LRR-RLK受体激酶AtMDIS1及其在打破物种间生殖隔离中的应用

技术领域

本申请涉及但不限于生物技术领域，具体地涉及拟南芥的LRR-RLK (Leucine-richrepaeat-receptorlikekinase)受体激酶AtMDIS1(MaleDiscover 1)及其应用；更具体地涉及在花粉中特异表达的LAT52启动子驱动拟南芥受 体激酶编码基因AtMDIS1以转基因手段打破物种间生殖隔离的技术。

背景技术

由于各方面的原因，亲缘关系接近的类群之间在自然条件下不交配，或 即使能交配也不能产生后代或不能产生可育性后代的隔离机制，被称为生殖 隔离。若生殖隔离发生在受精以前，称为受精前的生殖隔离，其中包括地理 隔离、生态隔离、季节隔离、生理隔离、形态隔离和行为隔离等；若生殖隔 离发生在受精以后，就称为受精后的生殖隔离，其中包括杂种不活、杂种不 育和杂种衰败等。

各种生殖隔离的实质都是阻碍不同物种间的基因交流，该隔离现象给农 业生产造成了困难，比如杂交时的杂种不育，使人们不能利用杂种优势育种。 这种生殖隔离给农业生产造成了一定的负效应。如能实现打破植物的近缘杂 交不亲和，对不同物种之间的基因交流以及农作物的增产具有重要意义。

发明内容

本申请提供了一种DNA片段，所述DNA片段具有SEQIDNo.：1所示 的核苷酸序列，或与SEQIDNo.：1具有60％以上的同源性、优选地75％或 更高、更优选地85％或更高、进一步更优选地90％或更高、最优选地95％或 更高的同源性的核苷酸序列。这里使用的术语“同源性”指与天然核苷酸序列的 序列相似性。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件， 两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关 序列之间的同源性。

本申请提供了一种DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列与以上所述 的DNA片段的核苷酸序列互补。这里使用的术语“互补的”系指遵循碱基配对 原则产生。

本申请提供了含有以上所述的DNA片段的重组载体。在一些实施方案 中，所述重组载体可包括花粉特异表达启动子；优选地，所述花粉特异表达 启动子可以是LAT52启动子。在一些实施方案中，所述重组载体可包括SEQID NO.：3所示的序列。

本申请提供了包含以上所述的DNA片段的植株、细胞系或重组菌株。

本申请提供了一种打破植物间生殖隔离的方法，所述方法包括：将以上 所述的DNA片段导入与其来源不同的另一种植物；获得转入所述DNA片段 的植物。在一些实施方案中，所述植物可为拟南芥以外的所有植物物种，优 选地所述植物可为双子叶植物或单子叶植物，更优选地所述植物可为拟南芥 的近缘物种和远缘物种，最优选地所述植物可为拟南芥的近缘物种。在一些 实施方案中，所述拟南芥的近缘物种可以是十字花科(Cruciferae)云苔属 (Brassica)，包括白菜(B.pekinensis)、小油菜(B.chinensisL.)、圆白菜 (B.oleracea)、油菜(B.napus)、芜菁(Brassicarapa)、萝卜(Raphanus sativus)、Arabidopsislyrata、Capsellarubella；和/或所述拟南芥的远缘物种 可以是烟草、番茄、小麦、玉米或水稻。

本申请提供了以上所述的DNA片段在提高植物杂交的亲和性、打破生殖 隔离中的用途。在一些实施方案中，所述植物可为拟南芥以外的所有植物物 种，优选地所述植物可为双子叶植物或单子叶植物，更优选地所述植物可为 拟南芥的近缘物种和远缘物种，最优选地所述植物可为拟南芥的近缘物种。 在一些实施方案中，所述拟南芥的近缘物种可以是十字花科(Cruciferae)云 苔属(Brassica)，包括白菜(B.pekinensis)、小油菜(B.chinensisL.)、圆 白菜(B.oleracea)、芜菁(Brassicarapa)、萝卜(Raphanussativus)、Arabidopsis lyrata、Capsellarubella；和/或所述拟南芥的远缘物种可以是烟草、番茄、小 麦、玉米或水稻。

本申请克隆了拟南芥(Arabidopsisthaliana)中的膜定位受体AtMDIS1 并用基因工程的方法转入其近缘物种Capsellarubella中，能够增加C.rubella 花粉管识别成熟拟南芥胚珠的效率。

本申请所要解决的技术问题是用转基因手段打破近缘杂交不亲和的新方 法。

本申请提供的DNA片段的核苷酸序列如下：

拟南芥AtMDIS1的核苷酸序列如SEQIDNO.：1所示。

Capsellarubella中的MDIS1的直系同源基因的核苷酸序列如SEQID NO.：2所示。

本申请提供了一种在近缘物种中基因表达的方法，包括如下步骤：将本 申请的拟南芥DNA片段导入其近缘物种C.rubella中，得到转基因植物，使 得上述DNA片段在所述转基因植物中转录；与野生型植物相比，转基因的 C.rubella植物中表达了拟南芥的AtMDIS1基因。

所述方法中从pBI101(Clontech)改造的最终表达载体，依次由LAT52 启动子、酶切位点、AtMDIS1片段以及转录终止子NOS-Terminitor依次连接 而成，序列如SEQIDNo.：3所示。

总的来说，本申请利用在番茄花粉中特异表达的启动子LAT52驱动 AtMDIS1，可以高效地在十字花科(Cruciferae)云苔属(Brassica)，包括白 菜(B.pekinensis)、小油菜(B.chinensisL.)、圆白菜(B.oleracea)、油菜 (B.napus)、芜菁(Brassicarapa)、萝卜(Raphanussativus)、Arabidopsis lyrata、Capsellarubella和远缘物种烟草、番茄、小麦、玉米或水稻等等拟南 芥以外其他植物的花粉管中表达。实验证明，利用LAT52驱动AtMDIS1在花 粉管中进行过表达，可以提高Capsellarubella花粉管定向地导向未受精拟南 芥胚珠的效率。说明在拟南芥近缘物种Capsellarubella中表达AtMDIS1能够 提高转基因的C.rubella花粉管识别拟南芥胚珠的效率，从而增加异缘杂交的 受精效率。

本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说 明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的目的和其他优 点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获 得。

附图说明

附图用来提供对本申请技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部 分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请 技术方案的限制。

图1示出改造后的pLAT52:AtMDIS1-NOST载体。

图2示出用PCR方法进行转基因植物阳性苗的鉴定结果。 pLAT52:AtMDIS1-NOST转入近缘物种Capsellarubella后，其中拟南芥基因 AtMDIS1的表达。泳道1为阴性对照(野生型Capsellarubella植株的PCR扩 增产物)，泳道2和3为以T1代不同株的阳性转基因植物(表达AtMDIS1的 C.rubella植物)的基因组DNA为模板的PCR扩增产物。如图中箭头所示，较 大的条带为野生型Capsellarubella中的CrMDIS1(AtMDIS1的直系同源基 因)，较小的条带为转入的拟南芥的AtMDIS1。

图3示出AtMDIS1转基因阳性Capsellarubella植物花粉半体外萌发导向 未受精拟南芥胚珠。左图：表达拟南芥的AtMDIS1基因的Capsellarubella的 花粉管识别并进入未受精的成熟拟南芥胚珠；右图：野生型Capsellarubella 的花粉管不能被成熟的未受精拟南芥胚珠所吸引，花粉管在珠孔附近经过而 未进入珠孔。

图4为野生型以及转基因Capsellarubella植物的花粉管被成熟的未受精 拟南芥胚珠吸引的效率统计。图中误差线为三次重复的标准差，统计学分析 使用Student’st-test方法,p***<0.01表示差异极显著。星号显示有统计学上的 显著差异。

具体实施方式

下面将以实施例的方式对本申请作进一步的详细描述，以使本领域技术 人员能够实践本申请。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适 当的改变而不偏离本申请的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能 够实践本申请来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来 说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本 发明的范围仅由所附权利要求界定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得 到。

以下实施例便于更好地理解本申请，但并不限定本申请的范围。

本申请列举的实施例中进行基因编辑时使用的具体工具如下：

拟南芥Col-0生态型(ArabidopsisthalianaL.)在文献“Xin-RanLi,Hong-Ju Li,LiYuan,ManLiu,Dong-QiaoShi,JieLiuandWei-CaiYang.(2014) ArabidopsisDAYU/ABERRANTPEROXISOMEMORPHOLOGY9IsaKey RegulatorofPeroxisomeBiogenesisandPlaysCriticalRolesduringPollen MaturationandGerminationinPlanta.ThePlantCell,26:619–635.”中描述，公众 可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

C.rubella(Capsellarubella)种子在ABRCstockcentrer获得。

DNA内切酶购自NewEnglandBiolabs公司；DNA回收试剂盒购自天根 生化科技有限公司；T4DNA连接酶购自Promega公司；TOYOBOKODPlus 酶购自东洋纺生物科技有限公司。

LAT52启动子由McCormickS.实验室在番茄中分离出来，是可以驱动基因 在花粉、萌发中的花粉管中表达的启动子。在文献“MuschiettiJ,DircksL, VancanneytG,McCormickS.(1994)LAT52proteinisessentialfortomatopollen development:pollenexpressingantisenseLAT52RNAhydratesandgerminates abnormallyandcannotachievefertilization.ThePlantJournal,6(3):321–338.”中 描述。

观察生殖隔离及成像所用的是LeicaDM4000BLED型荧光体式镜。

实施例1、AtMDIS1转化Capsellarubella阳性植物的筛选及基因表达的 鉴定。

1.基于pBI101制备LAT52启动子驱动的AtMDIS1基因表达载体 pLAT52:AtMDIS1-NOST。

首先以拟南芥基因组DNA为模板，扩增具有SEQIDNo.：1所示核苷酸 序列的AtMDIS1基因的DNA片段，扩增引物为MDIS1-F1： TCCCCCCGGGATGGGTTGTCGATGGAATCCAATT(SEQIDNo.:4)； MDIS1-R1：TCCCCCCGGGTTATGTAGCTTCAGAGGATAAGATCT(SEQID No.：5)(加下划线处为XmaI酶切位点，酶切位点的5’端是保护碱基)。 用TOYOBOKODPlus酶从花粉中扩增AtMDIS1片段，扩增产物用XmaI酶 切后回收；将pBI101载体(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获 得)用HindⅢ单酶切并且去磷后与HindⅢ单酶切后的番茄LAT52启动子回 收片段进行连接并挑选鉴定为正向的载体克隆，然后将构建好的载体用SmaI 单酶切并且去磷后，与SmaI单酶切后的AtMDIS1回收片段进行连接并鉴定 为正向插入。NOS终止子为pBI101上已有序列。如图1所示，经测序验证阳 性克隆即为pLAT52:AtMDIS1-NOST(SEQIDNo.：3)的质粒。

2、pLAT52:AtMDIS1-NOST转化Capsellarubella.

将上述1所得到的pLAT52:AtMDIS1-NOST转化根癌农杆菌GV3101，得 到重组农杆菌，将重组农杆菌转化Capsellarubella植物，得到T0代转化植株。

农杆菌转化拟南芥的方法在文献StevenJ.CloughandAndrewF.Bent. (1998).Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformation ofArabidopsisthaliana.ThePlantJournal16(6),735–743.和Zhangetal.. Agrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthalianausingthefloral dipmethod.Nat.Protoc.2006.中描述，公众也可从文献中获得这种转化方法转 化Capsellarubella获得阳性植物。

3、含有AtMDIS1阳性转基因植物的筛选及基因表达的鉴定。

收获T0代转pLAT52:AtMDIS1-NOST质粒的Capsellarubella，于37℃ 保温箱中烘干3天后，在含有50mg/L卡那霉素的MS筛选培养基上进行培养。 同时将对照野生型Capsellarubella的种子在不含任何抗生素的平板上培养。 都置于有光照条件的4℃冷室中春化21天，然后转移到12小时长日照光照 24℃恒温温室培养，得到T1代转入pLAT52:AtMDIS1-NOST质粒的Capsella rubella阳性植物。

提取T1代转pLAT52:AtMDIS1-NOST质粒阳性植物的基因组DNA，以 MDIS1-F2：ATGGGTTGTCGATGGAATCCAATT(SEQIDNo.：6)；和 MDIS1-R2：CATGTAATGTCTTGAAGTTGCT(SEQIDNo.：7)为引物，进 行PCR扩增，得到PCR扩增产物。并以野生型Capsellarubella苗的基因组 DNA为模板，进行上述实验作为阴性对照。PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶 中的电泳结果如图2所示。

图2中，泳道1为对照野生型的PCR扩增产物，泳道2和3为T1代不 同转基因株系(A和B)的PCR扩增产物。如图中箭头所示，较大的条带为在 野生型Capsellarubella中的AtMDIS1同源基因CrMDIS1的扩增片段，较小 的条带为转入的拟南芥中的AtMDIS1的扩增片段(引物MDIS1-F和MDIS1-R 鉴定的Capsellarubella的CrMDIS1为690bp,拟南芥中的AtMDIS1为 684bp)。所鉴定的两株(A和B)皆为转基因阳性植物。

实施例2、测试最优Capsellarubella花粉萌发培养基进行Capsellarubella 花粉萌发试验

将配好的花粉萌发培养基调至pH7.5，加入Promega公司低熔点的琼脂 糖(货号V2111)在水浴锅中煮至琼脂糖完全溶解，冷却至室温后再在小的 培养皿(直径3.2cm，NEST公司，货号GBD-35-15)中倒培养基1-2mL， 在4℃冰箱中放置1-2小时至完全凝固。

将野生型的Capsellarubella花粉在解剖镜下均匀地涂抹在准备好的培养 基上，在该小的培养皿底下垫上湿润的卫生纸，在恒温温室进行萌发8小时 后统计萌发的花粉/总共花粉的比率，计算萌发率。

表1为探索用更优化的Capsellarubella花粉萌发培养基做的花粉萌发的 效率统计，发现用新的培养基的萌发效率比用传统的拟南芥花粉培养基的萌 发效率高。

下列配方中所用的蔗糖、硼酸、氯化钙、硝酸钙皆来自国药集团化学试 剂北京有限公司。

表1针对不同组成的培养基，Capsellarubella的花粉萌发率

从表1可见，最佳的体外花粉萌发的培养基的配方是4mMCaCl₂、4mM Ca(NO₃)₂、10％w/v蔗糖、1％H₃BO₃，pH＝7.5。

实施例3、检测AtMDIS1转基因植物的花粉进入成熟的未受精拟南芥胚 珠的效率。

将拟南芥、Capsellarubella于开花前一天去雄(将未开花刚露白的小蓓 蕾，用杂交镊子剥开花瓣，去除所有的花药花丝)。

将Capsellarubella的花粉授粉到未受精的柱头，30min后将柱头切下， 平放在花粉萌发培养基上，培养8小时以后，在花粉管附近摆上拟南芥的未 受精的胚珠。

在24℃培养12-14小时时，在LeicaDM4000BLED型荧光体式镜下观察 转基因花粉管定向到胚珠的效率。

在花粉萌发培养基中萌发的花粉管上均匀施加苯胺蓝染液(1％w/v苯胺 蓝，SIGMA公司货号415049)、100mMK₃(PO₄)(国药集团化学试剂北京有 限公司，pH10.0)，在紫外光下观察，花粉管呈绿色，而胚珠呈红色。图3 示出在体式镜下看到的结果：转基因的花粉管定向到拟南芥的胚珠，并且进 入到胚珠的珠孔内。而野生型的花粉管在拟南芥胚珠附近生长，并没有进入 胚珠。

为了更好的展示结果是否有差异，将进入拟南芥胚珠的花粉管与总的生 长到胚珠附近的花粉管的比率做了统计。如图4所示，野生型花粉管定向生 长进入到胚珠的概率为50％左右，而转基因的花粉管定向进入到胚珠的概率 高达80％，两者对比是有显著性差异的。图中误差线为三次重复的标准差， 统计学分析使用Student’st-test方法，p***<0.01，表示差异极显著。

这表明拟南芥AtMDIS1在不同物种的花粉中表达时，能够提高近缘物种 花粉管进入到未受精拟南芥胚珠的效率，即AtMDIS1可以打破种间隔离，提 高杂交的成功率。

虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请 而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人 员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细 节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利 要求书所界定的范围为准。