信号识别粒子亚基及其编码基因在制耐酸性双歧杆菌中的应用及含该基因的质粒和双歧杆菌

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及SEQIDNo：1所示的信号识别粒 子亚基和/或编码该信号识别粒子亚基的核苷酸序列在制备耐酸性双歧杆菌 中的应用，以及含有所述核苷酸序列的重组表达质粒和耐酸性双歧杆菌。

背景技术

双歧杆菌是肠内最为有益的菌群，适宜生长pH值为6.5-7.5，双歧杆菌 数量的减少乃至消失是“不健康”状态的标志，双歧杆菌是人体健康的晴雨 表。补充双歧杆菌的主要途径是喝含双歧杆菌的酸奶或饮料，也可直接喝双 歧杆菌的微生态制剂(菌粉或1：3服液)。

而公知人体胃液的酸度一般为0.9-1.5，正常情况下，双歧杆菌经过胃液 的强酸性环境后的存活率会大大下降。目前针对双歧杆菌的耐酸性研究主要 集中在对其进行包被、耐酸性驯化等等。但进行包被处理操作繁琐，并且加 入包被菌株的酸奶或乳酸饮料口感会变差，而经耐酸性驯化的双歧杆菌的遗 传特性也较为不稳定。

因此，开发一种稳定的耐较强酸度的双歧杆菌一直是研发的热点。

发明内容

本发明的目的是为了克服以上缺陷，提供了一种稳定的且具有较强耐酸 性的双歧杆菌。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种SEQIDNo：1所示的信 号识别粒子亚基和/或编码该信号识别粒子亚基的核苷酸序列在制备耐酸性 双歧杆菌中的应用。

第二方面，本发明还提供了含有编码SEQIDNo：1所示的信号识别粒 子亚基的核苷酸序列的重组表达质粒。

第三方面，本发明还提供了含有SEQIDNo：1所示的信号识别粒子亚 基和/或编码SEQIDNo：1所示的信号识别粒子亚基的核苷酸序列和/或如上 所述的重组表达质粒的耐酸性双歧杆菌。

通过上述技术方案，将编码SEQIDNo：1所示的信号识别粒子亚基的 基因，优选为含有该基因的质粒P₁₈P转化到双歧杆菌，优选为双歧杆菌 CGMCCNo.2265中，能够耐受pH低至1、优选低至2、更优选低至3.5的 酸度。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与 下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在 附图中：

图1A为Ffh全长阅读框EcoRI+C-ffh-BamHI的琼脂糖电泳图。

图1B为P₁₈P和P₁₈P-Ffh的琼脂糖电泳图。

图1C为P₁₈P穿梭表达载体的构建示意图。

图2为转化有P₁₈P-Ffh大肠杆菌DH5α表达目的基因Ffh情况的 SDS-PAGE电泳图。

图3为显示CGMCCNo.2265中pDG-7质粒的表达情况的琼脂糖电泳 图。

图4显示了CGMCCNo.2265中pDG-7质粒中氯霉素抗性基因Cmr的 表达情况。

图5显示了在pH3.5环境下转化有P₁₈P-Ffh的CGMCCNo.2265的耐酸 性情况。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

SEQIDNo：1所示的信号识别粒子是蛋白质转运途径中一个组成部分， 其在生物体中具有高度保守性。大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中研究表明，SEQ IDNo：1所示的信号识别粒子与蛋白质转运及生物膜形成有关。

本发明的发明人在研究的过程中发现，当将编码SEQIDNo：1的核酸 序列转化到双歧杆菌尤其是CGMCCNo.2265后，其能够表现出较强的耐酸 性，从而完成了本发明。

基于以上发现，一方面，本发明提供了SEQIDNo：1所示的信号识别 粒子亚基和/或编码该信号识别粒子亚基的核苷酸序列在制备耐酸性双歧杆 菌中的应用。

优选的，所述核苷酸序列如SEQIDNo：2所示。其中，由于遗传密码 子的简并性而衍生出的多条核苷酸序列也在本发明的保护范围之内。

如上所述的，尽管将编码SEQIDNo：1的核酸序列转化到双歧杆菌中 即能够制备出耐酸性提高的双歧杆菌，但本发明的发明人在研究的过程中发 现，当所述双歧杆菌优选为CGMCCNo.2265时，其耐酸性能够进一步提高， 并且在胃酸酸度下也能够具有相对较高的存活率。

本发明提供的耐酸性提高的双歧杆菌能够耐受低至1，优选低至2，更 优选低至3.5的酸度。此处需要说明的是，本文中所述的“耐酸”并非指所述 耐酸性菌株能够与正常pH下的菌株一样生长，而是指其相对于对照菌株在 预期酸性pH值下具有显著提高的存活率。

第二方面，本发明还提供了含有如上所述的核苷酸序列的重组表达质 粒。

根据本发明，用于构建所述重组质粒的质粒可以为本领域常规使用的各 种质粒，但本发明的发明人在研究的过程中发现，当使用P₁₈P进行所述重组 表达载体的构建时，由此而得到的转基因菌株的耐酸性能够得到进一步提 高。其中，所述P₁₈P质粒为将如SEQIDNo：3所示的pDG-7质粒的BamH I和HindIII双酶切产物和pUC18质粒的BamHI和HindIII双酶切产物连接 后形成的质粒。其中，进行P₁₈P质粒的制备时，使用pDG-7质粒的BamHI 和HindIII双酶切产物的小片段pMB1。其中，将酶切后的片段进行连接的 方法为本领域公知的各种方法，例如，使用T4DNA连接酶并按照其说明书 进行操作即可。

第三方面，本发明还提供了含有如上所述的信号识别粒子亚基和/或编 码该信号识别粒子亚基的核苷酸序列和/或如上所述的重组表达质粒的耐酸 性双歧杆菌。

优选的，用于制备所述耐酸性双歧杆菌的原始菌株为CGMCCNo.2265。

优选的，本发明提供的耐酸性双歧杆菌能够耐受低至1，优选低至2， 更优选低至3.5的酸度。

根据本发明，制备所述耐酸性双歧杆菌的方法为本领域技术人员所熟 知，本发明在此不再详细赘述。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

(1)质粒DNA提取所需试剂

SolutionI溶液：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl(pH8.0)，10 mmol/LEDTA(pH8.0)。在121℃灭菌15min。

SolutionII溶液：0.2mol/LNaOH，1％(m/V)SDS。溶液Ⅱ要现用现配， 室温下保存。

SolutionIII溶液(100mL)：60.0mL5mol/L乙酸钠，11.5mL冰醋酸， 28.5mL水，4℃保存。

TE缓冲液(pH8.0)：100mmol/LTris-Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA (pH8.0)，分装后在121℃灭菌15min，室温保存。

酚仿混合液(1：1)；异丙醇；70％乙醇；RNA酶A贮存液(10mg/mL)， 小量质粒提取试剂盒(天根，中国)。

(2)质粒构建及转化所需试剂

MRS液体培养基，MRS固体培养基，LB培养基，0.5M灭菌蔗糖溶 液，电转化缓冲液。限制性内切酶(HindIII、BamHI和EcoRI，TAKARA， 日本)；T4DNA连接酶(TAKARA，日本)；DH5α大肠杆菌感受态细胞(天 根，中国)。质粒pDG-7(中国军事医学科学研究院袁静教授馈赠，序列如 SEQIDNo：3所示)；质粒pUC18(TAKARA，日本)。经过滤膜除菌处理 的80mg/mL的氨苄青霉素储备液，于-20℃冻存备用。

(3)SDS-PAGE蛋白质电泳溶液及试剂

2×凝胶加样缓冲液(pH8.0)：称取1.21gTris，10mL甘油，5mL巯 基乙醇、0.1g溴酚蓝，2gSDS溶于去离子水中，用3MHCl调溶液的pH 值至8.0，用去离子水定容到100mL。

5×蛋白电泳缓冲液：称取15.1gTris，72.0g甘氨酸，5.0gSDS溶于 去离子水中，用3MHCl调溶液pH值至8.3，用去离子水定容到1L。使用 前稀释到1×电泳缓冲液。

30％丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺：称取21.9g丙烯酰胺和0.9g亚甲 基双丙烯酰胺溶于去离子水中，滤纸过滤后定容到100mL，于4℃避光贮 存备用。

分离胶缓冲液(pH8.8)：称取12.1gTris溶于150mL去离子水中，用 浓盐酸调溶液的pH值至8.8，用超纯水定容到200mL。

浓缩胶缓冲液(pH6.8)：称取24.22gTris溶于150mL去离子水中， 用浓盐酸调溶液的pH值至6.8，用超纯水定容到200mL。

实施例1

1、重组表达质粒P₁₈P-Ffh的构建

(1)构建表达质粒P₁₈P

将pDG-7质粒及pUC18质粒分别用BamHI和HindIII双酶切，回收 pDG-7酶切产物的小片度pMB1，回收pUC18酶切大产物，在T4DNA连接 酶反应体系于4℃连接10-12h，将质粒热击转入DH5α大肠杆菌感受态细胞 中，于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上涂板培养16h后，挑 取单菌落于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中富集后提取，得 到4758bp的质粒P₁₈P(图1B)。

(2)信号识别粒子亚基编码基因的制备

使用如SEQIDNo：4所示的上游引物(Primer F:CGGAATTCCTTGACAGACAGACTCTCGAATGCGT，下划线处为EcoRI 酶切位点)和SEQIDNo：5所示的下游引物(PrimerR: CGGGATCCTCAGCGACCGAACAGTCCGC，下划线处为BamHI酶切位点) 以SEQIDNo：2所示的核苷酸序列为模板进行扩增，得到带有酶切位点的 1635bp的Ffh全长阅读框EcoRI+C-ffh-BamHI(图1A)，扩增条件如下：

PCR体系25μL：模板1μL，上下游引物各1μL，PfuPCRMasterMix12.5 μL(天根)，ddH₂O9.5μL。

PCR反应条件：95℃预变性10s，95℃变性5s，61℃退火延伸31s， 35个循环。

进行琼脂糖电泳检测后，切胶回收，得到带有酶切位点Ffh全长阅读框 EcoRI+C-ffh-BamHI。

(3)构建Ffh重组表达质粒P₁₈P-Ffh

将质粒P₁₈P和EcoRI+C-ffh-BamHI用BamHI和EcoRI双酶切，将酶切 产物进行琼脂糖凝胶电泳后，纯化回收。在T4DNA连接酶反应体系在4℃ 连接10-12h，将质粒热击转入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，于含有100μg/ mL氨苄青霉素的LB固体培养基上涂板培养16h后，挑取单菌落于含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中富集后提取，得到6377bp的质粒 P₁₈P-Ffh(图1B)，构建流程图如图1C所示。

2、重组表达质粒P₁₈P-Ffh在大肠杆菌中的表达

将分别质粒P₁₈P和质粒P₁₈P-Ffh转化到大肠杆菌DH5α中，并按3％接 种量接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，待菌液浓度达 到OD600＝0.4左右，加入1mMIPTG，诱导4h后，收集菌体；取5mL菌 液，12000×g，4℃离心5min，用预冷无菌PBS洗涤2次后，将菌液重悬于 200μLPBS中，在细胞超声破碎仪上进行破碎，300W，10s/10s，超声15min； 12000×g，4℃离心5min，收集上清，作为SDS-PAGE电泳样品。SDS-PAGE 结果如图2所示。

根据图2可以看出，将质粒P₁₈P-Ffh热击转入DH5α大肠杆菌感受态细 胞中，氨苄青霉素抗生素筛选后，挑取单菌落富集，并用IPTG进行诱导表 达4h。利用细胞破碎仪将大肠杆菌细胞破碎后提取胞内蛋白，进行 SDS-PAGE电泳检测，表明大小约为54kDa的Ffh大肠杆菌中成功表达。

3、pDG-7质粒在CGMCCNo.2265中的表达验证

(1)感受态CGMCCNo.2265的制备

以下操作过程均在冰浴中进行

1)将于-80℃冻存的双歧杆菌甘油管在MRS培养基中活化2代，将第2 代新鲜菌液按1％接种于MRS培养基中厌氧培养24h。

2)将第3代MRS中新鲜菌液按4％重新接种于MRS培养基中，待OD695 ＝0.2；

3)取上一步骤新鲜菌液20mL，6000×g，4℃离心10min；

4)菌体沉淀用1mL预冷0.5M蔗糖洗涤2次，用预冷电转缓冲液洗涤 1次；

5)将洗涤后的菌体沉淀重悬于80μL电转缓冲液中，4℃冰箱中放置3.5 h。

(2)pDG-7的表达

1)取80μL制备好的感受态细胞于冰浴预冷的无菌PCR管中，加入2μL 质粒pDG-7(0.5μg左右)，混匀后将该体系转入冰浴预冷的电击杯中；冰 浴中取出电击杯，擦干金属外壁的水分，放入电转仪中进行电击，12kV/cm， 电击1次后迅速放入冰浴，放置5min；将电击液转入装有2mLMRS培养 基并经过充氮处理的青霉素小瓶中，于37℃复苏8h。将复苏好的转化液全 部转入1mLMRS液体培养中进行富集培养。通过双歧杆菌质粒提取方法， 在双歧杆菌CGMCCNo.2265中提取出质粒pDG-7，并进行琼脂糖电泳验证 (见图3)。

根据图3可以看出，pDG-7质粒能够在双歧杆菌CGMCCNo.2265中成 功复制，其中，S-Plasmid(6.28)为CGMCCNo.2265的pDG-7质粒提取液。

2)利用pDG-7质粒上氯霉素抗性基因Cmr的特异引物(Cmr-F1： GCGACGGAGAGTTAGGTTATTGGG，如SEQIDNo：6所示；Cmr-R1： AGCCAGTCATTAGGCCTATCTGA，如SEQIDNo：7所示)进一步验证所 提取质粒为pDG-7，结果如图4所示。

根据图4可以看出，pDG-7质粒能够在双歧杆菌CGMCCNo.2265中成 功复制，其中，S-Plasmid(6.28)为CGMCCNo.2265的pDG-7质粒提取液， B-genome为正常CGMCCNo.2265的质粒提取液。

4、耐酸性验证

将双歧杆菌CGMCCNo.2265及CGMCCNo.2265-Ffh(+)在致死pH1、 2和3.5条件的耐酸性进行比较。

将CGMCCNo.2265活化菌液和CGMCCNo.2265-Ffh(+)种子液，同 时按5％接种入MRS培养基中，至菌液浓度为OD600＝0.3时，均加入1mM 的IPTG，待菌液浓度到达OD600＝0.6时，分别取1mL菌液，梯度稀释后 进行倒板计数；剩余菌液中的菌体分别在pH1、2和3.5条件下进行胁迫处 理2h，检测存活数。pH3.5条件下的菌体存活率如图5所示。

研究结果显示，CGMCCNo.2265-Ffh(+)在pH1、2和3.5中的存活 率分别为5％、8％和11％，显著高于CGMCCNo.2265在pH1、2和3.5中 的存活率为0.1％、0.6％和1.3％。该结果表明Ffh过表达可以显著提高双歧 杆菌的酸胁迫耐受性。

实施例2

按照实施例1的方法进行各步骤，不同的是，所使用的双歧杆菌为青春 双歧杆菌CGMCCNo.6270。

结果显示，转化有P₁₈P-Ffh的该菌株在pH1、2和3.5中的存活率分别 为2％、5％和8％，正常菌株在pH1、2和3.5中的存活率分别为0.1％、0.7％ 和1.5％。

实施例3

按照实施例1的方法进行各步骤，不同的是，所使用的质粒不是P₁₈P， 而是pMG36e质粒。

结果显示，该质粒在CGMCCNo.2265中的表达量极低，在琼脂糖电泳 中只能够隐约可见，且转化有该质粒的CGMCCNo.2265在pH1、2和3.5 中的存活率分别为3％、5％和7％。

对比例1

按照实施例1的方法进行各步骤，不同的是，所使用的基因不是SEQID No：2，而是SEQIDNo：8。

结果显示，且转化有该耐酸基因的CGMCCNo.2265在pH1、2和3.5 中的存活率分别为1.5％、4％和6％。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方 案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。