一种K88ac+产肠毒素大肠杆菌致弱株构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株的构建方法与应用，属于生物工程和动物疫病防控领域。

背景技术

仔猪大肠杆菌病又称仔猪黄白痢，有数据表明，每年有约50％的仔猪死亡与产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxingenic Escherichia coli,ETEC)。仔猪黄痢一般发生于产后1周内的仔猪，尤其在产后3-5日内高发，患病仔猪表现为拉黄白色或黄色水样粪便，不及时治疗，死亡率高达70％以上，甚至100％；仔猪白痢多发于10-30日龄仔猪，病猪主要变现为拉白色或灰白色稀便，发病率可达65％左右。该病除了造成仔猪死亡外，还会影响仔猪的生长发育、降低饲料报酬，给养殖单位造成很大的经济损失。其中表达K88菌毛(又称F4菌毛)的ETEC是引起该病的重要病原菌之一。根据K88菌毛的抗原性不同，可将其分为K88ab、K88ac和K88ad三个血清型抗原变种，而猪K88ac⁺ETEC血清型在我国乃至世界范围内都是引起仔猪黄白痢的优势血清型。致病过程中，K88菌毛粘附到小肠壁上，使细菌得以定居繁殖，同时菌体分泌肠毒素，导致水和电解质流向肠腔，造成机体腹泻。

对仔猪黄白痢的防治方法主要为疫苗接种、生物学预防和药物治疗：1.疫苗接种：目前预防仔猪的黄白痢的疫苗主要有全菌灭活疫苗、粘附素(菌毛)疫苗、肠毒素疫苗以及基因工程疫苗等。这些疫苗能有效降低临床发病率，但是由于全菌灭活疫苗的细胞壁中含有脂多糖(LPS)，可能会对接种动物造成一定的副作用，如：轻微发热、接种后母猪不食、接种部位有炎症反应等；此外，粘附素疫苗、肠毒素疫苗以及基因工程疫苗的制备过程复杂、价格偏高；2.生物学预防：方定一,董国雄(1978，1979)曾从仔猪肠道内分离到一株大肠杆菌——NY-10，该细菌是一种非致病性大肠杆菌，能有效排斥肠道内的致病性大肠杆菌，临床试验表明，NY-10能在24小时内完成肠道的定植，并占压倒性优势，持续时间为7天，口服后能有效防止防治仔猪泻痢的发生，提高仔猪的存活率(方定一,董国雄.用无病原性Ny—10株大肠杆菌生物学防制仔猪黄痢的研究.江苏农业科技,1978,5(13):55-58.方定一,董国雄.用口饲NY—10株埃希氏大肠杆菌预防仔猪黄痢的研究.畜牧兽医学报,1979,10(2):79-84.)，但该菌株研究背景不甚清楚，究竟是何种类型的肠毒素、菌体内有没有抗生素抗性基因均不明确，且该菌无菌毛粘附性差，体内定植时间不长，现临床几乎不再使用；3.药物治疗：理论上讲，抗生素是一种有效治疗细菌性疾病的药物，但由于临床上抗生素的长期乱用、滥用，以及饲料中将抗生素作为添加剂或保健药物，导致大肠杆菌耐药性日趋严重，有研究显示，仔猪黄白痢的大肠杆菌对四环素、氨苄青霉素、阿莫西林、强力霉素、复方新诺明、甲氧苄啶、头孢拉定、环丙沙星等常用抗生素的耐药性达86％以上，并且一株细菌有多重耐药谱，这些现状导致临床抗生素治疗效果不佳。

大肠杆菌感染仔猪时，通过菌毛的粘附作用，将细菌定植到小肠上皮细胞上，这是发生感染的第一步，研究表明，热敏感型肠毒素(LT)对菌毛的粘附有辅助作用(E MBerberov,Y Zhou,D H Francis,et al.Relative importance of heat-labileenterotoxin in the causation of severe diarrheal disease in the gnotobioticpiglet model by a strain of enterotoxigenic Escherichia coli that producesmultiple enterotoxins.Infect Immun.2004,72(7):3914-24.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱菌株构建方法及其应用。使用该方法构建的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌直接致弱菌株粘附性强、体内定植时间长、接种后能防止野毒菌株的感染，可用于K88ac⁺ETEC引起的大肠杆菌病的生物预防。本发明的基本原理是：在热敏感型肠毒素(LT)对菌毛的粘附有辅助作用、且菌毛粘附作用是大肠杆菌感染仔猪的第一步的理论基础上，利用生物工程技术，在一株无抗生素抗性基因的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌基础上，对其LT>+致弱株，以有效阻止K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的定居繁殖，防止大肠杆菌病的发生。

为了达到以上的目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株的构建方法，包括如下步骤：

1)对K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌肠毒素基因进行无痕点突变：可选用Red同源重组技术，将无抗生素抗性基因的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的LT>

2)对K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌肠毒素基因的敲除：在步骤1)的基础上，可选用Red同源重组技术，敲除K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的STⅡ基因，从而达到致弱K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的目的；更进一步地，敲除K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的STⅡ基因时，替代一段大小为34bp的dif位点，作为以后辨别该致弱株的标记。

可选地，上述构建方法中所述的无抗生素抗性基因的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌为表达K88ac菌毛，并产肠毒素的大肠杆菌野生株K88ac⁺ETEC(YZ1205)。

可选地，上述K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株的构建方法，具体包括如下步骤：

第一步：利用Red同源重组无痕点突变技术，对K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌YZ1205肠毒素基因进行无痕点突变，使其LT>+ETEC>

可选地，此步可以分为以下几个具体操作步骤：

(1)以质粒pSG76-CS为模板，使用引物P1、P2和P3，利用重叠PCR方法扩增DNA片段；其中，所述的引物P1具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述的引物P2具有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，所述的引物P3具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

(2)以步骤(1)中所获得的PCR产物为模板，使用分别具有SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示的核苷酸序列的引物P4和P5继续扩增后，提纯回收；

(3)利用Red同源重组技术，使用步骤(2)中所得的DNA片段，对K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌YZ1205肠毒素基因进行无痕点突变，使其LT>+ETEC>

第二步：以K88ac⁺ETEC(YZ1205)为模板，以具有SEQ>

第三步：将第二步中所获得的PCR扩增产物，分别用限制性内切酶EcoRⅠ、SmaⅠ和SmaⅠ、HindⅢ，按顺序分别插入pUC18载体(大连宝生物公司)中相应的酶切位点；再将供筛选用抗性基因DNA片段(优选地，大肠杆菌基因删除试剂盒中的dif-Gm-dif DNA片段)插入SmaⅠ酶切位点，构建重组质粒；

第四步：以第三步中所构建的重组质粒为模板，使用分别具有SEQ ID NO.10和SEQID NO.11所示的核苷酸序列的引物P10和P11继续扩增后，提纯回收；

第五步：利用Red同源重组技术，基于第一步中所得的重组菌K88ac⁺ETEC>+产肠毒素大肠杆菌的STⅡ基因，达到致弱K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的目的。在第三步使用的供筛选用抗性基因DNA片段为大肠杆菌基因删除试剂盒中的dif-Gm-dif>

本发明还提供了上述产肠毒素大肠杆菌致弱株构建方法在防止K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌感染方面的应用。

本发明的技术方案达到了如下的有益效果：

1)本发明通过基因工程的方法构建致弱K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的方法，主要是采取了直接在无抗生素抗性基因的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌内进行LT>

2)根据本发明的方法制备而得的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株，LT>

3)本发明通过基因工程的方法构建致弱K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌，并在小鼠体内进行了验证，能够有效防止野毒株的感染，突破常规的疫苗接种预防、抗生素治疗等大肠杆菌病防控方法；

3)本发明提供的致弱K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌来源于感染的仔猪，因此也可为仔猪K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌感染的预防提供一种有效生物预防方法。中国猪饲养量巨大，发生黄痢的仔猪数量众多，利用基因工程方法构建的K88ac+产肠毒素大肠杆菌致弱株能有效预防K88ac+产肠毒素大肠杆菌引起的仔猪黄痢，这对于减少抗生素的使用有重要的意义，有很好的应用前景，可带来巨大的经济效益。

附图说明

图1是LT(S63K)基因点突变测序结果。

图2是STⅡ基因敲除测序分析结果。

图3是兔体肠毒素检测结果。

图4是K88ac⁺ETEC(YZ1205)和K88ac+ETEC>

图5是间接免疫荧光(IFA)结果；其中，1.K88ac+ETEC(YZ1205)，2.K88ac+ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ，3.DH5α。

图6是小鼠回肠粘附试验结果；其中，1.DH5α，2.K88ac+ETEC(YZ1205)，3.K88ac+ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ，4.PBS。

图7是PCR结果；其中，M：DNA分子量标准DL2000，1-23：攻毒第1-23d PCR检测结果，24：第24d PCR检测结果。

具体实施方式

为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。

生物材料来源：

K88ac⁺ETEC(YZ1205)：本实验分离保存；

大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞：购于宝生物工程(大连)有限公司(Cat No，9057)；

pUC18载体：购于宝生物工程(大连)有限公司(Cat No，3218)；

质粒pSG76-CS、pSTKST：由沈阳农业大学生物科学技术学院张立军教授惠赠[胡逢雪,丁锐,崔震海,于金龙,刘丽霏,敖永华,张立军.大肠杆菌基因无痕敲除技术及策略[J],生物技术通讯,2013,4(24):552-556]。

大肠杆菌基因删除试剂盒：购于江苏锐阳生物科技有限公司；

抗K88ac菌毛单克隆抗体：由扬州大学兽医学院微生物教研室制备并保存；

Goat Anti-Mouse IgG H&L(Alexa488)：购于Abcam公司(Cat No，ab150113)；

8w龄的Balb/c小鼠购于扬州大学比较医学中心。

实施例1

本实施例1中，采用发生黄痢仔猪小肠道内分离的一株大肠杆菌，构建K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株。具体包括以下步骤：

1.K88ac⁺ETEC分离：

用麦康凯培养基从江苏某猪场初次发生仔猪黄痢5日龄猪小肠道内分离的一株大肠杆菌。经检测，该大肠杆菌能表达K88ac菌毛，具有LT I和STⅡ肠毒素基因，未检测到常见的毒力岛基因，不能在含有氨苄青霉素、四环素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、头孢噻嗪、诺氟沙星、红霉素、强力霉素等抗生素的琼脂平板上生长。命名为K88ac⁺ETEC(YZ1205)。

2.K88ac+产肠毒素大肠杆菌致弱株的构建：

(1)LT基因点突变：

根据GenBank发表的pUMNK88Ent序列(Access NO.CP002732.1)，设计合成下列引物P1-P5。所述的引物P1-P5的核苷酸序列如下：

P1:5’-gaggaacacaaaccggctttgtcagatatgatgacggatatgtttccactaaacttagtttgagaagtgctcac-3’(SEQ ID NO.1)；

P2:5’-cgagctcggtacccggggatccgctagggataacagggtaatgtcctgctaagtgagcacttctcaaactaagTTTag-3’(SEQ ID NO.2)；

P3:5’–gaatatcctgataatatagactgtcctgctaagtgagcacttctcaaactaagattaccctgttatccctatagcggccgcaaaaattaaaaatgaag-3’(SEQ ID NO.3)；

P4：5'-gaggaacacaaaccggctttg-3’(SEQ ID NO.4)；

P5：5'-gaatatcctgataatatagactg-3’(SEQ ID NO.5)。

以质粒pSG76-CS为模板，利用重叠PCR方法扩增DNA片段。其中，在引物P1、P2和P3的作用下扩增发生点突变的部分LT I基因以及插入其内部、来源于质粒pSG76-CS的I-Sec1位点之间的DNA序列，该扩增片段带有同源左右臂，用于后面的Red重组。

重叠PCR方法中，PCR反应体系为：质粒pSG76-CS(50ng/μL)1μL、引物P1、P2和P3(25μM)各1μL、dNTP(10mM/each，大连宝生物公司)2μL、5x buffer 10μL、PrimSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物公司)0.5μL，去离子水补至50μL。PCR程序为：98℃变性10sec后，68℃退火、延伸2min，共进行30循环，温度降至16℃。扩增后，1％琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。

随后，以上述PCR产物为模板，再用引物P4、P5扩增完整的上述基因。PCR反应体系为：PCR产物(5ng/μL)1μL、引物P4和P5(25μM)各1μL、dNTP(10mM/each，大连宝生物公司)2μL、5x buffer 10μL、PrimSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物公司)0.5μL，去离子水补至50μL。PCR程序为：98℃变性10sec后，54℃退火5sec；72℃延伸2min，共进行30循环，温度降至16℃。扩增后，1％琼脂糖凝胶电泳，回收大小约1390bp大小的DNA片段。

将大肠杆菌基因删除试剂盒中的质粒pKD46转化K88ac⁺ETEC，并将携带质粒的K88ac⁺ETEC(YZ1205)用0.4％L-阿拉伯糖诱导后，制备成电转化感受态细胞，取5μL>

将上述丢失pKD46质粒的重组菌制备成感受态细胞，转化质粒pSTKST，并在含50mg/mL卡那霉素(Kan)的LB平板培养，转接种长出的菌落至含Kan的LB的液体培养基中，30℃，180rpm振荡培养3-5h后，向培养基中加入氯四环素(CTc)使其终浓度为30μg/mL，继续培养24-36h，诱导I-Sec1酶表达，切开突变基因组两端的I-Sec1识别位点，再通过大肠杆菌自身的修复机制，发生二次重组；将诱导后的菌液稀释后，吸取50μL涂布于含Kan的LB平板上，30℃培养24h后，长出的单菌落，用引物P4、P5进行PCR鉴定，并将PCR产物克隆进pMD18T载体(大连宝生物公司)，进行序列测定。结果表明(图1)，第63位丝氨酸(TCT)变为赖氨酸(AAA)，所获得的细菌命名为K88ac⁺ETEC>

(2)STⅡ基因敲除：

根据GenBank发表的pUMNK88Ent序列(Access NO.CP002732.1)，设计合成下列引物：其中引物P6、P7用于扩增同源左臂；引物P8、P9用于扩增同源右臂；引物P10、P11用于扩增来自于构建的重组载体中的同源左臂、dif-Gm-dif片段、同源右臂DNA片段；引物P12、P13用于鉴定大肠杆菌中STⅡ基因是否被敲除。所述的引物P6-P13的核苷酸序列如下：

P6:5’-ctgaattccgctgcattattgattttaggac-3’(SEQ ID NO.6)；

P7：5’-cgcccgggcacctcaaccttattgctataag-3’(SEQ ID NO.7)；

P8：5’-cgcccgggtatatttatcaatagcattcagcacc-3’(SEQ ID NO.8)；

P9：5’-gcgaagcttccggatgatctctaaatatgaat-3’(SEQ ID NO.9)；

P10：5’-catataaaagcccactgg-3’(SEQ ID NO.10)；

P11：5’-ctttttatgaaaaattatttttg-3’(SEQ ID NO.11)；

P12：5’-attgttgacatgaacagc-3’(SEQ ID NO.12)；

P13：5’-gcgatctccttcgttagg-3’(SEQ ID NO.13)。

将K88ac⁺ETEC(YZ1205)接种LB液体培养基，37℃过夜培养后，取1μL菌液作为模板，以引物P6、P7和P8、P9分别扩增大小为378bp和356bp的DNA片段。

其中，PCR反应体系为：菌液1μL、引物(25μM)各1μL、dNTP(10mM/each，大连宝生物公司)2μL、5x buffer 10μL、PrimSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物公司)0.5μL，去离子水补至50μL。PCR程序为：98℃变性10sec后，68℃退火、延伸1min，共进行30循环，温度降至16℃。

扩增后，1％琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，并分别用限制性内切酶EcoRⅠ、SmaⅠ和SmaⅠ、HindⅢ，按顺序分别插入pUC18载体(大连宝生物公司)中相应的酶切位点；构建的重组质粒用SmaⅠ酶切后，与大肠杆菌基因删除试剂盒中的dif-Gm-dif片段进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，构建重组质粒。以引物P10、P11扩增大小为1300bp的DNA片段。

其中，反应体系为：菌液1μL、引物(25μM)各1μL、dNTP(10mM/each，大连宝生物公司)2μL、5x buffer 10μL、PrimSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物公司)0.5μL，去离子水补至50μL。PCR程序为：98℃变性10sec后，68℃退火、延伸2min，共进行30循环，温度降至16℃，1％琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。

将大肠杆菌基因删除试剂盒中的质粒pKD46转化K88ac⁺ETEC>+ETEC>

实施例2

本实施例2中，对实施例1中构建的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株的生物学特性进行了检测，具体如下：

1)肠毒素检测

配制改良的产毒培养基CAYE培养基：胰蛋白胨10g、酵母3g、氯化钠1.25g、磷酸氢二钾5.7g、微量盐混合溶液0.5mL(5.0％硫酸镁、0.5％氯化锰、0.5％三氯化铁溶于0.001M硫酸溶液中)依次溶于灭菌蒸馏水中，使总量成500mL。用10M氢氧化钠调pH到8.5，121℃高压灭菌15min，放4℃冰箱备用，使用前以无菌方法加入葡糖至0.25％。

分别将K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC>

将2-3kg的健康家兔，手术前饥饿48h，麻醉后以无菌术切开腹壁，自回盲口开始，沿向心方向用4号手术缝线结扎回肠，注射段约5cm，间隔段约1cm，共4段。第一段注射除菌的CAYE培养基，第二段注射无菌DH5α培养上清，第三段注射无菌K88ac⁺ETEC(YZ1205)培养上清，第四段注射无菌K88ac⁺ETEC>+ETEC>+ETEC(YZ1205)无菌培养上清的肠段积液体积与肠段长度比值为1.27(图3)，这表明K88ac⁺ETEC>

2)生长特性比较

将K88ac⁺ETEC(YZ1205)和K88ac⁺ETEC>+ETEC>+ETEC(YZ1205)，生长至10h时，两者繁殖的细菌总数基本相等，10h后由于菌液的浓度过高，超出分光光度计测定范围，而无法进行测定，表明肠毒素基因的突变、敲除对细菌最终繁殖数量影响不大。

3)小鼠小肠黏附试验

在LB平板上复苏K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC>+ETEC>

将8w龄大小的清洁级Balb/c小鼠颈椎脱臼处死后，采集小鼠的回肠，切割成大小3mm长的肠段，剪开肠管，无菌的37℃0.01moL/L PBS(pH7.6)中洗涤3遍，浸泡到上述1mL菌液及无菌的0.01moL/L PBS(pH7.6)中，37℃孵育1h后，刮取回肠粘膜，涂布载玻片，美兰染色后显微镜下观察细菌，结果(图6)K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC>

4)减毒株对小鼠免疫保护作用及在小鼠体内定植时间

为了避免过多的小鼠肠道内杂菌干扰，在进行动物实验前用抗生素清理肠道内的其他杂菌，而K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC>

在含Amp的LB平板上复苏K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC>9cfu/400μL，用于小鼠灌胃接种。

饲喂8w龄的Balb/c小鼠含氨苄青霉素(5g/L)的无菌水，水里添加同时6.7％的果糖，以促进饮水，清除肠道内的其他菌群；48h后，灌胃前12h，小鼠禁食；灌胃前4h，将饮水换为无果糖但添加抗生素的无菌水；灌胃前3h，给小鼠腹腔注射西咪替丁(50mg/kg)，以减少胃酸分泌。将小鼠分成4组，第一组5只，第二组5只，第三组35只，第四组5只；第一、二、四组每只小鼠分别灌胃400μL携带pUC18质粒的K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC>+ETEC>+ETEC(YZ1205)。接种后观察和记录各组小鼠的发病、死亡情况，对死亡的小鼠进行解剖观察肠道的病变；同时每天收集第二组小鼠的粪便，两倍体积的无菌0.01moL/L>

P14：5’TAGAGACCGGTATTACAGAAATCTGA3’(SEQ ID NO.14)；

P15：5’TCATCCCGAATTCTGTTATATATGTC3’(SEQ ID NO.15)；

其反应体系为：菌液1μL、引物P14、P15各1μL、dNTP(10mM/each，大连宝生物公司)2μL、10x buffer 5μL、rTaq DNA聚合酶(大连宝生物公司)0.5μL，去离子水补至50μL。PCR程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30sec、54℃退火30sec、72℃延伸1min，共进行30循环，72℃再充分延伸10min，温度降至16℃，1％琼脂糖凝胶电泳。

结果第二组以及空白对照第四组所有小鼠精神状态良好，无任何临床症状；第一组接种4h后，小鼠出现精神萎靡，反应迟钝，不愿走动，禁食进水较少，蜷缩成一团，被毛竖立，出现颤抖等临床症状，部分小鼠尿色变深、腹泻，12-24h内死亡4只，最终存活1只，剖检死亡小鼠，可见肠道鼓气、有较多积液，肠系膜水肿，腹腔内有浆液性渗出；第三组分别在不同时间段攻毒，144h后攻毒以及之前不同时间段攻毒的小鼠精神状态良好，无任何临床症状，168h后攻毒的5只小鼠，其中4只精神状态良好，无任何临床症状，1只8h后出现精神萎靡，被毛竖立，蜷缩成一团症状，但第二天又恢复正常。这表明减毒的K88ac⁺ETEC>+ETEC(YZ1205)的粘附，由K88ac⁺ETEC引起的仔猪黄痢一般高发生时间为出生后的3-5天，ETEC>+ETEC引起的仔猪黄痢。PCR检测结果显示，减毒的K88ac⁺ETEC>+产肠毒素大肠杆菌能有效防止K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌野毒株的感染。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。