CzPy结构式如通式(I)所示：

其中，CzPy纳米颗粒结构中星型图案表示CzPy分子的聚集体，外表的曲线图案代表卵磷脂-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)分子，其亲水端在外，提供水溶性；亲脂端融合CzPy分子聚集体，形成纳米发光体核心。

CzPy所代表的TADF材料结构通式(I)中，Py为吡啶分子，Cz为类咔唑分子，其中Ar1和Ar2分别表示苯、噻吩、芴、咔唑、萘、蒽等芳基、取代芳基、杂环芳基以及取代杂环芳基中的一种，4个Cz结构通过其9位氮原子与核心的4-氰基吡啶相连。

本发明所述的CzPy所代表的TADF分子，其特征结构通式式(I)中，Ar1和Ar2与吡咯并环结构的合成是通过硝基关环反应实现。其制备方法可以下述反应通式(II)表示。

合成方案通式(II)中，Ar1和Ar2所代表的基团分别为苯、噻吩、芴、咔唑、萘、蒽等芳基、取代芳基、杂环芳基以及取代杂环等芳香基团中的一种；X可以为溴原子或碘原子，Y可以为硼酸基、硼酸酯基或三烷基锡基的一种。

本发明公开的TADF有机半导体材料合成方法主要分三步进行，如通式(II)所示：(1)，步骤1)一般为Suzuki偶联反应或者Stille偶联反应；当步骤1)为Suzuki偶联反应时，需要用到含钯催化剂和无机碱的水溶液，溶剂一般为甲苯或者四氢呋喃，在回流下反应16～24小时得到III-3；当步骤1)为Stille偶联反应时，需要用含钯催化剂在甲苯或四氢呋喃溶液中回流反应5～24小时，经硅胶柱层析得到化合物III-3。钯催化剂可以选择Pd(PPh₃)₄或者Pd₃dba₂/P(o-tol)₃；Suzuki偶联反应中使用的碱溶液可以是2mol/L的碳酸钾、碳酸钠或者碳酸氢钠溶液。(2)，步骤2)为获得Cz分子的关环步骤，其特征在于关环试剂是三苯基膦或三乙氧基膦，所用的溶剂是氯苯、邻二氯苯，反应温度为125～145℃，反应时间为6～12小时。化合物III-3与关环试剂、溶剂的摩尔比大约为1mmol:2.5mmol:2mL。(3)，步骤3)所需的溶剂为无水无氧的二甲亚砜，反应温度为100℃～150℃，反应时间为12～24小时。

本发明公开的基于TADF有机半导体材料CzPy的水溶性长寿命荧光纳米颗粒的制备方法，其特征是经过三个步骤。步骤一，将2mg的CzPy溶解于2mL四氢呋喃中，加入2mg的DSPE-PEG2000，超声混合均匀，并保持10分钟，形成透明溶液。步骤二，取步骤一的溶液0.5mL快速注入10mL的pH＝7.4的PBS或去离子水溶液中；氮气流下除去四氢呋喃。步骤三，将步骤二所得纳米颗粒水溶液经0.22微米微孔过滤头滤过，并旋转蒸发除去大部分溶剂水，剩余水经冷冻干燥除去，得到目标纳米颗粒粉末。

本发明公开的CzPy纳米颗粒及其制备方法，长寿命荧光分子与DSPEG-2000的重量比为1:3～3:1；旋转蒸发除水。

本发明公开的一类纯有机长寿命荧光纳米颗粒及其制备方法，其步骤三所得到的纳米颗粒粒径为10～50纳米(如图4)；其在空气中测定的荧光寿命达到微秒级(如图3)。

本发明公开的该类纳米颗粒对HELA细胞进行染色标记(如图5)以及对斑马鱼血管具有良好的成像效果(如图6)。

有益效果：

1、本发明所公开基于热致延迟荧光有机半导体材料的水溶性长寿命荧光纳米颗粒，充分利用具有拥挤芳香体系的TADF材料在聚集状态下具有比溶液态更强的荧光发射；

2、利用DSPE-PEG2000作为增溶试剂，通过快速沉淀法，稳定、可控的制备具有尺寸均一、信号稳定的水溶性纳米颗粒。

3、最核心的优势是这种纳米颗粒具有比普通有机或共轭材料更好的荧光寿命稳定性和更长的荧光寿命，即便在空气中测定和操作使用，都达到了微秒级的水平，这使得本发明公开的一类长寿命纳米颗粒在细胞成像、活体或组织成像中，通过时间分辨技术克服背景荧光干扰方面有无以伦比的优势。

4、本发明公开的基于热致延迟荧光有机半导体材料的水溶性长寿命荧光纳米颗粒有望在生物成像、细胞成像等传感检测领域得到广泛的应用。

附图说明

图1为制得的CzPy纳米颗粒结构示意图；

图2-1为制得的长寿命荧光有机小分子紫外荧光谱图；

图2-2为有机小分子及其纳米颗粒的荧光对比图；

图3为有机纳米颗粒的荧光寿命图；

图4为有机纳米颗粒透射电子显微镜图；

图5为有机纳米颗粒细胞成像共聚焦显微镜照片；(制备得到的纳米颗粒在细胞膜处成像为绿色荧光。)

图6为有机纳米颗粒在斑马鱼血管成像共聚焦显微镜照片。(纳米颗粒在斑马鱼血管成像具有很好的分辨率，在斑马鱼上较亮部分即成像显示为绿色荧光。)

具体实施例

为了更清楚的阐述本发明，下面通过具体实施例子来对本发明做进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1

TADF分子CzPy-T的制备

在两口瓶(100mL)中，将2-溴硝基苯(2.01g,10mmol)，2-噻吩硼酸(1.42g,11mmol)溶解在30mL甲苯中,注入2M碳酸钾溶液20mL.抽换气三次，氮气保护下，加入四(三苯基膦)钯(150mg,0.14mmol)，加热至90℃，反应16小时。自然冷至室温，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，柱层析分离得到亮黄色粉末1.85g,产率81％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.95(d,J＝1.9Hz,1H),7.77(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),7.56(d,J＝8.1Hz,1H),7.42(d,J＝1.0Hz,1H),7.39(dd,J＝5.1,1.1Hz,1H),7.11(d,J＝1.4Hz,1H).¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ141.03,132.68,128.69,128.53,127.94,127.50,127.24,127.21,126.71,124.88,120.74。

在两口圆底烧瓶(250mL)中加入2-硝基-苯联噻吩(9.37g,33mmol)，三苯基膦(22.7g,100mmol)和氯苯(60mL)，氮气保护，加热至140℃搅拌反应7小时，冷至室温，二氯甲烷萃取，浓缩，经柱层析分离得苯联噻吩并吡咯粉末4.83g，产率70.1％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.21(br,1H),7.60(d,J＝6.7Hz,2H),7.39(d,J＝5.2Hz,1H),7.29(dd,J＝8.4,1.7Hz,1H),7.07(d,J＝5.2Hz,1H).¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ143.37,141.83,127.73,123.02,121.07,119.98,117.88,116.02,114.81,111.51。

在两口瓶(250mL)中加入上述苯联噻吩并吡咯(3.08g,18mmol)、2,3,5,6-四氟-4-氰基吡啶(0.72g,4mmol)，碳酸钾(6.9g,50mmol)和二甲亚砜(100mL)，氮气保护下，150℃搅拌24h。二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥。浓缩，硅胶色谱柱分离得CzPy-T，2.56g,产率82％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.25(br,2H),7.78(m,2H),7.59(d,J＝8.4Hz,4H),7.50(d,J＝1.6Hz,4H),7.39(d,J＝5.2Hz,4H),7.29(dd,J＝8.4,1.7Hz,2H),7.07(d,J＝5.2Hz,2H)。¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ146.16,142.42,143.37,141.83,133.9,133.5,128.5,127.29,123.02,122.03,121.30,119.97,119.90,117.88,116.02,115.84,115.73,114.81。

实施例2

TADF分子CzPy的制备

在两口瓶(250mL)中加入上述苯联噻吩并吡咯(6.05g,48mmol)、2,3,5,6-四氟-4-氰基吡啶(1.76g,10mmol)，碳酸钾(9.6g,70mmol)和二甲亚砜(100mL)，氮气保护下，150℃搅拌24h。二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥。浓缩，硅胶色谱柱分离得CzPy，6.34g,产率82％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.59(d,J＝8.4Hz,1H),7.50(d,J＝1.6Hz,1H),7.39(d,J＝5.2Hz,1H),7.27-7.24(dd,J＝1.7Hz,1H),7.02(d,J＝5.2Hz,1H),4.06(d,J＝7.5Hz,2H),2.04(m,1H),1.28(m,24H),0.84-0.89(m,6H).¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ146.16,142.42,127.29,122.03,121.30,119.97,115.84,115.73,113.02,110.56,49.79,38.37,31.88,31.78,31.68,31.6,29.90,29.58,29.50,29.27,26.4,26.40,22.68,22.63,14.14,14.10。

实施例3

TADF分子CzPy-Na的制备

在两口瓶(100mL)中，将2-溴硝基苯(2.01g,10mmol)，2-萘硼酸(1.86g,11mmol)溶解在30mL四氢呋喃中,注入2M碳酸钾溶液20mL。抽换气三次，氮气保护下，加入四(三苯基膦)钯(150mg,0.14mmol)，加热至90℃，反应16小时。自然冷至室温，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，柱层析分离得到亮黄色粉末1.67g,产率65％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.05(d,J＝1.9Hz,1H),8.00(m,3H),7.90(t,2H),7.75(m,1H),7.64(s,1H),7.56(d,J＝8.1Hz,2H)。¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ141.13,136.68,134.21,133.1,132.7,130.45,128.5,128.2,128.1,127.7,126.69,124.4。

在两口圆底烧瓶(250mL)中加入2-硝基-苯联萘(2.5g,10mmol)，三苯基膦(6.3g,28mmol)和氯苯(22mL)，氮气保护，加热至140℃搅拌反应7小时，冷至室温，二氯甲烷萃取，浓缩，经柱层析分离得苯联萘并吡咯(Cz-Na)粉末1.65g，产率79％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.16(d,2H),7.71(m,J＝6.7Hz,2H),7.65(m,1H),7.51(d,J＝5.2Hz,1H),7.40(m,1H),7.29(dd,J＝8.4,1.7Hz,1H),7.07(d,J＝5.2Hz,1H)。¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ135.6,135.5,133.9,133.5,128.5,127.3,127.2,127.19,121.7,121.4,120.5,119.8,111.1,111.0。

在两口瓶(250mL)中加入上述苯联萘并吡咯(2.18g,10mmol)、2,3,5,6-四氟-4-氰基吡啶(350mg,2.1mmol)，碳酸钾(3.3g,25mmol)和二甲亚砜(100mL)，氮气保护下，150℃搅拌24h。二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥。浓缩，硅胶色谱柱分离得CzPy-Na，1.84g,产率85％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.17(d,J＝8.4Hz,1H),8.18(d,J＝8.3Hz,1H),8.12(d,J＝8.2Hz,1H),7.50～7.65(m,4H),7.48(s,1H),7.41(s,1H)。¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ136.7,136.4,136.1,136.0,135.9,135.87,135.8,135.6,134.4,134.1,133.9,133.8,132.8,132.6,127.4,127.3,27.29,127.21,127.19,127.0,122.03,121.30,119.97,115.84,115.73,115.02。

实施例4

CzPyDSPE-PEG2000纳米颗粒制备

1)将2mg的CzPy溶解于2mL四氢呋喃中，加入2mg的DSPEG，室温下，超声混合均匀，并保持10分钟，形成淡黄绿色溶液。

2)取上述溶液0.5mL快速注入10mL的pH＝7.4的PBS溶液中；氮气流下除去四氢呋喃。

3)将除去THF的纳米颗粒水溶液经0.22微米微孔过滤头滤过，50℃条件下旋转蒸发除去大部分溶剂水，剩余水经冷冻干燥除去，得到目标纳米颗粒粉末。经透射电镜确认纳米颗粒粒径约为10～50nm。

应用研究

1.方法：本发明所公开基于热致延迟荧光有机材料的水溶性长寿命荧光纳米颗粒，充分利用具有拥挤芳香体系的TADF材料在聚集状态下具有比溶液态更强的荧光发射，同时利用DSPE-PEG2000作为增溶试剂，通过快速沉淀法，稳定、可控的制备具有尺寸均一、信号稳定的水溶性纳米颗粒。最核心的优势是这种纳米颗粒具有比普通有机或共轭材料更好的荧光寿命稳定性和更长的荧光寿命，即便在空气中测定和操作使用，都达到了微秒级的水平，这使得本发明公开的一类长寿命纳米颗粒在细胞成像、活体或组织成像中，通过时间分辨技术克服背景荧光干扰方面有无以伦比的优势。本发明公开的基于热致延迟荧光有机半导体材料的水溶性长寿命荧光纳米颗粒有望在生物成像、细胞成像等传感检测领域得到广泛的应用。

2.实验步骤：利用DSPE-PEG2000作为增溶试剂，通过快速沉淀法，稳定、可控的制备具有尺寸均一、信号稳定的水溶性有机半导体材料的水溶性长寿命荧光纳米颗粒。透射电子显微镜TEM表征证明这类材料在水溶液中可以通过主客体自组装成10nm左右的颗粒；取所制备的纳米颗粒溶于水或者PBS溶液，稀释一定倍数后对HELA细胞进行染色标记以及对斑马鱼血管成像，共聚焦显微镜表征显示其成像具有一定的时间分辨的效果。