免疫细胞培养方法以及人工滋养细胞在免疫细胞培养中的用途

技术领域

本发明属于细胞制备技术领域，具体涉及一种免疫细胞培养方法以及人工 滋养细胞在免疫细胞培养中的用途。

背景技术

恶性肿瘤是一类最为严重危害人类健康的疾病,每年全国大约三百万人诊 断为新发肿瘤患者，二百多万人死于癌症。尽管可以通过手术、放疗、化疗进 行治疗,但大多数病人仍死于肿瘤的复发和转移。所以，如何清除残留的微小肿 瘤组织或肿瘤细胞则是现代肿瘤免疫学有待解决的问题之一。

由于癌症发生的根本原因是肿瘤细胞逃逸免疫细胞的监控而进行无节制的 生长，所以提高免疫系统识别和杀伤肿瘤细胞的能力，将可以从根本上去除肿 瘤。随着新技术在临床上的应用推广，过继性免疫细胞疗法逐渐成为治疗癌症 最有效的方法之一。

过继性免疫细胞疗法是指：将肿瘤患者体内具有抗肿瘤细胞性能的免疫细 胞在体外进行培养，在体外高效活化和扩增患者自身的CTL(cytotoxic lymphocyte，毒性T淋巴细胞)细胞，其中，CTL细胞是白细胞的亚部，为一种 特异T细胞，对某种抗原敏感，具有对抗原阳性的靶细胞的特异性杀伤，专门分 泌各种细胞因子参与免疫作用，对某些肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用。CTL 细胞是机体抗肿瘤最主要的效应性淋巴细胞。CTL的功能优点是在相同主要组织 相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)限制的条件下，特异性 地识别和直接杀伤抗原阳性的靶细胞，能针对性地消除具有肿瘤抗原特异性的 癌细胞。这种抗癌作用对分布在病人组织器官内的小体积肿瘤组织和个体肿瘤 细胞尤为重要和有效，也是肿瘤组织细胞被清除的最后一道步骤，其在临床应 用中功效已得到充分证实。

当CTL细胞在体外扩增至一定数量时，再回输至该患者体内，采用CTL细胞 杀伤或杀灭肿瘤细胞等抗原物质，达到抗肿瘤的目的。

由于CTL细胞的扩增需要免疫细胞生长因子和细胞共刺激分子信号的刺激 下才能复制扩增。目前传统的免疫细胞培养方法中，需要在细胞培养时不断加 入免疫细胞生长因子以及细胞共刺激分子信号蛋白，由于细胞生长因子和其在 细胞表面的受体结合后发生内吞过程，所以加入培养基中的外源蛋白半衰期短， 需要不断定期加入免疫细胞生长因子和细胞共刺激分子信号蛋白，不仅增加了 免疫细胞培养的操作复杂度，也大大增加细胞生产的成本，影响免疫细胞在癌 症治疗中的推广和应用。

另外，传统的免疫细胞培养方法所培养的免疫细胞，其具有的CTL细胞的比 例、对肿瘤细胞的杀伤力以及专一性均有限，进一步影响免疫细胞在癌症治疗 中的推广和应用

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种免疫细胞培养方法以及人工滋 养细胞在免疫细胞培养中的用途，可有效解决上述问题。

本发明采用的技术方案如下：

本发明提供一种免疫细胞培养方法，包括以下步骤：

将外周血单个核细胞重悬于培养基中进行培养，当将细胞培养至需要CTL 细胞扩增的阶段时，向细胞培养液中加入表达细胞生长因子和共刺激分子的滋 养细胞，静置培养，得到最终的免疫细胞。

优选的，所述滋养细胞表达的细胞生长因子为IL-21细胞生长因子；所述滋 养细胞表达的共刺激分子为4-1BBL共刺激分子。

优选的，所述滋养细胞表达的4-1BBL共刺激分子中阳性细胞比例为100％； 所述滋养细胞表达的IL-21细胞生长因子中阳性细胞比例为96.7％。

优选的，所述滋养细胞为K562细胞。

优选的，加入滋养细胞后静置培养的条件为：温度为37℃、体积百分比含 量为5％且相对饱和湿度为100％的CO₂培养箱中培养。

优选的，所述滋养细胞加入量与加入时刻所述细胞培养液中CTL细胞的数量 比为1：8。

本发明还提供一种人工滋养细胞在免疫细胞培养中的用途，在免疫细胞培 养过程中加入表达细胞生长因子和共刺激分子的滋养细胞进行培养，增加免疫 细胞抗原专一性的比例、增加免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤力以及增加免疫细胞 中CTL细胞的比例。

本发明提供的免疫细胞培养方法以及人工滋养细胞在免疫细胞培养中的用 途具有以下优点：

在免疫细胞培养过程中加入表达细胞生长因子和共刺激分子的滋养细胞， 利用滋养细胞表面的免疫细胞生长因子和共刺激信号，不断刺激免疫细胞，而 达到促使免疫细胞扩增的作用。由于直接加入滋养细胞，而免疫细胞生长因子 和共刺激信号附着在滋养细胞膜表面，而非单独加入免疫细胞生长因子和细胞 共刺激分子信号蛋白，因此，既延长细胞生长因子和共刺激信号的作用时间， 也避免了单独加入细胞生长因子时发生的内吞过程，又降低免疫细胞生产成本， 而且培养的免疫细胞还具有增值效果好、抗原专一性的T细胞比例高、专一性高、 杀伤肿瘤细胞的功能强等优点，为免疫细胞治疗癌症的推广和效果的提高起到 推动作用。

附图说明

图1为本发明提供的滋养细胞表面共刺激分子4-1BBL的表达图；

图2为本发明提供的滋养细胞表面细胞生长因子IL-21的表达图；

图3为对照组细胞和试验组细胞所进行的细胞增殖倍数测试对照结果图；

图4为对照组细胞和试验组细胞所进行的细胞毒性测试对照结果图；

图5为对照组细胞和试验组细胞所进行的CTL细胞比例测试对照结果图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以 下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述 的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供一种免疫细胞培养方法，包括以下步骤：将外周血单个核细胞 重悬于培养基中进行培养，当将细胞培养至需要CTL细胞扩增的阶段时，向细胞 培养液中加入表达细胞生长因子和共刺激分子的滋养细胞，静置培养，得到最 终的免疫细胞。

需要强调的是，对于本发明提供的免疫细胞培养方法，与传统技术相比， 主要创新为：在细胞培养的过程中，加入表达细胞生长因子和共刺激分子的滋 养细胞，由于细胞生长因子和共刺激分子附着在滋养细胞表面，因此，可延长 细胞生长因子和共刺激信号的作用时间，还能够避免单独加入细胞生长因子时 发生的内吞过程，所以，与传统方案相比，所使用的滋养细胞的量较小，从而 降低免疫细胞生产成本。另外，还具有培养的免疫细胞增值效果好、抗原专一 性的T细胞比例高、专一性高、杀伤肿瘤细胞的功能强等优点

在上述细胞培养的过程中，本发明人经过大量实验证明，只要加入表达细 胞生长因子和共刺激分子的滋养细胞，既可实现上述的各种优点。而对于所加 入的滋养细胞种类，只要满足表达细胞生长因子和共刺激分子这一个要求即可， 对于滋养细胞在细胞培养过程中的加入时间点、滋养细胞的加入量、滋养细胞 的加入种类以及滋养细胞加入后的细胞培养条件等，均可根据实际实验过程灵 活调整，本发明均不限制。

基于上述思想，下面介绍几个细胞培养过程的实施例，需要强调的是，以 下实施例仅用于解释本发明，并不用于限制本发明。

细胞培养过程实施例一

步骤1，将外周血单个核细胞重悬于培养基中，在培养基中加入DC细胞活化 因子IL-4，以及0.1ug/ml/each的长链多肽，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养12小时， 使抗原被单核细胞摄取、分解并递呈至单核细胞表面，得到一次培养液；

步骤2，向一次培养液中加入DC细胞类铎受体，激活因子IFN-γ以及0.1ug/ml 的黑色素肿瘤抗原短肽，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养7天，激活单核细胞为成 熟DC细胞，得到二次培养液；

步骤3，向二次培养液中加入K562滋养细胞，其中，滋养细胞加入量与加 入时刻所述细胞培养液中CTL细胞的数量比为1：8，置于37℃、5％CO₂孵箱 中培养12天，得到最终的免疫细胞产品。

本实施例，首先在PBMC培养液中加入只有促进DC细胞抗原摄取的细胞因 子和需要细胞内分化处理的长链多肽，在长链多肽被摄取进入单核细胞内后， 再加入促进单核细胞成为DC细胞活化成熟的细胞因子及危险信号因子，从而使 这些具有专一性的淋巴细胞被激活，进而分化和繁殖，形成高比例并具有专一 性的CTL免疫细胞。在细胞培养的后期，加入表达细胞生长因子和共刺激信号的 滋养细胞，进一步提高扩增细胞的数量，增强T细胞杀伤肿瘤细胞的功能，加强 抗肿瘤效应。

细胞培养过程实施例二

步骤1，调整PBMC密度至3×10⁶个/ml，接种10ml细胞悬液至90mm培养 皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养3小时以上。取出培养皿中的上清， 加到50ml离心管中，并用生理盐水滴洗培养皿2-3次，一并加到50ml离心管 中，1200rpm离心10min。离心后的上清取10ml培养基加入到原90mm培养 皿中，分别加入因子IL-4、GM-CSF(第0天)和抗原特异性多肽。将培养皿 放置于37℃，5％CO₂培养箱培养。

步骤2，步骤1中离心后的沉淀，用培养基Ⅰ重悬，按照2×10⁶/ml的密度 每瓶15ml接种至若干个T-75培养瓶中(第0天)。将培养瓶放置于37℃，5％CO₂培养箱培养。

步骤3，第七天时，将步骤1和2中的细胞混合，并按1：8比例加入K562 滋养细胞，置于37℃、5％CO₂孵箱中继续培养7天，得到最终的免疫细胞产品。

效果验证例

一、免疫细胞培养过程：

对于细胞培养过程实施例一，当得到二次培养液时，收集少量成熟DC细胞 作为对照组。当得到最终的免疫细胞时，收集最终得到的免疫细胞作为试验组。

二、细胞增殖倍数测试

将收集到的对照组和试验组细胞采用细胞计数仪分析，得到对照组细胞总 数量以及试验组细胞总数量，再用对照组细胞总数量除以第1天起始培养的单个 核细胞数，得到对照组细胞扩增倍数；用试验组细胞总数量除以第1天起始培养 的单个核细胞数，得到试验组细胞扩增倍数。以细胞扩增倍数为纵坐标作图， 结果如图3所示。

分析图3可以看到，对照组细胞扩增倍数为2.8，而试验组细胞扩增倍数增加 到5.8。由此可见，在免疫细胞培养过程中，通过增加滋养细胞，可有效增加免 疫细胞增值的倍数。

对于细胞培养过程实施例二，步骤1和2中的细胞混合且未加入滋养细胞时， 收集少量DC细胞作为对照组。当得到最终的免疫细胞时，收集最终得到的免疫 细胞作为试验组，也进行了同样的细胞增殖倍数测试，测试结果相近似。

三、细胞毒性测试

将收集到的对照组细胞和试验组细胞分别进行细胞毒性测试。

具体的，将对照组细胞与黑色素瘤细胞株M14按按效靶比5：1比例铺于96 孔板中，在37℃、5％CO₂的条件下进行共培养，培养5小时后，用CCK8方法进 行测试，即：每孔加入CCK-8试剂10μL进行染色，在37℃、5％CO₂的培养箱中 培养2小时后，在450nm的波长下检测每个孔的OD值，然后，计算得到对照组细 胞对黑色素瘤细胞株M14的杀伤率。

在同样的条件下，将试验组细胞与黑色素瘤细胞株M14进行共培养，并计算 得到试验组细胞对黑色素瘤细胞株M14的杀伤率。结果见图4。

从图4可以看到，试验组细胞杀伤肿瘤细胞的比例为76％；而对照组细胞杀 伤肿瘤细胞的比例为51％。

可见，试验组细胞可以明显增加免疫细胞对肿瘤细胞杀伤力。

对于细胞培养过程实施例二，步骤1和2中的细胞混合且未加入滋养细胞时， 收集少量DC细胞作为对照组。当得到最终的免疫细胞时，收集最终得到的免疫 细胞作为试验组，也进行了同样的细胞毒性测试，测试结果相近似。

四、CTL细胞比例测试

将收集到的对照组细胞和试验组细胞分别通过流式细胞分析仪进行CTL细 胞比例的测试。结果见图5。

从图5可以看到，对照组细胞中免疫细胞抗原专一性的比例 (CD8+Pentamer+)为12.0％。而试验组细胞中免疫细胞抗原专一性的比例 (CD8+Pentamer+)为17.9％。

可见，通过加入滋养细胞，可以明显增加抗原特异性T细胞即CTL细胞的比 例。

对于细胞培养过程实施例二，步骤1和2中的细胞混合且未加入滋养细胞时， 收集少量DC细胞作为对照组。当得到最终的免疫细胞时，收集最终得到的免疫 细胞作为试验组，也进行了同样的CTL细胞比例的测试，测试结果相近似。

由此可见，本发明在免疫细胞培养过程中加入表达细胞生长因子和共刺激 分子的滋养细胞，利用滋养细胞表面的免疫细胞生长因子和共刺激信号，不断 刺激免疫细胞，而达到促使免疫细胞扩增的作用。由于直接加入滋养细胞，而 非单独加入免疫细胞生长因子和细胞共刺激分子信号蛋白，因此，既延长细胞 生长因子和共刺激信号的作用时间，又降低免疫细胞生产成本，而且培养的免 疫细胞还具有增值效果好、抗原专一性的T细胞比例高、专一性高、杀伤肿瘤细 胞的功能强等优点，为免疫细胞治疗癌症的推广和效果的提高起到推动作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视本发明的保护范围。