一种快速检测猪瘟病毒/猪繁殖与呼吸综合征病毒/猪伪狂犬病毒/猪细小病毒的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种快速检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小 病毒试剂盒，特别是涉及一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术一管反应即可检测并鉴 别出猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的试剂盒。

背景技术

猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcinerepr oductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PR V)和猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)是4种主要的引起猪繁殖障碍的传染病病原。在规 模化和集约化的大中型猪场中，繁殖障碍性疾病已成为最重要的疫病之一，并给养猪业造成 了严重的经济损失。其中CSFV和PRRSV主要损害猪的免疫系统，降低机体的免疫力，从 而造成其他病原的混合感染。当猪同时感染上述两种或多种病原体时，疾病的临床症状和病 变将明显加重。由于CSFV、PRRSV、PRV和PPV这4种病毒感染后具有相似的临床症状且 易混合感染致病，因此给猪繁殖障碍性疾病的诊断带来一定的的困难。因此，建立一种同时 快速检测这4种病原体的方法具有重要的应用价值。

在病原学诊断方法中，荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速及高通量等优 点，并可以对病原进行定量检测，近年来已被广泛应用于疾病诊断和鉴别诊断方面。鉴于猪 繁殖障碍疾病的复杂性，本研究利用4种不同的荧光素分别标记CSFV、PRRSV、PRV和PPV 特异性探针建立了一种用于同时检测这4种病原的多重荧光定量PCR方法，为这4种病原的 早期及鉴别检测提供了新的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术对CSFV、PRRSV、 PPV和PPV四种病毒进行鉴别的试剂盒，利用本试剂盒可以准确区分这四种病毒。

根据GeneBank中登录的CSFV、PRRSV、PPV和PPV序列，应用DNAMAN软件进行 同源性分析，并找出各个病毒的保守区。应用PrimerExpress3.0软件根据每种病毒基因的保 守区基因设计特异性的引物及探针，并通过NCBI的BLAST功能对其特异性进行初步鉴定。 4条探针的5’端分别用FAM、HEX、CY5和TexasRed标记，以便于在检测中区分。这些引 物探针在含有耐热DNA聚合酶，逆转录酶、高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的RT-PCR 反应酶系以及含有Mg²⁺等成份的RT-PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩 增。

本发明所涉及的试剂盒主要包括：1)RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应 酶系、DEPCH2O，阴性质控品、阳性质控品和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

本发明的一个优选实施方案是引物探针混合液由四种致病性病毒特异性的正、反向引物， 特异性的探针组成，其特征在于：

1)CSFVF病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是 5’-ATGCAGATGGTGTGGCTTYG-3’和5’-AAGCATCATGACTCCCCYC-3’，CSFVF病毒特 异性的探针的序列是5’-AGCCYGACGGACTCCCRCACTACC-3’，探针的5’端和3’端分别结合 有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；

2)PRRSVF病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是5’- TTGTGTCTGTCGTCGATCCA-3’和5’-CGTMGGCAAACTAAACTCCA-3’，PRRSVF病毒特 异性的探针的序列是5’-TTCAATCAGGGCGCTGGRACTTGTG-3’，探针的5’端和3’端分别结 合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1；

3)PRV病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-GAGCGACGACAGCTTCAAG -3’和5’-CGTTCTTGCGGTACCAGTAG-3’，PRV病毒特异性的探针的序列是5’- CGTGGACGTGATGCGATTCCTGACG-3’，探针的5’端和3’端分别结合有荧光发生基团CY5 和荧光淬灭基团BHQ2；

4)PPV病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是5’- AATTTCAATACTTGGGGGAGG-3’和5’-ATGTATTCTTTTGTATGTTTCGTGTT-3’，PPV病毒 特异性的探针的序列是5’-CACTGCACACGCATCAAGACTCATACATC-3’，探针的5’端和3’ 端分别结合有荧光发生基团TexasRed和荧光淬灭基团BHQ3；

本发明的另一个优选实施方案是引物探针混合液中引物浓度为0.2～0.5μmol/L，探针浓 度为0.1～0.25μmol/L。

本发明的另一个优选实施方案是RT-PCR反应液由Tris-HCl(50mmol/L，pH8.0～8.8)、 MgCl₂(3～8mmol/L)、KCl(150～350mmol/L)组成。

本发明的另一个优选实施方案是RT-PCR反应酶系由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs 组成。逆转录酶可选择mMLV等常用逆转录酶。热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs均可采用 市售产品，如Qiagen公司的产品；其中每人份RT-PCR反应酶系中热启动Taq酶的用量为 5～10U，逆转录酶用量为1.5～5U，dNTPs用量为6～12mmol。

本发明的另一个优选实施方案是PCR扩增的条件为：50℃15分钟，95℃15分钟；94℃ 10秒，58℃35秒，40个循环(退火时收集荧光信号)。

本发明的一个优选实施方案是试剂盒提供了质控品，分别为阴性质控品和阳性质控品。 阴性质控品为健康猪只的血浆，阳性质控品为人工合成的含有四种病毒目的基因的重组质粒。 试剂盒中进行待检标本检测可同时进行两种质控品的检测，仅当阳性质控品检测时FAM、 HEX、TexasRed及CY5通道荧光信号均呈阳性，阴性质控品检测四个通道荧光信号均呈阴 性时，待检标本的检测结果才有效。

本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗时少， 且最大限度地减少了污染的发生。准确检测并区分4种引起猪繁殖障碍性疾病的病毒即：猪 瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒，可广泛应用于猪繁殖障碍 性疾病临床早期诊断、口岸检验检疫、疫情防控、及科学研究等多个领域。

本发明与现有技术相比优点为：①对CSFV、PRRSV、PRV和PPV四种病毒核酸扩增水 平进行检测，可反映出样本中CSFV、PRRSV、PRV和PPV感染的状态及确认是何种病毒感 染，可用于CSFV、PRRSV、PRV和PPV的监测和防控及临床诊断，有助于猪繁殖障碍性疾 病的早期诊断和治疗；②分别针对CSFV、PRRSV、PRV和PPV四种病毒核酸特异性序列设 计专用引物、探针，保证检测的特异性和准确性，也具有较高通量，操作简便、相对降低成 本的优点；③一份样本一次检测即可鉴别四种病毒的感染情况，检测过程只需1.5h，相比一 个样本进行4次检测，大大减少了工作量，提高了检测效率；相对于已有的核酸杂交法检测 技术，检测所需时间缩短了一半以上；④试剂采用阴阳性质控品作为质控，能够对试剂的质 量进行严格的把控；⑤试剂采用RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系的大包 装设置，适合多种荧光检测设备，具有适用性更加广泛的特点。

附图说明

图1显示试剂盒阴性质控品的扩增曲线。图中没有S型扩增曲线，说明FAM、HEX、Texas Red及CY5通道荧光信号均呈阴性。

图2显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明该通道的 荧光信号呈阳性。

图3显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中HEX通道的扩增曲线为S型，说明该通道的 荧光信号呈阳性。

图4显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中CY5通道的扩增曲线为S型，说明该通道的 荧光信号呈阳性。

图5显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中TexasRed通道的扩增曲线为S型，说明该 通道的荧光信号呈阳性。

图6显示CSFV病毒标准品的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明试剂盒能 够检测出CSFV病毒。

图7显示PRRSV病毒标准品的扩增曲线。图中HEX通道的扩增曲线为S型，说明试剂盒 能够检测出PRRSV病毒。

图8显示PRV病毒标准品的扩增曲线。图中TexasRed通道扩增曲线均为S型，说明试剂盒 能够检测出PRV病毒。

图9显示PPV病毒标准品的扩增曲线。图中Cy5通道扩增曲线均为S型，说明试剂盒能够 检测出PPV病毒RNA。

图10显示特异性样本的扩增曲线。图中FAM、HEX、Cy5和TexasRed通道没有S型扩增 曲线，说明均呈阴性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。

实施例1试剂盒的制备及其使用

1、制备包括下列组成成分的试剂盒

引物探针混合液(25μl/管)1管，RT-PCR反应液(250μl/管)，RT-PCR反应酶系(75μl/ 管)1管，阳性质控品(200μl/管)1管，阴性质控品(200μl/管)1管，DEPCH₂O(2000μl/ 管)1管。

2、目的基因重组质粒的制备

由委托公司合成并纯化4种病毒目的基因的重组质粒，通过紫外分光光度仪测得浓度， 然后计算其DNA拷贝数，并将4种DNA用ddH₂O分别稀释至1.0×10⁵copies/mL～ 1.0×10²copies/mL的标准品。

3、实时荧光定量PCR扩增及检测

3.1试剂准备：

按比例取相应量的引物探针混合液1μl、RT-PCR反应液5μl、RT-PCR反应酶系3μl、DEPC H₂O11μl，充分混匀后备用。

3.2加样：

向PCR反应管中，分别加入阴、阳性质控品、目的基因全长RNA溶液5μl，盖紧管盖， 放入仪器样品槽。

3.3编辑(ABIPrism7500荧光定量PCR仪)

打开Setup窗口，按对应顺序设置阴、阳性质控品和待测标本，并在Name栏中设置样 品名称。选中所有设置样品孔，双击，选择AddDetector，选择Reporter为FAM和Quencher 为none，再选择Reporter为HEX和Quencher为none；再选择Reporter为TexasRed和Quencher 为none；然后选择Reporter为Cy5和Quencher为none后关闭窗口。在PassiveReference中 选择(none)。打开instrument窗口设置循环条件：50℃15分钟，95℃15分钟；94℃10秒， 58℃35秒，40个循环。所有设置完成后保存文件，运行。

3.4结果分析：

反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Ampplot窗口。选择分析的目的样品 所在位置。将Baseline数值改为start：3，stop：10，并打开manual设定Threshold：1.5±100000。 双击Rn坐标上数值打开Graphsettings窗口，将PostRunSettings中Log改为Linear，OK后 打开Analysispreferences窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。

检测结果：CSFV、PRRSV、PRV、PPV病毒标准品的扩增曲线均为S型，且有明显的 梯度(见附图6，7，8，9)。本试剂盒的检测灵敏度可以达到10²copies/mL。

实施例2应用一种快速检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病 毒试剂盒检测特异性样品

选取临床上确诊的口蹄疫病毒、猪圆环病毒2型、狂犬病毒、猪丹毒杆菌、钩端螺旋体、 猪乙型脑炎病毒、猪流感病毒的阳性样本各1例作为特异性样本，对所有样本进行核酸提取， PCR扩增及结果分析步骤参照实施例1进行，同时进行阴，阳性质控品的检测。

检测结果：阴性质控品的扩增曲线不呈S型(见附图1)，阳性质控品的扩增曲线为明 显S型曲线(见附图2，3，4，5)，阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求，因此待检标 本的检测结果是有效的。由待检标本的检测结果可知本试剂盒对口蹄疫病毒、猪圆环病毒2 型、狂犬病毒、猪丹毒杆菌、钩端螺旋体、猪乙型脑炎病毒、猪流感病毒无非特异扩增(见 附图10)。

本次试验中9例标本的检测结果与病毒培养鉴定结果完全吻合，说明利用本试剂盒检测 猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒是可行的。本试剂盒操作 简便，检测时间短，可实现高通量检测，加之其价格低廉，有望应用于猪繁殖与障碍性疾病 的临床检测、检验检疫以及疫情监测。