来源于东方蜜蜂的赛卡品肽

技术领域

本发明涉及来源于东方蜜蜂(Apis cerana)的赛卡品(secapin)肽。

背景技术

蜜蜂在经济上是重要的昆虫。蜜蜂不仅携带花粉而且提供许多产品例如蜂蜜、蜂王胶、蜂胶、花粉、蜂蜡和蜂毒等。这些蜂产品是东方医学常用和重要的材料。最近，已经进行了蜂毒中组分的药理作用的许多调查研究。蜂毒包括不同的蜂毒蛋白或肽，具体而言，蜂毒肽、磷脂酶A2(PLA2)、蜂毒明肽、透明质酸酶、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂等是相关领域中已知的。

更具体而言，在多种生物体的毒液中发现的这类各种蛋白质或肽吸引了高的兴趣，因为它们参与各种生理活性例如免疫应答、补体活性、止血、凝血机制、纤溶功能、减轻炎症等等。

编码赛卡品肽的碱基序列在1984年被初次鉴定，赛卡品肽是西方蜜蜂Apis mellifera的蜂毒组分之一[Vlasak R&Kreil G，Eur JBiochem 145：279-292(1984)]。还报告了与膜翅目昆虫包括一些种类的蚂蚁和埃及伊蚊有关的另一种碱基序列。然而，因为已知作为蜂毒组分之一的赛卡品肽，在蜂毒中以不超过1％的小份额存在，相当难以分离和得到它。为了这个原因，对赛卡品的各种生理影响的研究数量比较少。

因此，本发明人进行了编码来源于东方蜜蜂即Apis cerana的赛卡品肽的cDNA基因的克隆。另外，本发明人已经发现，通过将在所述cDNA基因之中编码成熟肽的多核苷酸插入载体中、然后将该载体引入昆虫的细胞系中所产生的重组肽可以抑制纤维蛋白溶解酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K的活性，并表现出优异的对抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和昆虫病原真菌的抗细菌和抗真菌作用，从而完成本发明。

[现有技术文献]

[非专利文献]

(非专利文献No.0001)Vlasak R&Kreil G，Eur J Biochem 145：279-282(1984)

发明内容

因此，本发明的目的是提供来源于东方蜜蜂的赛卡品肽‘东方蜜蜂源性赛卡品肽’)。

本发明的另一个目的是提供编码上述肽的核苷酸。

此外，本发明的另一个目的是提供包含上述核苷酸的重组表达载体。

另外，本发明的另一个目的是提供包含上述肽或重组表达载体的凝血剂、抗炎剂、抗细菌或抗真菌剂。

本发明的以上目的将通过以下特征实现：

(1)来源于东方蜜蜂的赛卡品肽，其具有由SEQ.ID No.2限定的氨基酸序列。

(2)根据上述(1)的赛卡品肽，其中所述肽具有纤溶酶抑制活性。

(3)根据上述(1)的赛卡品肽，其中所述肽具有弹性蛋白酶抑制活性。

(4)根据上述(1)的赛卡品肽，其中所述肽具有对抗选自枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K所组成的组中至少一种蛋白质的抑制活性。

(5)多核苷酸，其具有由编码根据上述(1)的肽的SEQ ID No.1限定的碱基序列。

(6)重组表达载体，其包含根据上述(5)的多核苷酸。

(7)凝血剂，其包含根据上述(1)的肽或根据上述(6)的表达载体。

(8)抗炎剂，其包含根据上述(1)的肽或根据上述(6)的表达载体。

(9)抗细菌或抗真菌剂，其包含根据上述(1)的肽或根据上述(6)的表达载体。

本发明可以鉴别来源于东方蜜蜂的赛卡品肽和对其编码的基因序列，使得能够大量生产东方蜜蜂源性赛卡品肽。

本发明的赛卡品肽可以表现出纤溶酶抑制活性、弹性蛋白酶抑制活性、抗细菌和抗真菌作用，从而用于广泛的应用，包括例如凝血剂、抗炎剂、抗细菌和抗真菌剂等。

附图说明

本发明的上述和其他目标、特征和其他优点将从以下结合附图的详细说明中更清楚地了解，所述附图中：

图1是图示本发明的东方蜜蜂源性赛卡品肽和其他赛卡品肽之间同源性的图(下划线部分：信号肽位点，虚线框：成熟肽区域，和实心圆：形成保留的二硫键的半胱氨酸残基)；

图2是图示重组蛋白的电泳结果的图，其中只有本发明的东方蜜蜂源性赛卡品肽之中的成熟肽位点被表达；

图3是图示本发明重组肽(所述东方蜜蜂源性赛卡品肽cDNA的成熟肽)的纤溶酶抑制活性的图；

图4是图示本发明重组肽(所述东方蜜蜂源性赛卡品肽cDNA的成熟肽)的弹性蛋白酶抑制活性的图；

图5是图示本发明重组肽(所述东方蜜蜂源性赛卡品肽cDNA的成熟肽)对抗枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K的抑制活性的图；和

图6是Western印迹分析和共焦显微照片，图示了本发明的重组肽(所述东方蜜蜂源性赛卡品肽cDNA的成熟肽)对细菌和真菌的结合能力。

具体实施方式

在下文中，将更详细地描述本发明。

本发明人已经如下所述分离了所述东方蜜蜂源性赛卡品肽(赛卡品：AcScp)氨基酸序列和编码上述赛卡品肽的多核苷酸。

利用从东方蜜蜂昆虫体提取的poly(A)和mRNA制备cDNA文库，然后进行表达序列标签(EST)的分析。根据东方蜜蜂EST分析，克隆编码所述东方蜜蜂源性赛卡品肽的基因的cDNA并由SEQ ID No.1限定。另外，从编码所述东方蜜蜂源性赛卡品肽的cDNA翻译的氨基酸序列数据库分析结果由SEQ ID No.2限定。

所述东方蜜蜂源性赛卡品肽基因首先从东方蜜蜂分离，然而，其具体特征还没有报告。本发明鉴定了来源于东方蜜蜂的AcScp的序列，并且该基因在2015年5月15日在NCBI GenBank数据库中登记，登录号(accession No.)KR 732613(cDNA)。

由于分离根据本发明的来源于东方蜜蜂的AcScp的cDNA和分析其碱基序列的结果，发现所得到的东方蜜蜂源性AcScp基因的cDNA具有SEQ ID No.1的碱基序列，所述碱基序列直至终止密码子的长度为348bp，其中由多核苷酸序列SEQ ID No.1编码的蛋白质由115个氨基酸组成，包括由24个氨基酸组成的信号肽位点和由25个氨基酸组成的成熟肽区域，并具有两个半胱氨酸结构。通过只表达所述成熟肽部分得到的重组蛋白质通过电泳具有约3.7kDa的分子量。

由所述东方蜜蜂源性赛卡品肽基因编码的氨基酸序列显示出与在NCBI GenBank数据库中登记的赛卡品肽(西方蜜蜂-3，佛罗里达弓背蚁等)的氨基酸序列的高度同源性(参见图1)。

具有根据本发明的SEQ ID No.2的氨基酸序列的肽可以具有对抗纤溶酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A、蛋白酶K等的蛋白抑制活性。

另外，本发明提供包括SEQ ID No.1的核苷酸的重组表达载体。

在本公开中，术语“载体”是指DNA产物，其含有与适当的控制序列可操作性连接的特定基因的碱基序列，以便在合适的宿主内表达目的基因。在此，所述控制序列可以包括能够启动转移的启动子、控制所述转移的任何随机操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体连接位点的序列、以及控制转移和转录的终止的序列。

在本公开中，“可操作性连接”的措辞是指编码目的蛋白的核酸序列与核酸表达控制序列功能性连接以执行一般功能。例如，启动子可以与编码影响编码序列表达的蛋白质或RNA的核酸序列可操作性连接。与重组载体的可操作性连接可以利用相关领域中公知的遗传重组技术形成，而位点特异性DNA切割和连接利用相关领域中通常已知的任何酶等进行。

本发明的载体可以包括，例如，启动子、起始密码子、终止密码子、表达控制元件例如聚腺苷酸化信号和增强子、分泌信号等，并可以根据其用途制备成多样化的类型。所述起始密码子和终止密码子应该对被施用遗传构建物的对象起作用，并在编码序列和框上存在(框内)。

本发明中可用的载体没有具体的限制，只要它在宿主中可复制即可，并可以包括相关领域中已知的的任何载体。例如，可以使用非病毒载体或病毒载体。

作为代表性例子，所述非病毒载体可以包括质粒。所述质粒表达载体是根据FDA认证的基因转移方法向人细胞直接传递质粒DNA的工具，其适用于人，因此，与病毒载体不同，具有能够同质提纯所述质粒DNA的优点。本发明中可用的质粒表达载体可以包括相关领域中已知的任何哺乳动物表达载体。例如，但不限于此，pRK5(欧洲专利No.307,247)、pSV16B(国际专利公布No.91/08291)和pVL1392(PharMingen)等是代表性的。

另外，本发明中可用的表达载体可以包括病毒载体。所述病毒载体可以包括，例如，逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒和禽痘病毒等。所述病毒载体应该满足下列条件：(1)所述载体应该感染目的细胞，因此，应该选择具有适当的宿主范围的病毒载体；(2)所述转移基因应该在所述细胞中保留和表达期望的时间段；和(3)所述载体在宿主中应该是安全的。

构建逆转录病毒载体，使得所有病毒基因被除去或改变，从而使得非病毒蛋白质能够在被所述病毒载体感染的细胞中制造。所述逆转录病毒载体在基因疗法中的主要优点是在可复制的细胞中传递大量基因并将转移到所述细胞DNA中的基因正确整合，同时在基因转染后不引起持续的感染。FDA认证的逆转录病毒载体已经利用PA317双嗜性逆转录病毒包装细胞制造(Miller,A.D.和Buttimore，C.，Molec.Cell Biol.，6：2895-2902，1986)。

所述非逆转录病毒载体可以包括，例如，如上所述的腺病毒。腺病毒的主要优点是该病毒具有运载大量DNA片段(36kb基因组)和以高滴定度感染不可复制的细胞的能力。另外，疱疹病毒也可以有效应用于人类基因疗法(Wolfe，J.H.等，Nature Genetics，1：379-384，1992)。此外，可以使用相关领域中公知的合适的病毒载体。

可用于基因转移到细胞中的其他病毒载体可以包括，例如，鼠白血病病毒(MLV)、JC、SV40、多形瘤、Epstein-baar病毒、乳头瘤病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒、辛德毕斯病毒、慢病毒、其他人类和动物病毒。

本发明的表达载体可以通过相关领域中已知的任何常规方法引入细胞中。例如，虽然不限于此，但可以使用瞬时转染、微注射、转导、细胞融合、磷酸钙沉淀、脂质体介导转染、DEAE葡聚糖介导转染、聚凝胺介导转染、电穿孔、基因枪和用于核酸流入细胞中的其他已知方法将所述载体引入细胞中(Wu等，J.Bio.Chem.，267：963-967，1992；Wu和Wu，J.Bio.Chem.，263：14621-14624，1988)。

本发明的载体还可以包括选择标志物。所述选择标志物用于选择被转入载体的细胞，亦即，用于确定目的基因是否被插入，并且可以使用能够赋予耐药性、营养需求、对细胞毒剂的耐受性或可选择的表型例如表层蛋白质表达的一些标志物。在用选择剂处理的环境下，只有表达所述选择标志物的细胞可以存活或表现出替代表型，从而能够选择转化细胞。

另外，本发明提供了被上述载体转化的转化体。

本发明的转化体可以通过将所述载体以启动子起作用的特定形式引入宿主细胞中来构建。

在本公开中，术语“转化”是指将DNA引入中宿主使得让所述DNA可作为染色体外因子或通过完整的染色体整合复制。所述转化可以包括将核酸分子引入生物体、细胞、组织或器官中的任何方法，并且如相关领域中公知的，可以通过取决于宿主细胞选择合适的标准技术来进行。

在如上所述的这些方法之中，可以包括电穿孔、CaPO₄沉淀、CaCl₂沉淀、微注射、PEG法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、乙酸锂-DMSO法等，但不限于此。

因为蛋白质的表达和修饰的量可以根据要转入所述表达载体的宿主细胞而异，所以可以选择和使用与意向最接近的宿主细胞。本发明可用的宿主细胞可以包括，例如，昆虫细胞系、酵母、真菌、细菌或藻类，例如，优选使用昆虫细胞系Sf9(草地贪夜蛾9)(Spodoptera frugiperda 9)，但不限于此。

在本发明下面的实施方式中，包含SEQ ID No.1的多核苷酸的昆虫杆状病毒过渡载体(pBAC8)对昆虫细胞系Sf9(草地贪夜蛾9)共转染，5天后，收集培养肉汤以制备表达所述东方蜜蜂源性赛卡品肽的重组杆状病毒。所述重组杆状病毒在Sf9细胞系中增殖，本发明的重组蛋白质(东方蜜蜂源性赛卡品肽)利用MagneHisTM蛋白质提纯系统(Promega Co.，美国)分离。

从上述转化体，可以分离本发明的肽。在选择的宿主细胞中表达所述肽后，可以使用任何常规生化分离技术分离和提纯，所述分离技术例如利用蛋白质沉淀剂的处理(盐析)、离心、超声破碎、超滤、透析、各种色谱法例如分子筛色谱(凝胶过滤)、吸附色谱、离子交换色谱、亲和色谱等。一般而言，上述方法可以以其两种或更多种的组合使用，以便分离高纯度蛋白质(多肽)。

另外，本发明提供了凝血剂、抗炎剂和抗细菌或抗真菌剂，其各自包括具有如上所述的SEQ ID No.2的氨基酸序列的东方蜜蜂源性赛卡品肽或具有编码上述肽的SEQ ID No.1的核苷酸的表达载体。

本发明的东方蜜蜂源性赛卡品肽可以具有纤溶酶抑制活性从而表现出凝血作用，具有弹性蛋白酶抑制活性从而表现出抗炎作用，和具有枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K抑制活性从而表现出抗细菌和抗真菌作用。

更具体地，本发明的东方蜜蜂源性赛卡品肽抑制通过纤溶酶的纤维蛋白溶解来降解纤维蛋白，这是通过纤溶酶将固体纤维蛋白溶解成液态的现象并且由于血凝块阻断的血管由此再次开放。然而，所述赛卡品肽可以抑制上述现象从而作用于凝血。

另外，弹性蛋白酶是与炎症有关的丝氨酸蛋白酶。因为丝氨酸蛋白酶抑制剂起到抗炎剂的功能，如上所述的赛卡品肽可以具有弹性蛋白酶抑制活性，从而作用于炎症抑制。

至于抗细菌和抗真菌作用，试验证明抑制了革兰氏阳性细菌例如枯草杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金杆菌(Bacillus thurigiensis)的生长并且也有效抑制了公知作为植物病原菌的禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)的生长。

根据本发明的凝血剂和抗炎剂可以有效应用于医药、化妆品等的材料，而所述抗细菌或真菌剂可用于各种产品例如医药、化妆品、清洁剂、植物病害预防剂、包衣剂等的材料。

当所述凝血剂、抗炎剂、抗细菌或抗真菌剂制备到药物组合物中时，所述组合物还可以包括可药用载体。

所述可药用载体通常用于制剂，并可以包括，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等，然而不限于此。除上述组分以外，所述可药用载体还可以包括润滑剂、增湿剂、甜味剂、香料、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。适合使用的可药用载体和制剂在《雷氏药物学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(第十九版，1995)中详细描述。

本发明的药物组合物可以通过口服或胃肠外途径给药，优选通过胃肠外途径，更优选通过局部应用法给药。

所述药物组合物的适当给药量可以根据以各种参数例如制剂方法、给药模式、患者的年龄、重量、性别和状态、食物、给药时间、给药途径、排泄率、反应和应答等为基础的不同处方决定。

所述药物组合物可以利用所述可药用载体和/或赋形剂根据本发明所属的相关领域的技术人员容易实行的任何常规方法制备成制剂。因此，所述药物组合物可以制成单位剂量形式或装入多剂量容器中形成产品。在这点上，所述制剂可以包括，例如，在油或水介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳液，或提取液、分散液、粉末、颗粒、片剂、胶囊形式，等。此外，所述制剂还可以包括分散剂或稳定剂。

在下文中，将参考下列实施例更详细地描述本发明。

[实施例]

1.东方蜜蜂源性赛卡品肽的编码基因的克隆

利用市售试剂盒，亦即，Uni-ZAP载体和Gigapack III Gold包装提取物(Stratagene Co.，United States)，使用从东方蜜蜂昆虫提取的Poly(A)和mRNA制备cDNA文库，并分析表达序列标签(EST)。

另一种市售的试剂盒，Wizard微型制备试剂盒(Promega Co.，美国)用于提取DNA。DNA碱基序列通过自动DNA分析仪(AppliedBiosystems Co.，美国)分析。分析的碱基序列利用NCBI的BLAST程序(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比较。

根据东方蜜蜂EST分析，克隆编码115个氨基酸的所述东方蜜蜂源性赛卡品肽基因的cDNA并定义为SEQ ID No.1。另外，从上述东方蜜蜂源性赛卡品肽基因的cDNA翻译的氨基酸序列数据库的分析结果定义为SEQ ID No.2。

图1中显示通过利用BLAST程序分析上述序列的结果。

如图1中所示，能够看出本发明的肽与相关领域中报告的现有赛卡品肽具有比较高的同源性，并且完好保留了半胱氨酸残基和成熟肽区域以形成一个二硫键。

2.用于表达重组东方蜜蜂源性赛卡品肽的载体的制备和在昆虫细胞系中表达的验证

为了表达所述东方蜜蜂源性赛卡品肽，所述东方蜜蜂源性赛卡品肽的cDNA中的成熟肽位点插入昆虫杆状病毒(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒)过渡载体pBAC8(Clontech Co.，美国)中，随后上述过渡载体(500ng)与bAcGOZA病毒DNA(100ng)[Je等，Biotechnol.Lett.，23：575-582(2001)]一起利用脂质体(lipofectin)(Clonetech Co.)共同转染到昆虫细胞系Sf9(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)9)中。

5天后，收集培养肉汤以构建表达东方蜜蜂源性赛卡品肽的重组杆状病毒。所述重组杆状病毒在Sf9细胞系中增殖，所述重组AcScp利用MagneHisTM蛋白质提纯系统(Promega Co.，美国)分离。图2是电泳照片，图示了所述分离的东方蜜蜂源性赛卡品肽。

如图2中所示，所述染色结果证明了通过电泳，所述东方蜜蜂源性赛卡品肽具有约3.7kDa的分子量。

3.东方蜜蜂源性赛卡品肽的活性确认

(1)对抗纤溶酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A或蛋白酶K的抑制活性的验证

为了验证所述东方蜜蜂源性赛卡品肽是否抑制纤溶酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K，不同浓度的AcScp重组肽用分别在含有20mM CaCl₂和0.05％Triton>

上述溶液在37℃下没有任何基质就反应30分钟后，向所述反应产物添加0.5mM S-2251纤溶酶基质(chromogenix Co.，美国)、0.5mM S4760的弹性蛋白酶基质(Sigma Co.，美国)以及0.5mM Suc-AAPF-pNA的枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K基质(Sigma Co.，美国)，随后在37℃反应30分钟。

所述重组肽AcScp显示对纤溶酶(图3)、人中性白细胞弹性蛋白酶(图4A)、猪胰腺弹性蛋白酶(图4B)、细菌和真菌源性丝氨酸蛋白酶亦即枯草杆菌蛋白酶A(图5A)和蛋白酶K(图5B)的抑制活性(表1)。

如表1中所示，能够看出抑制纤溶酶的纤维蛋白溶解的IC₅₀是457.98±11.43nM，抑制作为炎症相关丝氨酸蛋白酶的弹性蛋白酶的IC₅₀分别是对人中性白细胞弹性蛋白酶为347.81±5.79nM，对猪胰腺弹性蛋白酶为94.70±1.97nM，对枯草杆菌蛋白酶A的IC₅₀是379.20±9.42nM，和对蛋白酶K的IC₅₀是189.43±3.14nM。

[表1]

重组肽(所述东方蜜蜂源性赛卡品肽cDNA的成熟肽)对纤溶酶、人中性白细胞弹性蛋白酶、猪胰腺弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K的抑制活性

a：在本试验中使用的酶浓度

b：IC₅₀与酶浓度的摩尔比

(2)微生物结合能力的验证

为了验证使用本发明的东方蜜蜂源性赛卡品肽作为抗细菌或抗真菌微生物制剂的可能性，研究了AcScp的结合能力。

更具体地说，苏云金杆菌(B.thuringiensis)和大肠杆菌(Escherichiacoli)分别在Luria-Bertani(LB)培养基中培养，球孢白僵菌(Beauveriabassiana)在马铃薯葡萄糖肉汤中培养。当所述培养肉汤在OD₆₀₀下达到0.4时，收集细菌和真菌，用PBS洗涤，并与包含0.8μg的AcScp重组肽的40μl微生物混合，随后在室温下反应10分钟。10分钟后，所述产物通过离心分离成上清液和微生物，所述微生物再次用PBS洗涤。所述微生物和上清液分别进行15％SDS-PAGE，随后利用His标签抗体进行western印迹分析。

AcScp与作为革兰氏阳性细菌的苏云金杆菌、作为革兰氏阴性细菌的大肠杆菌和作为昆虫病原真菌的球孢白僵菌结合(图6A)。

为了可见地确定AcScp的结合能力，所述微生物与AcScp反应并将其固定在载玻片上。所述反应产物利用His标签抗体和荧光抗体染色，随后利用共焦显微镜观察和拍摄照片。结果，与Western印迹分析的结果相似，AcScp与所述细菌和真菌结合(图6B)。

(3)抗微生物活性的验证

为了验证显示出对抗细菌和真菌源性丝氨酸蛋白酶、亦即枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K的特异性抑制活性的AcScp的抗细菌和抗真菌活性，研究了对抗革兰氏阳性细菌苏云金杆菌和革兰氏阴性细菌大肠杆菌的生长抑制活性。

不同浓度的AcScp重组肽和200μl细菌(10⁵cfu/ml)混合在一起，在96-孔板中于37℃下经受速率为220rpm的振荡培养24小时，随后在595nm处测量细菌生长抑制活性。此外，为了研究对抗真菌的抗真菌活性，2X>4分生孢子/ml和200μl的球孢白僵菌与不同浓度的AcScp重组肽混合，在22℃下以220rpm的速率经受振荡培养48小时，随后在595nm处测量真菌生长抑制活性。

[表2]

AsScp对细菌和真菌的抗细菌和抗真菌活性

如表2中所示，能够看出分别是：作为革兰氏阳性细菌的苏云金杆菌的50％生长抑制活性MIC₅₀是4.21±0.49M，大肠杆菌的MIC₅₀是6.5±1.76M，和作为昆虫病原体的球孢白僵菌的50％生长抑制活性IC₅₀是2.57±1.31M。

根据以上说明的结果，能够看出所述东方蜜蜂源性重组赛卡品肽具有对抗枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K的优异抑制活性，并可用于抑制微生物的生长。