一种注射用丹参多酚酸稳定性的研究方法及其降解途径的分析方法

技术领域

本发明涉及中药制剂稳定性研究，具体涉及一种注射用丹参多酚酸稳定性的研究方法及其降解途径的分析方法。

背景技术

中药注射剂是在中医理论指导下，采用现代科学技术与方法，将中药饮片提取、纯化后制成的供注入体内的溶液、乳状液及供临用前配制成溶液的粉末或浓溶液的无菌制剂。与丸、散、膏、丹等传统中药剂型相比较，中药注射液具有药效迅速、作用力强、生物利用度高等优势，尤其在治疗心脑血管疾病、急性感染性疾病、恶性肿瘤等疾病中发挥着不可替代的重要作用。心脑血管疾病是威胁人体健康的常见病，它的致死、致残的几率已经远远超过了癌症和艾滋病。中药在治疗心脑血管疾病已有两千多年的历史，积累了丰富的经验，并且疗效确切，在减少发病率、死亡率、致残率方面越来越显示出其独有的优势。中药由于作用多靶点，个体针对性强，副作用少，整体调整人体阴阳、气血、脏腑功能，可使患者症状明显改善。常用中药如速效救心丸、步长脑心通、五福心脑清软胶囊、通心络胶囊、复方丹参滴丸、注射用血栓通、注射用丹参多酚酸盐和注射用丹参多酚酸等，在防治心脑血管疾病中有较好的疗效且毒副作用小。

中药注射剂不良反应屡见报道，部分可能与活性成分的稳定性有关。稳定性是药物质量的重要影响因素。而丹参中成分结构、极性、活性差别较大，在一种物理化学环境下难以保障其所有成分的含量稳定。特别是丹参多以中药复方配伍形式用药，其中化学成分在复杂的体内、外环境中所受到的影响较难控制。即使是同一制剂也会因生产工艺条件、储藏环境的差别带来稳定性的影响，进而影响有效成分含量，引起不良反应的产生。安全、有效、质量可控是药物使用的三个基本前提。含丹参的中药成品数量众多，厂家不一， 产品质量难以保障。在国家质检部门抽验的不合格药品中丹参及丹参制剂次次榜上有名，这极有可能是其引起临床不良反应的原因。

由于中药成分复杂、结构多样，加上中药制剂客观存在着物理化学、生物等诸多因素的干扰，不容易控制，其稳定性是多因素综合作用的结果，故稳定性的研究不能单纯的以某一个或几个活性成分为指标进行测定。现阶段对中药制剂的稳定性研究缺乏系统的降解机理研究，更没有基于稳定性的质量控制方法，稳定性研究水平较低。丹参作为心脑血管疾病应用最多的药物，因其含有易降解结构，稳定性较差，不仅降低临床疗效，对临床应用也带来安全隐患。

注射用丹参多酚酸为传统中药提取所得用于血管类疾病的药物，主要成分为原儿茶醛、丹参素、咖啡酸、丹酚酸H、丹酚酸D、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸B/E异构体、丹酚酸L、9”’-紫草酸B单甲酯异构体；其中丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸这三种成分的含量约占注射用丹参多酚酸总含量的60％，注射用丹参多酚酸具有纯度高、毒性小、安全性好、临床应用范围广、疗效显著等优点；其中，注射用丹参多酚酸由丹参水溶性提取物中分离出的多种酚酸类成分经过冷冻干燥加工而成的冻干粉针，为现行标准中药5类新药，为传统丹参类中药注射剂的升级换代品种，临床前研究表明，该药疗效确切，2011年已开始生产并销售。

注射用丹参多酚酸中的主要活性成分为丹参中水溶性酚酸类，大部分为咖啡酸缩合物，由于酯键的存在，多数缩合酚酸的稳定性较差，易受高温、光照、酸碱等因素的影响发生降解，引起丹参制剂质量发生变化，对于注射用丹参多酚酸的含量测定和降解产物的测定，需要建立并验证一个稳定性指示性的分析方法；系统稳定性和稳定性指示性分析方法(stability-indicating method,S-I)可反映出在稳定性试验条件下药物质量的变化，是了解中药成分降解变化规律、保证中药制剂质量稳定、安全有效的有力手段，被广泛应用于药物的质量控制和稳定性研究等领域。注射用丹参多酚酸是直接入血的注射剂，其主要成分酚酸类和皂苷类均含有易被破坏的官能团结构，而现阶段无关于其系统性的稳定性研究。

发明内容

本发明设计开发了一种注射用丹参多酚酸稳定性的研究方法，目的是根据不同的降解试验所产生的降解产物建立的指示性的质谱图及色谱图，能够对注射用丹参多酚酸制剂在生产、储存等条件下样品的随性检验，确定其降解产物。

另外，本发明的另一个目的是在建立稳定性研究方法的过程中，考察在不同降解试验条件下的注射用丹参多酚酸稳定性，全面系统性的分析确定注射用丹参多酚酸在不同的降解条件下的降解产物。

同时，本发明还设计开发了一种注射用丹参多酚酸降解途径的分析方法，目的是能够根据对注射用丹参多酚酸制剂中所含成分的检验分析，推测其在生产、储存等条件下样品可能发生的降解途径。

本发明提供的技术方案为：

一种注射用丹参多酚酸稳定性的研究方法，包括：

对注射用丹参多酚酸分别进行高温降解试验、氧化降解试验、金属离子降解试验及光照降解试验，得到降解产物；

对所述降解试验的降解产物通过超高效液相-质谱检测方法得到质谱图，对所述质谱图中的碎片离子峰进行分析，确定所述降解产物；

对所述降解产物富集后，采用超高效液相色谱检测方法对注射用丹参多酚酸原料及所述降解产物同时检测，得到超高效液相色谱图；

其中，根据所述质谱图及所述色谱图，能够对所述注射用丹参多酚酸样品进行指示性分析，确定其降解产物。

优选的是，对注射用丹参多酚酸进行的高温降解试验的反应温度为80℃。

优选的是，对注射用丹参多酚酸进行的氧化降解试验使用的氧化剂为3％双氧水。

优选的是，对注射用丹参多酚酸进行金属离子降解试验使用一价金属离子溶液、二价金属离子溶液及三价金属离子溶液进行试验；其中，一价金属离子溶液为氯化钾溶液，所述二价金属离子溶液为氯化钙，所述三价金属离子溶液为氯化铝溶液，并且所述溶液浓度均为0.1mol/L。

优选的是，对注射用丹参多酚酸进行的光照降解试验使用1023×10 lux200白炽灯或18 lux200紫外灯进行光照。

优选的是，对注射用丹参多酚酸进行降解试验的过程中，当注射用丹参多酚酸中的有效成分丹酚酸B降解至初始浓度10％，终止试验。

优选的是，对注射用丹参多酚酸进行降解试验的过程中，选用丹酚酸B，迷迭香酸，紫草酸，丹参素，原儿茶醛，咖啡酸为对照品。

优选的是，所述质谱图包括一级质谱图和/或二级质谱图。

一种注射用丹参多酚酸降解途径的分析方法，包括：

对所述注射用丹参多酚酸进行超高效液相-质谱检测，得到其质谱图，通过所述质谱图中的碎片离子峰分析其降解产物；

通过所述降解产物、碎片离子峰及其出峰时间对其降解途径进行分析：

当所述降解产物中包括丹酚酸S、丹酚酸T、丹酚酸C和/或异丹酚酸C时，所述降解途径为高温降解；

当所述降解产物中包括原儿茶酸、丹酚酸F和/或碎片离子峰为724时，所述降解途径为氧化降解；

当所述降解产物中包括碎片离子峰为715，并且所述碎片离子峰的出峰时间在8.8分钟至9.2分钟之间和/或9.9分钟至10.15分钟之间时，所述降解途径为三价金属离子降解；

当所述降解产物中包括碎片离子峰为178和/或736时，所述降解途径为光照降解。

优选的是，通过所述降解产物、碎片离子峰及其出峰时间对其降解途径进行分析，还包括：

当所述降解产物中包括紫草酸同分异构体时，所述降解途径包括高温降解或者三价金属离子降解；

当所述降解产物中包括碎片离子峰为715，并且所述碎片离子峰的出峰时间在10.34分钟至10.45分钟之间时，所述降解途径包括高温降解、二价金属离子降解、三价金属离子降解或者光照降解；

当所述降解产物中包括碎片离子峰为715，并且所述碎片离子峰的出峰时间在10.80分钟至10.90分钟之间时，所述降解途径包括高温降解或者氧化降解。

本发明与现有技术相比较所具有的有益效果：

1、本发明通过不同的降解试验，采用超高效液相对降解产物进行检测分析，在现有的色谱条件下能够对降解产物进行比对，建立指示性的质谱图及色谱图，由于其对注射用丹参酚酸的原始原料及降解产物具有很好的覆盖能力，能够同时测定注射用丹参多酚酸中的活性成分及其降解产物，可以用来对注射用丹参酚酸进行稳定性角度的质量控制，用于制剂在生产、储存等条件下样品的随性检验，确定其降解产物；

2、本发明中在研究过程中所采用的超高效液相检测方法具有流动相简单，较短时间的洗脱梯度，合理的分析时间，对降解产物和原成分充分的分离的特点；

3、本发明所建立的分析方法具有灵敏度高、重复再现性好，能够通过降解产物及质谱图中的碎片离子峰初步分析出可能存在的降解途径，对生产、运输及存储过程条件具有指导性意义。

附图说明

图1为注射用丹参多酚酸0时刻点的质谱图。

图2为注射用丹参多酚酸高温降解试验质谱图。

图3为丹酚酸S的一级质谱图。

图4为丹酚酸S的二级质谱图。

图5为紫草酸同分异构体的一级质谱图。

图6为紫草酸同分异构体的二级质谱图。

图7为高温降解试验后化合物VIII的一级质谱图。

图8为高温降解试验后化合物VIII的二级质谱图。

图9为化合物X的一级质谱图。

图10为化合物X的二级质谱图。

图11为异丹酚酸C的一级质谱图。

图12为异丹酚酸C的二级质谱图。

图13为丹酚酸C的一级质谱图。

图14为丹酚酸C的二级质谱图。

图15为注射用丹参多酚酸氧化降解试验质谱图。

图16为丹酚酸F的一级质谱图。

图17为丹酚酸F的二级质谱图。

图18为化合物XI的一级质谱图。

图19为化合物XI的二级质谱图。

图20为注射用丹参多酚酸二价金属离子降解试验质谱图。

图21为二价金属离子降解试验后化合物VIII的一级质谱图。

图22为二价金属离子降解试验后化合物VIII的二级质谱图。

图23为注射用丹参多酚酸三价金属离子降解试验质谱图。

图24为化合物V的一级质谱图。

图25为化合物V的二级质谱图。

图26为化合物VII的一级质谱图。

图27为化合物VII的二级质谱图。

图28为注射用丹参多酚酸光照降解试验质谱图。

图29为化合物III的一级质谱图。

图30为化合物III的二级质谱图。

图31为化合物IX的一级质谱图。

图32为化合物IX的二级质谱图。

图33为注射用丹参多酚酸在降解条件下色谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例

1仪器与试剂

1.1仪器

UPLC-Q/TOF(超高效液相-飞行时间质谱)：美国waters公司，Acquity UPLC H-Class；UPLC：美国waters公司，Acquity UPLC H-Class；超纯水仪： 美国Millipore公司，Mill-QⅡ；精密移液枪：德国eppendorf公司，Eppendorf；离心机：中国湘仪离心机仪器有限公司，H1650-W；水浴锅：中国博讯实业有限公司，SSW-600-7S；pH仪：瑞士Mettler-Toledo公司，DELTA 320；恒温恒湿箱：德国MMM公司，Climacell 111,222,404,707；十万分之一天平：瑞士Mettler Toledo公司，AX205。

1.2试剂

甲醇：Sigma公司；乙腈：Sigma公司；氯化钾、氯化钙、氯化铝：天津大茂公司；超纯水：Millipore超纯水净化系统。

2样品配制

2.1试药

注射用丹参多酚酸(国药准字Z20110011，批号：20121102，12123607，12122807)，由天津天士力之骄药业有限公司提供。

2.2对照品

丹酚酸B(批号：W15-5-7)，紫草酸(批号：W14-8-0)，迷迭香酸(批号：W10-5-3)，丹参素(批号：W10-2-6)，原儿茶醛(批号：W06-2-5)，咖啡酸(批号：W05-5-6)购买于天津中新药业集团股份有限公司。

2.3对照品溶液的制备

分别精密称取丹酚酸B，迷迭香酸，紫草酸，丹参素，原儿茶醛，咖啡酸，5.010mg，5.000mg，5.000mg，5.010mg，5.020mg，4.990mg，分别置于经高温灭菌10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，4℃放置，配制成丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸对照品储备液。

每次使用前取丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸对照品储备液，超纯水稀释至10μg·mL^-1，涡旋混匀，12000rpm离心5min，为新鲜配置的丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸对照品溶液。

3分析方法

3.1色谱条件

色谱柱：Waters Acquity T3(2.1×50mm,1.7μm)分析柱

流动相A：水(含0.1％甲酸)

流动相B：乙腈

检测波长：280nm

流速：0.3ml/min

柱温：25℃

进样体积：5μL

分析时间：20min

液相梯度洗脱程序如表1所示

表1 液相梯度洗脱程序

3.2质谱条件

电喷雾离子源；负离子检测模式；扫描范围：100-1700amu；毛细管电压(kV)：3.02；去溶剂化温度(℃)：400；离子源温度(℃)：100；气帘气流量(L/h)：50；脱溶剂气流量(L/h)：600。

3.3注射用丹参多酚酸成分定性鉴别质谱解析

根据注射用丹参多酚酸超高效液相-飞行时间质谱(UPLC-Q/TOF-MS)一级质谱全扫描的结果(如图1所示)，并通过与部分标准品(丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、咖啡酸、原儿茶醛、丹参素)的比对，共鉴定出13个化合物，均具有紫外吸收，通过对照品鉴定的化合物有6个，分别为丹酚酸B(Salvianolic acid B)、紫草酸(Lithospermic acid)、迷迭香酸(Rosmarinic acid)、咖啡酸(Caffeic acid)、原儿茶醛(Protocatechui aldhyde)、丹参素(DSS)；对其余7个化合物进行推导，成分可能分别为丹酚酸H(Salvianolic acid H)、丹酚酸D(Salvianolic acid D)、丹酚酸E(Salvianolic acid E)、丹酚酸B/E同分异构体(Salvianolic acid B/E isomer)、丹酚酸L(Salvianolic acid L)、化合 物12和9″′-紫草酸B单甲酯同分异构体(9″′-methyl lithospermate B isomer)。

丹酚酸B在注射用丹参多酚酸中的含量最多，其次为迷迭香酸和紫草酸；这三种成分约占注射用丹酚酸多酚酸总浓度的60％。以面积归一化法计，目前可定量的13种成分占总面积的65％，如表1所示，为这13种化合物的质谱信息。

表1 注射用丹参多酚酸中主要成分的质谱信息

4中药注射剂注射用丹参多酚酸制剂降解机理研究

4.1高温降解试验

精密称取注射用丹参多酚酸5.010mg，置于经高温灭菌的10mL棕色容量瓶中，超纯水定容至刻度，密封，80℃水浴保存，一定时间间隔取样，12000rpm离心5min，进样。以丹酚酸B降解至初始浓度10％时，终止反应，利用UPLC-Q/TOF进行注射用多酚酸定性鉴定。每个试验平行2次。

注射用丹参多酚酸在高温条件下，0时刻点的13个峰，至反应终止时丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸D、丹酚酸L、m/z701和9″′-紫草酸B单甲酯同分异构体(9″′-紫草酸B单甲酯isomer)的含量呈现持续下降趋势；原儿茶 醛、丹参素、咖啡酸、丹酚酸H、丹酚酸B/E同分异构体(丹酚酸B/E isomer)、迷迭香酸、紫草酸含量先增大后降低；反应终止时，丹酚酸B/Eisomer、咖啡酸已降解完全。而新增的6个化合物中，化合物II、VI、VIII、X、XII、XIII含量呈现上升趋势。

注射用丹参多酚酸降解0时刻点和反应终止时刻点色谱图如图1及图2所示，紫外响应下以面积归一化法统计峰面积超过总面积5％的各色谱峰被统计为制剂主要成分，根据注射用丹参多酚酸UPLC-Q/TOF-MS一级质谱全扫描的结果，结合UPLC-Q/TOF-MS/MS二级质谱图的碎片离子信息，对反应终止时刻新增的6个化合物的结构进行推测，结果如下所示。

4.1.1注射用多酚酸高温下降解产物解析

化合物II：从一级质谱图上可以观察到碎片离子峰(m/z)539[M-H]^-(如图3所示)，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为25V的作用下给出了碎片离子m/z341,297(如图4所示)；m/z341推测其为m/z539脱去一分子丹参素形成，m/z297为m/z341继续脱去一分子CO₂形成，推测化合物II为丹酚酸S，其结构式为

化合物VI：从一级质谱图上可以观察到m/z537[M-H]^-(如图5所示)，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为10V的作用下给出了碎片离子m/z493,295(如图6所示)；m/z493推测其为m/z537脱去一分子CO₂形成，m/z295为m/z493继续脱去一分子丹参素形成。根据紫草酸在紫外检测器上的保留时间，推测化合物VI为紫草酸同分异构体(紫草酸isomer)，其可能的结构有三种：

化合物VIII：从一级质谱图上可以观察到m/z715[M-H]^-(如图7所示)，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为25V的作用下给出了碎片离子m/z517,393,321,195(如图8所示)；该化合物的分子量比丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸L少2，即该化合物的结构中比丹酚酸B及其同分异构体少两个氢原子。

化合物X：从一级质谱图上可以观察到m/z715[M-H]^-(如图9所示)，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为25V的作用下给出了碎片离子m/z671,393,321,295(如图10所示)；该化合物的分子量比丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸L少2，即该化合物的结构中比丹酚酸B及其同分异构体少两个氢原子。

化合物XII和化合物XIII：从一级质谱图上均可以观察到m/z491[M-H]^-(如图11及图13所示)，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为15V的作用下均给出了碎片离子m/z293,197(如图12及图14所示)；m/z293推测其为m/z491脱去一分子丹参素形成，m/z197为m/z491继续脱去一分子C₁₇H₁₁0₅形成，丹酚酸C的出峰时间比异丹酚酸C稍早，因此推测化合物XII和XIII分别为丹酚酸C和异丹酚酸C，其中，丹酚酸C结构为

如表2所示为注射用丹参多酚酸的高温降解试验质谱信息总结。

表2 注射用丹参多酚酸在高温条件下的质谱信息

注：降解产物为加粗部分

4.2氧化的影响

精密称取注射用丹参多酚酸5.000mg，置于经高温灭菌的10mL棕色容量瓶中，3％双氧水定容至刻度，密封，室温保存，一定时间间隔取样，12000rpm离心5min，进样。以主要成分丹酚酸B降解至初始浓度10％时，终止反应，利用UPLC-Q/TOF进行注射用丹参多酚酸定性鉴定。每个试验平行2次。

注射用丹参多酚酸在氧化条件下，0时刻点的13个峰，至反应终止时丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸L、迷迭香酸、m/z701和9″′-紫草酸B单甲酯isomer、丹酚酸B/E isomer、紫草酸含量呈现持续下降趋势；原儿茶醛、丹参素、咖啡酸、丹酚酸H、丹酚酸D含量先上升后下降；其中原儿茶醛、丹酚酸B/E isomer已降解完全。而新增的4个化合物含量呈现上升趋势。

根据注射用丹参多酚酸UPLC-Q/TOF-MS一级质谱全扫描的结果，结合UPLC-Q/TOF-MS/MS二级质谱图的碎片离子信息，对新增的4个化合物的结构进行推测，结果如下所示。

注射用丹参多酚酸降解0时刻点和反应终止时刻点色谱图如图1及图15所示，紫外响应下以面积归一化法统计峰面积超过总面积5％的各色谱峰被统计为制剂主要成分，根据注射用丹参多酚酸UPLC-Q/TOF-MS一级质谱全扫描的结果，结合UPLC-Q/TOF-MS/MS二级质谱图的碎片离子信息，对反应终止时刻新增的4个化合物的结构进行推测，结果如下所示。

4.2.1注射用多酚酸氧化降解产物解析

化合物IV：从一级质谱图上可以观察到m/z313[M-H]^-(如图16所示)，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为20V的作用下给出了碎片离子m/z269,109(如图17所示)；m/z269推测其为m/z313脱去一分子CO₂形成，推测化合物4为丹酚酸F，其结构为

化合物X：从一级质谱图上可以观察到m/z715[M-H]^-，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为25V的作用下给出了碎片离子m/z671,393,321，其一级>

化合物XI：从一级质谱图上可以观察到m/z723[M-H]^-(如图18所示)，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为25V的作用下给出了碎片离子m/z537,493,295(如图19所示)。要确定其分子结构，还需结合红外光谱，核磁共振等技术做进一步确证。

如表3所示为注射用丹参多酚酸的氧化降解试验质谱信息总结。

表3 注射用丹参多酚酸在氧化条件下的质谱信息

注2：降解产物为加粗部分

4.3一价、二价、三价金属离子的影响

分别精密称取注射用丹参多酚酸4.98mg、5.00mg、5.01mg，置于3个经高温灭菌的10mL棕色容量瓶中，分别以0.1mol·L^-1的KCl,CaCl₂和AlCl₃定容至刻度，密封，室温保存，一定时间间隔取样，12000rpm离心5min，进样。以丹酚酸B降解至初始浓度10％时，终止反应，利用UPLC-Q/TOF进行注射用丹参多酚酸定性鉴定。每个试验平行2次。

结果显示，注射用丹参多酚酸在0.1mol·L^-1的KCl中无明显变化；在CaCl₂中注射用丹参多酚酸降解不完全；而在AlCl₃中注射用丹参多酚酸15天之内丹酚酸B降解完全。

4.3.1注射用丹参多酚酸在二价金属离子中降解产物的解析

注射用丹参多酚酸在二价金属离子条件下，降解0时刻点和反应终止时刻点色谱图如图1及图20所示，至反应终止时丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸L、丹酚酸B/E isomer、丹酚酸D、m/z701和9″′-紫草酸B单甲酯isomer、迷迭香酸含量呈现持续下降趋势；原儿茶醛、丹参素、咖啡酸、丹酚酸H含量先增大后下降；紫草酸含量呈现持续上升趋势；其中原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B/E isomer已降解完全，从图21及图22可看出，二价金属离子条件下新增m/z715化合物，根据注射用丹参多酚酸UPLC-Q/TOF-MS一级质谱全扫描的结果，结合UPLC-Q/TOF-MS/MS二级质谱图的碎片离子信息，可对其结构进行简单推测。

化合物VIII：从一级质谱图上可以观察到m/z715[M-H]^-(如图21所示)，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为25V的作用下给出了碎片离子m/z517,393,321,195(如图22所示)。该化合物的分子量比丹酚酸B及其同分异构体少2，即该化合物的结构比丹酚酸B及其同分异构体少了两个氢原子。要确定其分子结构，还需结合红外光谱，核磁共振等技术做进一步确证。

如表4所示为注射用丹参多酚酸的二价金属降解试验质谱信息总结。

表4 注射用丹参多酚酸在CaCl₂条件下的质谱信息

注3：降解产物为加粗部分

4.3.2注射用丹参多酚酸在三价金属离子中降解产物的解析

注射用丹参多酚酸在三价金属离子条件下，0时刻点的13个峰，至反应终止时丹酚酸B、丹酚酸L、丹酚酸B/E isomer、丹酚酸D、丹酚酸H、紫草酸、m/z701和9″′-紫草酸B单甲酯isomer含量呈现持续下降趋势；丹酚酸E含量呈现持续上升趋势；原儿茶醛、咖啡酸、丹参素、迷迭香酸含量先增大后下降；其中咖啡酸、原儿茶醛、丹酚酸D、丹酚酸B/E isomer、紫草酸、m/z701和9″′-紫草酸B单甲酯isomer已降解完全。共生成4个降解产物。

注射用丹参多酚酸降解0时刻点和反应终止时刻点色谱图如图1及图23所示，紫外响应下以面积归一化法统计峰面积超过总面积5％的各色谱峰被统计为制剂主要成分，根据注射用丹参多酚酸UPLC-Q/TOF-MS一级质谱全扫描的结果，结合UPLC-Q/TOF-MS/MS二级质谱图的碎片离子信息，对反应终止时刻新增的4个化合物的结构进行推测，结果如下所示。

化合物V：从一级质谱图上可以观察到m/z715[M-H]^-(如图24所示)，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为20V的作用下给出了碎片离子m/z671,393,269(如图25所示)；该化合物的分子量比丹酚酸B及其同分异构体少2，即该化合物的结构中比丹酚酸B及其同分异构体少了两个氢原子。要确定其分子结构，还需结合红外光谱，核磁共振等技术做进一步确证。

化合物VI：从一级质谱图上可以观察到m/z537[M-H]-，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为10V的作用下给出了碎片离子m/z493,295；与紫草酸的裂解方式相同，且与高温条件下的m/z537具有相同的二级碎片离子，紫外保留时间一致，可推测其余高温条件下m/z537是相同的物质，推测化合物3为紫草酸isomer。

化合物VII和化合物VIII：从一级质谱图上可以观察到m/z715[M-H]^-(如图26所示)，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为25V的作用下均给出了碎片离子m/z671,393,295(如图27所示)。该化合物的分子量比丹酚酸B及其同分异构体少2，即该化合物的结构中比丹酚酸B及其同分异构体少了两个氢原子，且这两种化合物具有相同的二级裂解碎片，推测可能为同分异构体。而化合物VIII与高温条件下m/z715具有相同的紫外吸收位置，且其二>

如表5所示为注射用丹参多酚酸的三价金属降解试验质谱信息总结。

表5 注射用丹参多酚酸在AlCl₃条件下的质谱信息

注4：降解产物为加粗部分

4.4光照的影响

分别精密称取注射用丹参多酚酸5.01mg、5.02mg，置于2个经高温灭菌的10mL棕色容量瓶中，超纯水定容至刻度，分别置于1023×10lux200白炽灯和18lux200紫外灯下照射，密封，室温放置，一定时间间隔取样，12000rpm离心5min，进样。以丹酚酸B降解至初始浓度10％时，终止反应，利用UPLC-Q/TOF进行注射用丹参多酚酸定性鉴定。每个试验平行2次。

紫外照射条件下，注射用丹参多酚酸无明显降解。

模拟日光的白炽灯光照条件下，注射用多酚酸0时刻点的13个峰，至反应终止时丹酚酸B、迷迭香酸、丹酚酸E、丹酚酸L、m/z701和9″′-紫草酸B单甲酯isomer、丹酚酸D、丹酚酸B/E isomer含量呈现持续下降趋势；原儿茶醛、咖啡酸、丹参素、丹酚酸H、紫草酸含量先上升后下降；其中迷迭香酸、原儿茶醛、丹酚酸B/E isomer已降解完全。而新增的3个化合物含量呈现上升趋势。

其降解色谱图如图1及图28所示，根据注射用丹参多酚酸 UPLC-Q/TOF-MS一级质谱全扫描的结果，结合UPLC-Q/TOF-MS/MS二级质谱图的碎片离子信息，对新增的3个化合物的结构进行推测，结果如下所示。

4.4.1注射用丹参多酚酸光照降解产物解析

化合物III：从一级质谱图上可以观察到m/z177[M-H]^-(如图29所示)，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为20V的作用下给出了碎片离子m/z133(如图30所示)；推测m/z133为分子离子峰m/z177脱去一份子CO₂，该化合物的分子量比咖啡酸少2，即该化合物的结构中比咖啡酸少了两个氢原子。要确定其分子结构，还需结合红外光谱，核磁共振等技术做进一步确证。

化合物VIII：从一级质谱图上可以观察到m/z715[M-H]^-，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为20V的作用下给出了碎片离子m/z519,393,321,195；该化合物的分子量比丹酚酸B及其同分异构体少了两个氢原子。与高温条件下m/z715具有相同的紫外吸收位置，且其二级碎片离子相同，因此化合物VIII与高温条件下m/z715为相同的物质。要确定其分子结构，还需结合红外光谱，核磁共振等技术做进一步确证。

化合物IX：从一级质谱图上可以观察到m/z735[M-H]^-(如图31所示)，在二级质谱图上，母离子在碰撞能量为20V的作用下给出了碎片离子m/z717,537,519,357(如图32所示)；该化合物的分子量比丹酚酸B及其同分异构体多了一分子H₂O。推测m/z717为分子离子峰m/z735脱去一分子H₂O，m/z537为m/z735继续脱去一分子C₉H₉O₄，m/z357为m/z717脱去两分子C₉H₉O₄形成，可能的结构为

如表6所示为注射用丹参多酚酸的光照降解试验质谱信息总结。

表6 注射用丹参多酚酸在光照条件下的质谱信息

注5：降解产物为加粗部分

4.5注射用丹参多酚酸降解产物的总结

注射用丹参多酚酸在高温、氧化、光、二价和三价金属离子中共有13个降解产物，其结果如下表7所示。从表中可看出高温和三价离子条件下具有相同的降解产物紫草酸isomer；高温、光照、二价和三价金属离子条件下具有相同的降解产物m/z715；高温和氧化条件下具有相同的降解产物m/z715。

表7 注射用丹参多酚酸在各种条件下总的降解产物

注6：1)序号是按照注射用丹参多酚酸中原成分和降解产物在紫外检测器上的保留时间来进行总的排序

2)“√”表示具有某种成分

5稳定性指示性分析方法的建立

在注射用丹参多酚酸稳定性压力条件降解机理研究的基础上，针对在高温、氧化、光照、金属离子条件下的稳定性样品进行降解产物初步富集，并采用UPLC和UPLC-Q/TOF方法建立能够同时测定注射用丹参多酚酸原成分及其降解产物的稳定性指示性分析方法。

5.1样品制备

将初步富集的稳定性样品进行冻干后，加入一定量的甲醇水溶液溶解，涡旋混匀，作为储备液。

5.2稳定性指示性分析方法

5.2.1 UPLC(超高效液相)方法学研究

5.2.1.1精密度

取“5.1”项下的储备液连续进样6次，其RSD值在0.5-3.5之间，表明具有良好的精密度。

5.2.1.2重复性

取“5.1”项下的6份样品分别连续进样2次，结果显示其RSD值在3.50-4.77之间，表明其具有良好的重复性。

5.2.1.3检测限

取“5.1”项下的储备液，加50％甲醇逐级稀释进样，从色谱峰响应可知，信噪比S/N大于3，在此条件下可同时测定注射用丹参多酚酸原成分及其降解产物。

5.2.2注射用丹参多酚酸在降解条件下原成分与降解产物的测定

取“5.1”项下样品储备液，涡旋混匀，12000rpm离心5min，按照“3.1”项下色谱条件进行UPLC检测，结果如图33。

由图33(A：氧化条件下样品；B：高温条件下样品；C：AlCl₃条件下样品；D：CaCl₂条件下样品；E：光照条件下样品)可知，注射用丹参多酚酸原成分及其降解产物在此方法下可同时测定。

所建立的UPLC稳定性指示性分析方法具有流动相简单，较短时间的洗脱梯度，合理的分析时间，对降解产物和原成分充分的分离。所建立的方法可以用来对注射用丹参多酚酸注射剂进行稳定性角度的质量控制，由于其对各条件降解产物的覆盖能力，可用于制剂在生产、储存等条件下样品的随性检验。为中药注射剂的稳定性及安全性评价提供技术支持。一个灵敏、准确、可重复性地同时测定注射用丹参多酚酸及其降解产物的UPLC稳定性指示性分析方法已建立。在现有的色谱条件下，该方法具有足够的灵敏度来测定其原成分及其降解产物。

6小结

注射用丹参多酚酸在降解机理研究中，高温条件下共新增6个化合物，分别为丹酚酸S or丹酚酸T、紫草酸isomer、丹酚酸C、异丹酚酸C以及m/z715；氧化条件下新增4个化合物，分别为原儿茶酸、丹酚酸F、m/z分别为715、723；二价金属离子条件下新增1个m/z715化合物；三价金属离子条件下新增4个化合物，分别为紫草酸isomer和3个m/z715化合物；光照条件下新增3个化合物，分别为m/z177、m/z735和m/z715化合物。

高温和三价金属离子条件下共同的降解产物为紫草酸isomer；高温、氧化条件下共同的降解产物为m/z715；高温、二价金属离子、三价金属离子和光照条件下共同的降解产物为m/z715。注射用丹参多酚酸对氧化、高温更为敏感。这提示应注意环境温度和其与空气接触的控制，金属离子在医疗器械容器及常见模拟体液中使用频率较高，建议严格控制。

通过对注射用丹参多酚酸稳定性的研究，本发明还提供了一种注射用丹参多酚酸降解途径的分析方法，对注射用丹参多酚酸进行超高效液相-质谱检测，得到其质谱图，通过质谱图中的碎片离子峰分析其降解产物，通过降解产物、碎片离子峰及其出峰时间对其降解途径进行分析，包括：

当降解产物中包括丹酚酸S、丹酚酸T、丹酚酸C和/或异丹酚酸C时，降解途径为高温降解；

当降解产物中包括原儿茶酸、丹酚酸F和/或碎片离子峰为724时，降解途径为氧化降解；

当降解产物中包括碎片离子峰为715，并且碎片离子峰的出峰时间在8.8 分钟至9.2分钟之间和/或9.9分钟至10.15分钟之间时，降解途径为三价金属离子降解；在本实施例中，出峰时间在8.94分钟和/或10.09分钟；

当降解产物中包括碎片离子峰为178和/或736时，降解途径为光照降解。

优选的是，通过降解产物、碎片离子峰及其出峰时间对其降解途径进行分析，还包括：

当降解产物中包括紫草酸同分异构体时，降解途径包括高温降解或者三价金属离子降解；

当降解产物中包括碎片离子峰为715，并且碎片离子峰的出峰时间在10.34分钟至10.45分钟之间时，降解途径包括高温降解、二价金属离子降解、三价金属离子降解或光照降解；

当降解产物中包括碎片离子峰为715，并且碎片离子峰的出峰时间在10.80分钟至10.90分钟之间时，降解途径包括高温降解或者氧化降解。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。