一株哥斯达黎加链霉菌属放线菌及其用途

技术领域

本发明属于微生物肥料领域，具体涉及一株哥斯达黎加链霉菌属放线菌及其用途。

背景技术

植物内生放线菌(Endophytic actinobacteria)是指以共生或寄生方式存在于植物组织内部，不引发植物明显病症的微生物，在长期协同进化的过程中，植物内生放线菌与宿主间不断进行物质、能量以及遗传信息的交换，许多功能特异的放线菌与植物间形成了复杂的共生关系，是植物微生态系统的重要组成部分。定殖于植物体内的放线菌，不易受外界环境影响，以溶磷固氮作用、分泌植物生长调节物质、合成铁载体、诱导植物产生抗性以及产生抗真菌代谢产物等方式促进植物生长，并长期持续作用，在农业生产中具有很大的应用潜力。国内外已报道的具有抗病促生内生放线菌主要有：从蕨类植物Pteridiumaquilinum中分离得到的Streptomyces hygroscopicus TP-A0451产生的pteridic acidsA和B，能够促进菜豆胚轴形成不定根；Qin等从麻风树Jatropha curcas L.中分离得到19株具有产生ACC、吲哚乙酸、铁载体、溶磷和固氮能力的内生放线菌，其中7株能够显著性的提高Jatropha curcas L.幼苗的株高、根长和鲜重；Li从泽泻Alisma orientale中分得一株Streptomyces CNS-42能产生星孢霉素(staurosporine)具有促生抗病双重功能。Passari等从药用植物中分得42株内生放线菌，其中22株具有产吲哚乙酸的能力，20株的吲哚乙酸浓度在10-32 μg/mL；所有分离菌株具有产氨能力，产氨浓度在5.2-54mg/mL，21株菌具有产铁载体能力；14株菌具有溶磷能力，19株菌具有产几丁质酶活性，15株菌具有产HCN的能力，从20和19株菌中扩增到吲哚乙酸(iaaM)和几丁质酶(chic)基因，进一步研究发现2株潜力菌株Streptomyces sp.(BPSAC34)和Leifsonia xyli(BPSAC24)对辣椒有促进生长的作用。

川楝(Melia Toosendan Sieb.et Zucc)为楝科楝属落叶乔木，主要分布于我国西南地区，是重要的工业用材树木，也是水土保持的重要植物。作为传统中药，川楝在我国的药用历史悠久，树皮、根皮、树干、树叶和果实均可入药，以产自四川的川楝果实为上乘，故名川楝子，是重要的川产地道中药材。从川楝中提取的川楝素(Toosendanin)对昆虫、线虫和螨虫以及微生物都有抑制作用，且尚未发现昆虫产生抗药性的情况，是制作高效无残毒无污染新型植物类农药的重要原料。在与宿主植物长期协同进化过程中，栖于川楝内部的放线菌，在宿主植物及外部环境长期影响作用下，可能具备产生结构新颖、活性独特的生物活性物质的潜力，并通过自身代谢产物供给宿主植物生长，提高寄主植物对环境中营养物质的吸收能力，以及通过不同机制抑制植物病原菌和降解某些有毒物质等方式来促进植物生长。因此，从川楝中分离获得具有促生抗菌作用的内生放线菌，并探究其在农业生产中的应用潜力，符合现代农业可持续发的需求。

发明内容

本发明从野生川楝皮中分离筛选出一株内生放线菌菌株哥斯达黎加链霉菌(Streptomyces costaricanus)，简称LP69。该菌株已于2016年08月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60071，保藏地址为广东 省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。

同时，本发明还提供了该放线菌的16s rDNA的核苷酸序列，为序列表SEQ ID NO.1所述。

此外，本发明提供了一种放线菌的孢子菌悬液，由以下步骤制备得到：

取放线菌菌株GDMCC 60071，接种于基平板上，置于28℃培养箱中培养7天，待整个平板长满菌丝后，用无菌解剖刀将培养基切碎，接入装有无菌麦粒种的菌种瓶中，28℃培养1周以上，待所有麦粒长满链霉菌LP69的孢子后，取出麦粒用无菌水洗下孢子，然后将孢子悬液以10000转/分钟的速度离心5min，再用无菌水将LP69的孢子浓度调节为10⁸cfu/mL，得孢子菌悬液。cfu为本领域常用术语，即指菌落形成单位。

本发明还提供了上述孢子菌悬液的施肥方法，包括以下步骤：

在植物幼苗移栽时，随定根水使用孢子菌悬液，并在植株幼苗移栽培养10天后进行灌根，在根附近灌入孢子悬液10-50mL，如20mL。

同时，本发明还提供了放线菌GDMCC 60071和/或放线菌GDMCC 60071的孢子均悬液制备生物肥料的用途；所述生物肥料具有产吲哚乙酸、产铁载体、溶解磷、提高土壤氮元素含量、提高土壤钾元素含量、提高土壤铁元素含量和/或提高土壤磷元素含量的用途。

此外，本发明还提供了一种用于烟草的生物肥料，该生物肥料含有放线菌GDMCC60071；

以及，提供了一种菌制剂，含有GDMCC 60071和可接受的辅料；

所述菌制剂优选为为固态菌剂，菌剂的活菌数为(1～5)×10⁹cfu/g，优选为2×10⁹cfu/g。

此外，本发明还提供了上述生物肥料、菌制剂产吲哚乙酸、产铁载体、溶解磷、提高土壤氮元素含量、提高土壤钾元素含量和/或提高土壤磷元素含量的用途。

本发明的LP69菌株的生物学特征如下：

菌株形态特征：在ISP₄培养基上生长，菌落紧密较小、边缘不整齐，表面粗糙，菌落颜色呈灰褐色，气生菌丝与基内菌丝均发育良好，不产色素，气生菌丝形成紧密的螺旋孢子链。

生理生化特征：菌株LP69在15℃-50℃温度范围都能生长，在pH<4.0时不能生长，在0％-5％NaCl溶液中能够生长，可以利用D-果糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、半乳糖为唯一碳源，不能利用L-阿拉伯糖、蔗糖、棉子糖、鼠李糖；能利用L-半胱氨酸、L-丝氨酸、L-缬氨酸，不能利用L-组氨酸和L-蛋氨酸为唯一氮源；不能使明胶液化，能水解淀粉，分解纤维素。

菌株LP69进行16S rDNA序列测定，所测序列提交EzBioCloud网站(www.ezbiocloud.net)进行同源性比对,并利用MEGA 5.0软件进行系统发育分析。结果表明，菌株LP69与哥斯达黎加链霉菌(Streptomyces costaricanus)的16S rDNA核苷酸序列的同源性在99％以上。综合形态特征、生理生化特征以及16S rDNA序列同源性分析等实验结果，鉴定LP69为哥斯达黎加链霉菌(Streptomyces costaricanus)。

菌株LP69能产生吲哚乙酸，铁载体，可将难溶性磷酸盐转化为可被植物利用的可溶性磷酸盐。

制备麦粒种，接种菌株LP69，待麦粒长满孢子后，用无菌水洗下制成浓度为1×10⁸cfu/mL的孢子液作为菌剂，在烟苗移栽时随定根水使用，并在烟苗移>

通过盆栽实验，验证了菌株LP69对烟草的生长具有明显的促进作用，烟草株高、最大茎围、最大叶长、最大叶宽和鲜重、干重分别增加了23.3％、18.7％、17.6％、11.7％、28.6％、28.1％。

有益效果

本发明分离筛选提供的川楝内生放线菌LP69具有产生吲哚乙酸，铁载体，溶磷等促生能力，通过在烟草栽培上的应用，获得能够促进烟草的生长的效果，可减少种植过程中化学肥料的施入量，在农业生产具有较好的应用潜力。

附图说明

图1为哥斯达黎加链霉菌LP69的菌落形态图。

图2为哥斯达黎加链霉菌LP69的菌体形态图。

图3为基于16S rDNA基因序列构建的哥斯达黎加链霉菌LP69系统发育树。

图4为哥斯达黎加链霉菌LP69通过灌根方式促进烟草生长的盆栽效果。其中左边为LP69灌根处理，右边为清水对照。

具体实施方式

下面将结合附图和具体的实例来进一步描述本发明。本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备均为本领域所熟知。但本发明并不限于下述的实施例。

实施例一：川楝内生放线菌LP69的分离、筛选和鉴定

1.川楝内生放线菌的分离

采自四川雅安雨城区野生川楝的根、茎、叶、果、皮等组织带回实验室，先用自来水将植物样品冲洗干净，再用超声(15千赫)清洗10min，去除植物组织表面杂质，作适当的修剪后，先用0.1％Tween 20清洗30s，无菌水冲洗三次；75％乙醇浸泡5min，无菌水冲洗三次；2％次氯酸钠浸泡5min，无菌水冲洗三次；10％碳酸氢钠漂洗10min。将处理好的样品置于铺有无菌滤纸的无菌培养皿中，吸干植物组织表面的水分后，用无菌粉碎机粉碎样品后，取适量预处理好的样品组织均匀撒布于高氏一号培养基上，正置平板，28℃培养7周以上。待放线菌长出后，用无菌竹签挑取在ISP₄培养基上纯化，纯化后的菌株LP69保种于ISP₄试管斜面，4℃保存。最后一遍清洗样品的无菌水200μL，涂布于LB固体培养基后，置于28℃培养，7天后平板上如有菌落生成，证明表面消毒不彻底；若无菌落长出，则可以视分离出来的菌株为内生菌。

2.川楝内生放线菌LP69的促生功能筛选

2.1产吲哚乙酸能力测定

菌株产吲哚乙酸能力测定，方法如下：

a)含氮培养液分装于试管中，每管4mL，121℃，20min灭菌；

b)加入过滤除菌的2.5mg/mL的L-色氨酸溶液1mL；

c)将供试菌株接入上述培养基，140rmp/min，28℃，培养7天；

d)发酵液8000rmp/min，离心5min；

e)取上清液2mL，加入4mL的显色液，充分混匀，25℃暗处理，显色30min，在530nm波长下测定吸光度值A；

f)以未接菌的液体培养基为对照调零，以浓度0、5、20、40、60mg/L 的吲哚乙酸标准液同上做标曲，计算出发酵液中吲哚乙酸的浓度；

2.2产铁载体能力测定

a)取0.012g铬天青溶于10mL双蒸水中，并与2mL 1mmoL/L的FeCl₃·6H₂O溶液混匀，得到溶液a；

b)取0.015g十六烷基三甲基溴化铵溶于8mL双蒸水中，得到溶液b；

c)将a液缓慢加到b液中，混合均匀，得到染液c；

d)将10×MM9盐溶液20mL和6.04g哌嗪二乙磺酸加入盛有150mL双蒸水的三角瓶中混合均匀后用50％NaOH调节pH到6.8，再加入3.2g琼脂粉，得到培养基d；

e)将染液c，培养基d及1mmoL/L的CaCl₂，1mmoL/L的MgSO₄，20％的葡萄糖，10％的酪蛋白氨基酸分别在115℃灭菌20min，待各溶液温度降至50-60℃时，取200μL>2，4mLMgSO₄，6mL酪蛋白氨基酸，2mL葡萄糖加入培养基d，再沿着瓶壁加入染液c，充分混匀切勿产生气泡即得蓝色检测培养基，倒板。

f)用无菌竹签接种供试菌株，每板等距接种5个菌饼，每株菌重复3次，28℃，培养3天，观察记录橘黄色透明圈大小。

2.3溶磷能力测定

将供试菌株接种蒙金娜培养基上，置于28℃培养10天，观察有无溶磷圈及溶磷圈的大小。以溶磷圈的大小来确定其对无机磷的溶解能力，值越大，溶磷能力强，反之，溶磷能力弱，不产生溶磷圈的菌株无溶磷能力；

4菌株鉴定

4.1菌株形态

(1)菌落形态特征：将菌株接种在ISP₄培养基上，置于28℃培养5天，观察菌株的菌落形态。

(2)菌体形态特征：将菌株接种在ISP₄培养基上，然后在接有菌种的位置斜插入无菌的盖玻片(插片法)，置于28℃培养5天，取出覆盖有菌丝的盖玻片并用复红进行简单染色镜检，将所观察到的形态结果显微照相，如图2所示。4.2菌株LP69生理生化特征

(1)碳源利用试验：将菌株接种于含有不同碳源的基础培养基上，置于28℃培养箱中培养5天，连续传代3次，能长出菌落的为阳性。

(2)氮源利用试验：将菌株接种于含有不同氮源的基础培养基上，置于28℃培养箱中培养5天，连续传代3次，能长出菌落的为阳性。

(3)生长温度：将菌株接种于ISP₄培养基上，分别置于5℃、15℃、25℃、35℃、45℃、55℃的培养箱中培养5天，观察是否有菌落形成。

(4)耐盐试验：将菌株接种于含0％、3％、5％、7％、10％、15％、20％的ISP₄培养基上，置于28℃培养箱中培养5天后，观察是否有菌落形成。

(5)耐酸碱试验：将菌株接种于pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的ISP₄培养基上，置于28℃培养箱中培养5天后，观察是否有菌落形成。

(6)淀粉水解反应：将菌株点种于含有可溶性淀粉的培养基上，重复3次，于28℃培养箱中培养3天，形成菌落后，在平板上滴加卢哥尔氏碘液，将整个平皿覆盖，平板呈蓝色，如菌落周围有无透明圈出现，说明淀粉被水解，透明圈大小表明其水解淀粉能力的大小。如无透明圈出现，则说该菌无水解淀粉的能力。

(7)纤维素分解：将菌株接种到纤维素刚果红培养基上，置于28℃培养 箱中培养5天，若菌株周围产生清晰透明圈，则证明是具有降解纤维素能力的阳性菌株，反之亦然。

(8)明胶液化：将菌株穿刺接种于明胶培养基，置于28℃培养箱中培养5天，再置于4℃冰箱内30min后观察结果，若培养基呈液化状态为明胶液化阳性，若培养基仍为固体状态则为明胶液化阴性。

4.3菌株的分子鉴定

4.3.1试剂：溶菌酶，蛋白酶K，10×TAE，1×TE，3mol/L乙酸钠(pH4.8-5.2)，70％乙醇，(饱和酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)，Mix。

4.3.2引物

Primer A：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(与16S rRNA 5′端8-27位点碱基相同)；Primer B：5′-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′(与16S rRNA 3′端1523-1504位点碱基相同)；

4.3.3内生放线菌DNA提取

取少许菌体于无菌的1.5mL Eppendorf管中，加入20μl(50mg/mL)终浓度达到2mg/mL的溶菌酶，放入37℃摇床，200rmp/min，1-2h；加入20％SDS 50μL及蛋白酶K 5μL(20mg/mL)，混匀放入55℃摇床，200rmp/min处理1-2h；加入550μL(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)抽提，12000rmp/min离心10min，吸取上清(重复三次)；加入800μL无水乙醇，80μL 3mol/L乙酸钠(pH4.8-5.2)，混匀，于4℃沉淀DNA，1h，12000rmp/min，10min，弃上清；加入200μL 70％乙醇，清洗管壁1-2次，12000rmp/min，离心5min，弃上清；待乙醇挥发干后，加入50μL 1×TE溶解DNA，并于-20℃保存；1％琼脂糖凝胶电泳检测。

4.3.4内生放线16S rRNA基因扩增

16S rRNA基因扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延2min，30个循环，72℃总延伸10min。PCR产物经上海生工EZ Spin Column PCR ProductPurification Kit UNlQ-1柱式PCR产物纯化试剂盒(SK1142-N)纯化，按操作指南进行，纯化产物送苏州金唯智生物科技有限公司测序。

4.3.5 16S rRNA基因序列分析及系统发育树构建

将测序后所得序列提交EzBioCloud网站(www.ezbiocloud.net)进行同源性比对，选取相似性最高已发表菌株的16S rRNA基因序列作为参比序列，采用Clustal X软件进行多序列比对分析，并通过MEGA5.0软件以邻近法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，确定该内生放线菌的分类地位。

5.实验结果

通过检测，筛选到一株产吲哚乙酸能力、产铁载体、溶磷能力均较好的内生放线菌菌株，命名为LP69。该菌株在ISP₄培养基上生长，菌落紧密较小、边缘不整齐，表面粗糙，菌落颜色呈灰褐色，气生菌丝与基内菌丝均发育良好，不产色素，气生菌丝形成柔曲、螺旋、顶端卷曲的孢子链，呈现典型的链霉菌特征(图1，图2)。菌株LP69在15℃-50℃温度范围都能生长，在pH<4.0时不能生长，在0％-5％NaCl溶液中能够生长，可以利用D-果糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、半乳糖为唯一碳源，不能利用L-阿拉伯糖、蔗糖、棉子糖、鼠李糖；能利用L-半胱氨酸、L-丝氨酸、L-缬氨酸，不能利用L-组氨酸和L-蛋氨酸为唯一氮源；不能使明胶液化，能水解淀粉，分解纤维素。

菌株LP69进行16S rDNA序列测定，所测序列提交EzBioCloud网站(www.ezbiocloud.net)进行同源性比对，比较结果显示菌株LP69与哥斯达黎加链霉菌(Streptomyces costaricanus)的16S rDNA核苷酸序列的同源性在99％以上，并通过MEGA5.0软件以邻近法(Neighbor-Joining)构建系统发育树(图3)。综合形态特征、生理生化特征以及16S rDNA序列同源性分析等实验结果，鉴定LP69为哥斯达黎加链霉菌(Streptomyces costaricanus)。

菌株LP69具有较强的溶磷以及产生吲哚乙酸、铁载体的能力(表1)。

表1内生放线菌LP69促生能力结果

实例2哥斯达黎加链霉菌LP69促进烟草生长效果实验

1.接种菌株孢子菌悬液制备

将菌株LP69接种于高氏一号培养基平板上，置于28℃培养箱中培养7天，待整个平板长满菌丝后，用无菌解剖刀将培养基切碎，接入装有无菌麦粒种的菌种瓶中，28℃培养1周以上，待所有麦粒长满哥斯达黎加链霉菌LP69的孢子后，取出麦粒用无菌水洗下孢子，然后将孢子悬液10000rmp/min离心5min，再用无菌水将LP69的孢子浓度调节为10⁸cfu/mL。高氏一号培养基由可溶性淀粉20g；KNO₃>2HPO₄·3H₂O>4·7H₂O>4·7H₂O>

2.取烟草云烟87种子播种于育苗盘中，自然条件下培养，每天浇水一次，当烟草幼苗的植株高度为10cm时，选取健康长势良好且一致的烟草幼苗，进行移载。孢子悬液在烟苗移栽时随定根水使用，并在烟苗移栽培10天后进行灌根， 在根附近灌入孢子悬液20mL，作为空白对照的烟草中则加入等量的无菌水。

3.灌根90天后，测定烟草的株高、根系形态、鲜重、干重、叶片数及土壤中主要营养元素含量。

4.烟草外部特征是烟草生长情况最直观的体现。烟草盆栽试验结果表明，菌株LP69灌根处理的烟草生长状况明显优于对照组，菌株LP69灌根处理烟草的株高、最大茎围、最大叶长和最大叶宽分别比CK增加了23.3％、18.7％、17.6％和11.7％；烟草鲜重和干重也分别比CK增加了28.6％、28.1％(表2，图4)。

表2接种菌株LP69对烟草生长的影响

5.根系的发达程度与植株吸收营养的能力关系密切。由表3可见，经菌株LP69灌根处理后，烟草根系的总根长、根总表面积、根平均直径、总根体积、总根毛数与CK结果，存在显著性差异(P<0.05)。

表3接种菌株LP69对烟草根系的影响

注：^＊表示有显著性差异(LSD,P<0.05)，下同。

表4接种菌株LP69对土壤主要营养元素的影响

菌株LP69灌根处理后，显著提高了土壤中碱解N、速效K以及速效P的含 量，分别比CK提高了17.1％、7.1％、28.2％(表4)。

综上所述，本发明分离自川楝内生放线菌哥斯达黎加链霉菌(Streptomycescostaricanus)LP69可有效促进烟草生长。

实施例3生物肥料的制备

1、菌剂制作

①平板菌种(一级种)：高氏一号培养基(由可溶性淀粉20g；KNO₃>2HPO₄·3H₂O0.5g，MgSO₄·7H₂O>4·7H₂O>

②麦粒菌种(二级种)：用无菌解剖刀将长满菌丝的培养基切碎，接入装有无菌麦粒种的菌种瓶中，28℃培养1周以上，待所有麦粒长满哥斯达黎加链霉菌LP69的孢子后，取出麦粒用无菌水洗下孢子，然后将孢子悬液10000rmp/min离心5min，再用无菌水将LP69的孢子浓度调节为10⁸cfu/mL。

③固态发酵：以麦麸为基质(载体)，按重量体积比加入，玉米粉1％，豆饼粉1％，KH₂PO₄>3>9cfu/g。

④制剂保存：菌剂无菌条件下常温干燥保存半年不影响其促生活性。

2、菌剂P69田间应用

供试植物：烤烟云87。

烤烟苗移栽时，按以下4个处理对烤烟苗进行处理：CK对照常规移栽；处理1营养土蘸根；处理2菌剂P69用营养土稀释10倍；处理3菌剂P69用营养土稀释50倍蘸根；处理4菌剂P69用营养土稀释100倍蘸根，于烤烟生长的团棵期和打顶期进行烤烟农艺性状的测定(表5和表6)。

表5菌剂LP69对烤烟团棵期农艺性状的影响

在云烟87的团棵期，菌剂LP69在100倍以内的各稀释液均可以有效提高烤烟的株高和叶片数等农艺性状指标。

表6菌剂LP69对烤烟打顶期农艺性状的影响

在云烟87的打顶期，菌剂LP69在100倍以内的各稀释液同样可以有效提高烤烟的株高、叶片数、节距和茎围等农艺性状指标。