铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测体系和方法

技术领域

本申请属于生物技术检测领域，具体涉及双加氧酶活性的通用检 测方法，更具体地，涉及所有以α-酮戊二酸和铁离子作为辅助因子的 双加氧酶(即铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶)活性的通用检测方法。

背景技术

双加氧酶，是使氧分子中的两个氧原子全部与底物相结合的氧化 酶的总称。铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶 [α-oxoglutarate/Fe(II)-dependentdioxygenases(α-ODDs)]属于广泛分布 于自然界中的非血红素铁蛋白，是一种参与多种氧化还原反应的重要 酶类，其反应底物种类多样，可以是蛋白质，例如脯氨酰羟化酶(PHD)， 低氧诱导因子(hypoxiainducedfactor)和胶原脯氨酰羟化酶(collagen prolylhydroxylase)等；也可以是小分子化合物，例如核酸，如AlkB、 FTO，因而在动物、植物和微生物的初生及次生代谢产物的合成方面 起着重要作用。例如，该酶类参与植物激素乙烯、赤霉素和黄酮类化 合物等的合成等。最近的研究表明，铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶 是最全能且极其重要的氧化生物催化剂。

铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶在反应中存在一个共同的机制， 即亚铁离子和α-酮戊二酸作为辅助因子，在反应中氧分子的两个氧原 子，一个进入底物，另一个参与α-酮戊二酸脱羧基反应生成琥珀酸。

目前此类酶活性的检测一般利用同位素标记分析(radioactive assay)、质谱、核磁共振(NMR)和大分子产物对应底物结构与物理特性 的改变等等。这些检测方法繁琐，不适用于大通量药物筛选。此外， 现有的检测方法仅适用于一种特定的铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧 酶，不具备通用性。

发明内容

一方面，本申请提供了铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检 测体系，其包括：铁离子、α-酮戊二酸、辅酶A，NTP，琥珀酰辅酶A 合成酶。

在上述酶活检测体系中，还包括用于起始酶促反应的铁和酮戊二 酸依赖性双加氧酶的作用底物，以及用于终止酶促反应的钼酸铵溶液 和用于显色的孔雀绿溶液。

在一实施方案中，所述酶活检测体系中的辅酶A，NTP和琥珀酰 辅酶A合成酶三者的浓度为过量，例如，琥珀酰辅酶A合成酶的浓度 为过量，而辅酶A和NTP的浓度相同，可为琥珀酰辅酶A合成酶的 对应底物Km值的5-10倍以上。在优选实施方案中，所述酶活检测体 系中的钼酸铵溶液和孔雀绿溶液均为强酸性的。

另一方面，本申请提供了检测铁和酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶 活的试剂盒或微阵列，其包括铁离子、α-酮戊二酸、辅酶A、NTP、 琥珀酰辅酶A合成酶。在本申请提供的试剂盒或微阵列中，还包括用 于起始酶促反应的铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的作用底物和用于 终止酶促反应的钼酸铵溶液和用于显色的孔雀绿溶液。

在一实施方案中，所述试剂盒或微阵列中的辅酶A，NTP和琥珀 酰辅酶A合成酶三者的浓度为过量，例如，琥珀酰辅酶A合成酶的浓 度为过量，而辅酶A和NTP的浓度相同，可为琥珀酰辅酶A合成酶 的对应底物Km值的5-10倍以上。

在优选实施方案中，所述酶活检测体系中的钼酸铵溶液和孔雀绿 溶液均为强酸性的。

又一方面，本申请提供了铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活 检测方法。

在一实施方案中，本发明提供的铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶 的酶活检测方法包括以下步骤：a)在待测样品中，加入α-酮戊二酸 依赖性双加氧酶作用底物、铁离子、α-酮戊二酸来起始反应进行反应 I；b)在步骤a)中的反应I终止之后，再加入辅酶A、NTP、MgCl₂和 琥珀酰辅酶A合成酶进行反应II；c)加入钼酸铵溶液来终止步骤b) 中的反应II，最后加入孔雀绿溶液来显色，并在620-640nm处读取吸 光度，由此确定铁和酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活。

在优选实施方案中，步骤a)中的反应I于100℃下加热来终止， 加热时间为，例如30分钟。

在优选实施方案中，步骤b)中的反应II加入溶解于硫酸的钼酸铵 溶液来终止。

在另一实施方案中，本发明提供的铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧 酶的酶活检测方法包括以下步骤：a)在待测样品中，加入α-酮戊二 酸依赖性双加氧酶作用底物、铁离子、α-酮戊二酸来起始反应进行反 应I，同时加入辅酶A、NTP、MgCl₂和琥珀酰辅酶A合成酶进行反应 II；b)加入钼酸铵溶液来终止反应，再加入孔雀绿溶液来显色，并在 620-640nm处读取吸光度，由此确定铁和酮戊二酸依赖性双加氧酶的 酶活。此外，本申请还提供了上述的酶活检测体系，上述的试剂盒或 微阵列，以及上述的方法在检测铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶 活中的应用。

可见，本申请利用铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶这一类酶催化 不同反应后都产生琥珀酸的特性，通过检测反应产生的琥珀酸的量的 方法，来检测铁和α-酮戊二酸依赖双加氧酶的活性。与现有技术中检 测铁和α-酮戊二酸双加氧酶检测底物的消耗和首要产物的产生，以及 由此产生需要依赖层析、质谱或同位素标记等耗时耗力的方法不同， 本申请所提供的铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测体系和 方法仅通过检测副产物琥珀酸的产生来检测酶活，测量依赖简单仪器 读取可见光光吸收，因而省时省力。

附图说明

图1为本申请提供的铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测 方法的示例性原理图。

图2为本申请实施例1中编码琥珀酰辅酶A合成酶β,α链的sucC 和sucD基因的基因图谱。

图3为本申请实施例1中琥珀酰辅酶A合成酶的PCR扩增产物电 泳结果图。

图4为本申请实施例1中琥珀酰辅酶A合成酶的质粒转化电泳验 证结果图。

图5为本申请实施例1中琥珀酰辅酶A合成酶的蛋白纯化电泳结 果图。

图6为本申请实施例1中琥珀酰辅酶A合成酶的活性验证，其中 1为没有琥珀酸(黄色)；2为50μM琥珀酸(没有酶，黄色)；3为500μM 琥珀酸(没有酶，黄色)；4为5μM琥珀酰辅酶A合成酶和50μM琥 珀酸(浅绿色)；5为0.5μM琥珀酰辅酶A合成酶和500μM琥珀酸(绿 色)。

图7为本申请实施例1中制作的磷酸浓度标准曲线。

图8为本申请实施例1中不同pH条件下，根据不同琥珀酸浓度 (10-100μM)建立的琥珀酸辅酶A合成酶反应标准曲线,反应时间为 45min。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指 导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人 员的常规用法理解。

在本文中所使用的“NTP”，是核苷三磷酸(nucleosidetriphosphate) 的缩写，指一种含有三个磷酸基团的核苷酸，包括腺苷三磷酸(ATP)、 鸟苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)、胸腺苷三磷酸(TTP)以及尿苷三 磷酸(UTP)等，其经水解可生成相应的核苷二磷酸NDP并释放出无机 磷酸Pi。在具体实施方案中所使用的核苷三磷酸种类，取决于所使用 的琥珀酸辅酶A合成酶的来源和种类。

在本文中所使用的“强酸性”，是指一种物质在溶剂中能向其它物 质提供质子的能力，25℃下，当pH<<7时，溶液呈强酸性。在具体实 施方案中使用硫酸作为溶剂来获得强酸性溶液，例如，通过将25mM 钼酸铵溶解于3.4M硫酸来制备钼酸铵溶液，通过将1mM孔雀绿溶解 于6mM硫酸来制备孔雀绿溶液。

在本文中所使用的“酶活”，定义为单位时间内(1min)单位质量的 酶(mg)转化生成产物的量。就铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活 而言，指单位时间内(1min)单位质量的双加氧酶(mg)转化生成琥珀酸 的量(nmole或pmole)，即nmoles琥珀酸·min^-1mg待测双加氧酶^-1。

在一实施方案中，本申请所提供的酶活检测方法包括以下步骤： 1)在待测样品中加入铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的作用底物，铁 离子和α-酮戊二酸，使其经酶催化反应，产生琥珀酸；2)将步骤1) 的反应体系加热至100℃3分钟来终止反应，再向其中加入辅酶A， NTP，MgCl₂和琥珀酰辅酶A合成酶，使产生的琥珀酸经进一步的酶 催化反应，产生无机磷酸；以及3)在步骤2)的反应体系中加入溶解 于硫酸的钼酸铵溶液来终止反应，随后加入溶解于硫酸的孔雀绿溶液 来显色，并测定反应物的吸光度(例如，在620-640nm处读取吸光度)， 由此确定铁和酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活。

可选择地，在所述方法中，可根据不同的双加氧酶的反应速率， 亦可同时进行上述步骤1)和步骤2)。

例如，在另一实施方案中，本申请所提供的酶活检测方法包括以 下步骤：在待测样品中加入辅酶A，NTP，MgCl₂，琥珀酰辅酶A合 成酶，铁离子，α-酮戊二酸和作用底物进行反应，随后加入溶解于硫 酸的钼酸铵溶液来终止反应，最后加入溶解于硫酸的孔雀绿溶液来显 色，并测定反应物的吸光度(例如，在620-640nm处读取吸光度)，由 此确定铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活。

在又一实施方案中，本申请所提供的酶活检测方法包括以下步骤： 在待测α-酮戊二酸依赖性双加氧酶样品中，加入其作用底物、铁离子、 α-酮戊二酸来起始反应(反应I)，取决于待测酶活性的高低，可于反应I 的混合体系中同时加入辅酶A，NTP、MgCl₂和琥珀酰辅酶A合成酶进 行反应II，或者通过100℃加热3分钟来终止反应I，再加入反应II所需 的辅酶A，NTP、MgCl₂和琥珀酰辅酶A合成酶，30分钟后，加入溶解 于硫酸的钼酸铵溶液来终止反应，最后加入溶解于硫酸的孔雀绿溶液 来显色，20分钟后，于620-640nm处读取吸光度，由此确定铁和α- 酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活。

在另一实施方案中，本申请所提供的酶活检测方法的反应条件根 据不同物种来源的琥珀酰辅酶A合成酶而定，例如，当使用大肠杆菌 来源的琥珀酰辅酶A合成酶时，反应温度为30～40℃，例如30℃、31℃、 32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃，优选37℃。 当使用嗜热菌来源的琥珀酰辅酶A合成酶时，反应温度较高，为 50-65℃，例如50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、 58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃。

在又一实施方案中，为了提高信噪比，减少ATP水解造成的背景， 加入过量琥珀酰辅酶A以缩短反应时间，由于琥珀酰辅酶A合成酶为 过量，根据双加氧酶的反应速率，其活性可以达到50U，产生的琥珀 酸的检测范围在5-100μM时，可在30分钟内完成反应。

在又一实施方案中，本申请所提供的酶活检测方法中所加入的铁 和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的作用底物根据所测双加氧酶的种类而 改变，例如，脯氨酰羟化酶(PHD)的底物为低氧诱导因子(HIF)或其多 肽，胶原脯氨酰羟化酶的底物为胶原蛋白或其多肽，烷烃羟化酶(AlkB) 或核酸去甲基化酶(FTO)的底物为DNA或RNA寡聚体等等。

在优选的实施方案中，本申请所提供的酶活检测方法或试剂盒中 所加入的辅酶A，NTP和琥珀酰辅酶A合成酶三者浓度均为过量。例 如，琥珀酰辅酶A合成酶的浓度为过量，而辅酶A和NTP的浓度为 琥珀酰辅酶A合成酶的对应底物Km值的5-10倍以上，例如5倍，6 倍，7倍，8倍，9倍，或10倍。

在更优选的实施方案中，所述酶活检测体系中的各成分浓度如下： 0.5μM琥珀酰辅酶A合成酶，200μMNTP和200μM辅酶A。

在优选的实施方案中，上述方法或试剂盒中所加入的钼酸铵溶液 和孔雀绿溶液的pH为强酸性，例如，pH<<7。例如，在更优选的实施 方案中，所述钼酸铵溶液通过将25mM钼酸铵溶解于3.4M硫酸来制 备；所述孔雀绿溶液通过将1mM孔雀绿溶解于6mM硫酸来制备。

在一实施方案中，上述方法还包括预先做出标准曲线的步骤。具 体地，所述标准曲线以不同浓度的磷酸二氢钠作为标准曲线的每一个 样品，加入钼酸铵和孔雀绿的混合溶液，在620-640nm处测定样品的 吸光度。

本申请提供的铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测方法的 原理例如，如图1所示。本申请主要使用酶偶联反应，利用琥珀酰辅 酶A合成酶(succinylCoAsynthetase)催化琥珀酸转化为琥珀酰辅酶 A(简称琥珀酰CoA)。这一反应的化学方程式如下:

在一实施方案中，上述催化反应消耗核苷三磷酸产生无机磷酸， 而无机磷酸可以通过钼酸铵与孔雀绿的混合溶液来检测，即钼酸铵与 孔雀绿的混合溶液与磷酸产生复合物，其在620-640nm具有最大的吸 光度。

本申请适用于不同物种来源的琥珀酰辅酶A合成酶，例如大肠 杆菌(Escherichiacoli)、水生栖热菌(Thermusaquaticus)、β细胞线粒体等， 以及不同物种来源的琥珀酰辅酶A合成酶在不同表达系统表达纯化的 重组蛋白在相同目的下的使用，也适用于检测其他的铁和α-酮戊二酸 依赖双加氧酶。

本申请建立通用简便的铁和α-酮戊二酸依赖双加氧酶(iron dependentalphaketoglutaratedioxygenase)活性的通用检测方法及其试 剂盒或微阵列，适用所有铁和α-酮戊二酸依赖双加氧酶，例如，脯氨 酰羟化酶(PHD)，胶原脯氨酰羟化酶(collagenprolylhydroxylase)，烷烃 羟化酶(AlkB)或核酸去甲基化酶(FTO)等。

在一些实施方案中，本申请提供的方法涉及吸光度检测，可以用 普通光吸收仪器例如platereader或酶标仪多通道进行，因而允许大通 量的检测。由此，在一些实施方案中，本申请的试剂盒或系统还可以 包含上述吸光度检测的装置或试剂。

更进一步地，还可将本申请的检测方法及其试剂盒或微阵列用于 铁和α-酮戊二酸依赖双加氧酶的活性抑制剂(或促进剂)的筛选，即筛 选出对该双加氧酶起到抑制或激活作用的具有潜在药物治疗作用的小 分子。

以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。若未特别指 明，实施例均按照常规实验条件进行。

实施例1

本实施例以脯氨酰羟化酶(PHD)为例来阐述本申请提供的酶活检 测方法。

1.琥珀酰辅酶A合成酶的获得

琥珀酰辅酶A合成酶可通过商购获得，例如可购自Megazyme公 司(货号E-SCOAS)，或者通过以下方法制备：

(1)基因克隆

a.PCR扩增：对编码琥珀酰辅酶A合成酶β,α链的sucC和sucD 基因(如图2所示)进行PCR扩增，PCR反应体系和条件分别如下表1 和表2所示，PCR产物检测的电泳结果见图3。

表1

其中所使用的引物序列如下：

引物-F:5’-GGGAATTCCATATG(NdeI)AACTTACATGAATAT CAGGC-3’

引物-R:5’-CGCGAAGCTT(HindIII)TTATTTCAGAACAGT TTTCAGTGC-3’

表2

b.酶切和酶连：通过限制性内切酶NdeI、HindIII对目的基因 sucCDPCR产物DNA片段和pET-28a进行酶切，随后使用T₄DNA连 接酶将基因片段与pET28a载体片段连接，重组质粒克隆进入大肠杆 菌DH5α，以扩增重组质粒，再用相同的内切酶NdeI/HindIII确认成 功构建含sucCD基因的重组质粒，图4给出了电泳结果图。

(2)蛋白的表达和纯化

a.蛋白表达：形成新的质粒pET28a-sucCD被转化进入大肠杆菌 BL21中并对目的基因进行诱导表达。

I)从-80℃冰箱中取100μL感受态细胞悬液，室温下使其在冰上解冻。

II)加入pET-28a-sucCD质粒DNA溶液(～50ng，1-10μL)，轻轻摇匀， 冰上 放置30分钟后。

III)42℃水浴中热击60秒，热击后迅速置于冰上冷却2分钟。

IV)向管中加入1mLLB液体培养基(不含抗生素)，37℃振荡培养1 小时，

使细菌恢复正常生长状态。

V)离心10000g×1min，弃上清液900μL。

VI)将上述剩余菌液100μL悬浮涂布于含卡那霉素(Kan，100μg/mL) 的筛 选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培 养皿，37℃培养10-16小时。

VII)单克隆菌落在LB+Kan培养液中培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入 0.3mM IPTG对T7操纵子控制下的sucCD目的基因诱导表达2小时。细胞 离心保留在-80℃等待蛋白纯化。

b.蛋白纯化：一步亲和层析即可把琥珀酰辅酶A合成酶全酶α₂β₂蛋白纯化到>95％的纯度。

I)细胞破碎：上述细胞用裂解缓冲液(50mMNaH₂PO₄、300mM NaCl、10mMimidazole、1mMPMSF，pH8.0)超声或高压均质仪(French Press)破碎，使菌体充分裂解。

II)Ni-NTA柱层析：将样品与Ni-NTA在4℃摇晃结合60min。将 结合60min的样品(包含蛋白裂解液与树脂)全部上柱，用适量洗涤缓 冲液(50mMNaH₂PO₄、300mMNaCl、20mMimidazole，pH8.0)进行洗 脱，用适量洗脱缓冲液(50mMNaH₂PO₄、300mMNaCl、250mM imidazole，pH8.0)进行洗脱，所得纯化蛋白透析把缓冲液中的磷酸置 换为50mMTris缓冲液，pH8.0，再用SDS-PAGE分析，结果如图5 所示。

c.活性验证：采用孔雀绿显色反应来验证琥珀酰辅酶A合成酶的 活性，结果如图6所示。

2.酶试剂盒其他组分

酶试剂盒其他组分包括：

1)CoA，C₂₁H₃₆N₇O₁₆P₃S，CAS:85-61-0，可购自例如Sigma(货号C4282)。

2)ATP，C₁₀H₁₆N₅O₁₃P₃，CAS:56-65-5，可购自例如Sigma(货号A1852)。

3)孔雀绿(malachite)，C₂₃H₂₅N₂Cl，CAS:569-64-2，可购自例如Sigma(货 号38800)。

上述各组分的化学结构式分别如下：

3.酶测反应的起始、终止和检测

将200μMCoA，200μMATP和0.5μM琥珀酰辅酶A合成酶全 酶混合，并将其加入含铁和α-酮戊二酸依赖双加氧酶——脯氨酰羟化 酶(PHD)的每一反应孔中，于37℃下，加入底物低氧诱导因子(HIF)的 α亚基的序列多肽起始反应，进行大约30分钟，加入溶解于硫酸的钼 酸铵溶液(将25mM钼酸铵溶解于3.4M硫酸)来终止反应，随后加入 溶解于硫酸的孔雀绿溶液(将1mM孔雀绿溶解于6mM硫酸)来显色。 20分钟后，读取A_620nm吸光度。根据反应体系的体积，可使用分光光 度计或各式酶标仪来测定吸光度。

4.酶活性的计算

制作标准曲线：以不同浓度的磷酸二氢钠作为标准曲线的每一个 样品，加入溶解于硫酸的钼酸铵溶液(将25mM钼酸铵溶解于3.4M 硫酸)来终止反应，随后加入溶解于硫酸的孔雀绿溶液(将1mM孔雀绿 溶解于6mM硫酸)来显色。加入孔雀绿与钼酸铵混合的显色染料，在 620-640nm处测定样品的吸光度。结果如图7所示。

基于上述磷酸标准曲线，可根据酶测反应中的吸光度来计算酶测 反应中所产生的总磷酸浓度，减去没有添加双加氧酶的对照组中的磷 酸浓度(其来源是ATP的水解产生的磷酸浓度，在本实验条件下，其 背景值很低，只有极少量ATP水解)，即得到琥珀酰辅酶A催化产生 的磷酸浓度。

所得到的琥珀酰辅酶A合成酶催化反应的产物磷酸与双加氧酶作 用的产物琥珀酸其摩尔比为1:1，所以可根据孔雀绿显色反应检测到的 磷酸的量推算出体系中琥珀酸起始的含量。

不同pH条件下，琥珀酰辅酶A合成酶催化反应的平衡常数不同。 pH越低，其反应平衡常数越高，反应向有利于产生磷酸的方向移动。 图8为不同pH条件下(pH6.5，20MmMes；pH8.0，100MmTris；pH8.5， 100MmTris)，琥珀酰辅酶A合成酶催化不同浓度的琥珀酸产生琥珀酰 辅酶A和磷酸，并用孔雀绿显色反应检测磷酸的数据。结果显示，在 不同pH条件下，A₆₂₀检测到的磷酸浓度与琥珀酸浓度均显示线性关系 (R²>95％)，且pH越低，转化率越高。在pH6.5-8.5区间反应达到平衡 时，琥珀酸的转化率为40-65％。

可见，在特定pH条件下，用不同浓度的琥珀酸做标准曲线，可 将本发明的方法用于检测待测样品的琥珀酸含量，从而计算出待测双 加氧酶的活性，其中酶活单位为nmoles琥珀酸min^-1mg酶^-1或pmoles 琥珀酸min^-1μg酶^-1等。