在靶细胞中构建人工染色体的方法以及真核细胞

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及在靶细胞中构建人工染色体的方法以及真核细胞。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是模式生物，是地球上最好理解的生物系统之一。然而，酿酒酵母内部运作的错综复杂性仍使生物工程学家理不出头绪，这个酵母继续作为实验原料来贡献力量。如果科学家能够“重新构建”模式生物，即重新编码它们的基因组，使其更简单且更便于人类的认知和修复，以这些生物体为背景的科学和生物技术会以加速的步伐前进。由此，合成生物学应运而生。

目前无论是DNA合成仪还是芯片，其产物均是70nt左右的寡核苷酸，而要合成大片段DNA，则依赖不同的DNA组装方法。对于5kb以上20kb以下的DNA片段，现有的切分设计方法是利用基于同源臂(如Gibson组装)或者酶切连接或者“桥”片段组装方法的原理将大片段DNA切分为DNA小片段(如750bp)，由于技术限制，过多的片段进行组装成功率非常低，所以这个方法并不能满足合成更大片段的需求；后来，纽约大学的Jef Boeke团队针对长度更长的DNA片段提出了如下方法：将染色体切分为多种大小的片段进行分步组装，染色体被依次且分为30kb、10kb、750bp的DNA片段，然后进行750bp的OE-PCR，750bp至10kb的Gibson组装，10kb至30kb的酶切连接，30kb至染色体的单向替换，但是这个方法费时费力、步骤繁杂、错误率高。

因此，目前合成细胞中染色体的手段，仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够在靶细胞中合成染色体的方法。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种在靶细胞中构建人工染色体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)提供多个一级核酸序列(在本文中，也被称为“minichunk”)，所述多个一级核酸序列是基于所述人工染色体的序列以及所使用的组装核酸载体的序列而确定的，并且沿着所述人工染色体的序列，相邻两个所述一级核酸序列之间存在一级核酸序列同源区；

(2)利用组装体系，将所述多个一级核酸序列中的至少一部分进行组装，以便获得多个二级核酸序列(在本文中，也被称为“chunk”)，所述二级核酸序列的至少一部分中含有与所述靶细胞的染色体同源的野生型同源区(在本文中，也被称为“wt-Ho”)，并且沿着所述人工染色体的序列，相邻两个所述二级核酸序列之间存在二级核酸序列同源区(在本文中也被称为“Ho”)；

(3)将所述多个二级核酸序列的至少一部分引入靶细胞，以便使所述二级核酸序列与所述靶细胞的染色体发生同源重组，从而在所述靶细胞的染色体中形成由所述多个二级核酸序列的至少一部分组成的三级核酸序列(在本文中，也被称为“megachunk”)，并且沿着所述人工染色体的序列，相邻两个所述三级核酸序列之间存在三级核酸序列同源区(在本文中，也被称为“HoM”)；

(4)重复步骤(3)至少一次，以便在所述靶细胞中形成人工合成半染色体；以及

(5)将位于不同靶细胞的两条所述人工合成半染色体通过同源重组整合形成人工染色体。

由于本发明将染色体切分为半染色体、三级核酸序列、二级核酸序列、一级核酸序列，通过逐级组装以及同源重组等方法构建人工合成染色体。本发明的方法能够极大地缩短在细胞中尤其是真核细胞例如酵母细胞诸如酿酒酵母中构建人工染色体的时间，降低成本，提高效率。

在本发明的第二方面，本发明还提出了一种在靶细胞中构建人工染色体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)基于染色体的基因组序列，进行切分设计：

A.确定左右半合成染色体的整合区，并引入第三酶切位点，用于在合成型序列和sub酶识别位点之间形成双键断裂；

B.将半合成染色体切分为三级核酸序列，进而设计为二级核酸序列，在三级核酸序列中交替使用可筛选标志物(在本文中，也被称为“marker”)；

C.将二级核酸序列切分为一级核酸序列，相邻的二级核酸序列拥有二级核酸序列同源区片段，相邻的三级核酸序列拥有三级核酸序列同源区片段；

(2)利用前面所述的在靶细胞中构建人工染色体的方法，在靶细胞中构建人工染色体。

需要说明的是，前面对第一种在靶细胞中构建人工染色体的方法的描述，同样适用于第二种在靶细胞中构建人工染色体的方法，在此不再赘述。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种真核细胞，根据本发明的实施例，所述真核细胞的染色体之一是通过前面所述的方法构建的。由此，能够有效获得包含人工染色体的真核细胞。

根据本发明的实施例的方法设计大片段DNA或者染色体，会得到设计好的8-12k的DNA片段(在本文中称之为chunk)，和在这些8-12k的DNA片段基础上设计好的2-4kb的DNA片段(在本文中称之为minichunk)。这些minichunk片段可以使用已有的DNA组装方法来组装成为chunk片段，然后这些chunk片段会以4-6个chunk片段为一个单元(在本文中称之为megachunk)的方式来进行在载体上的组装(如在酿酒酵母等宿主体内进行同源重组，替换到野生型的染色体上)。这种替换的工作可以分成两部分并行，再进行两部分的整合，对于染色体来说，可以进行从染色体左端和染色体右端的替换，两端替换到产生指定位置后，可以利用I-SceI、I-CeuI、PI-PspI等核酸酶在带有抗性标记的野生部分和合成部分之间产生双键断裂，促使合成染色体的左端和右端进行同源重组，最终获得合成染色体。

本发明方法，步骤简单、实验周期短、且组装错误率低、费用低。

附图说明

图1显示了根据本发明的实施例的方法将酿酒酵母的染色体分为三个步骤设计。

图2显示了Gibson组装产物SNV的验证引物设计，在minichunk之间同源区的上游或者下游特定范围内设计引物。

图3显示了本发明的方法中染色体组装的流程原理示意图。

图4(包括图4-1、4-2、4-3)显示了根据本发明的实施例，synchr07的切分设计示意图，其中黑灰和浅灰色方块分别代表奇数位和偶数位的megachunk，深灰和浅灰色椭圆形分别代表抗性筛选标记LEU2和URA3，深灰色方块代表每个megachunk的野生型染色体区域；图4-1、4-2、4-3按顺序组合在一起是synchr07染色体中的一部分，在此为了更清楚地看清染色体上的切分信息，将图4分成图4-1、4-2、4-3。

图5显示了根据本发明的实施例，为待拼接DNA小片段B3HO，B4F1，B4F2，B4F3，B4HO的酶切结果电泳图，其中黑框中从左到右为B3.HO、B4.F1、B4.F2、B4.F3、B4.Ho使用2k酶进行酶切的结果；根据设计的结果，目标片段分别为1063bp、2729bp、2204bp、2773bp、1075bp，载体片段大小分别为2356bp、2356bp、2278bp、2278bp、2374bp。

图6显示了根据本发明的实施例，酿酒酵母chr07_B4拼接结果质粒电泳图，其中黑框中为B4片段的4个单克隆菌提取的质粒，从左到右标记为B4#2、B4#3、B4#4、B4#5；组装成功的B4片段连同载体一共12265bp，由此，B4#2、B4#4、B4#5为疑似拼接成功的结果。

图7显示了根据本发明的实施例，chr07_B4的酶切鉴定结果，其中黑框中为B4片段的10k酶切产物；目标片段为9555bp，载体片段为2716bp；3个结果显示，质粒均被切开，且片段大小均与预期一致。

图8显示了根据本发明的实施例，5个酵母菌落gDNA样本的PCR初筛电泳结果。

图9显示了根据本发明的实施例，野生型酵母BY4741和初筛正确的编号为1的样本的全引物PCR复筛电泳结果。

图10显示了根据本发明的实施例，对单克隆进行PCR初次筛选的电泳结果。

图11显示了根据本发明的实施例，对单克隆进行PCR二次筛选的电泳结果。

图12显示了根据本发明的实施例，PCR二次筛选正确的编号为I7-7的菌株的测序分析结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图而描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

为了更好地理解本发明的技术方法，在此对本文中出现的术语进行解释说明。

一级核酸序列：利用染色体切分设计软件对染色体进行切分设计后，得到多个一级核酸序列的序列信息。需要说明的是，此处切分设计的染色体可以是野生型染色体，也可以是经过部分改造后合成的染色体。将一级核酸序列的序列信息进行合成后，得到一级核酸序列，一级核酸序列可以保存在质粒中。一级核酸序列是最小一级的核酸序列，两个相邻一级核酸序列之间存在序列的重叠区(在本文中，也被称为“一级核酸序列同源区”)，多个一级核酸序列可组装成二级核酸序列。

二级核酸序列：二级核酸序列由多个一级核酸序列通过组装获得。二级核酸序列可以保存在质粒中。两个相邻二级核酸序列之间存在序列的重叠区(在本文中，也被称为“二级核酸序列同源区”)，部分二级核酸序列含有与靶细胞染色体同源的序列(在文本中，也称为“野生型同源区”)，一个或者多个二级核酸序列在染色体上进行同源重组即可形成含有三级核酸序列的染色体。

三级核酸序列：三级核酸序列由多个二级核酸序列通过同源重组获得。两个相邻三级核酸序列之间存在序列的重叠区(在本文中，也被称为“三级核酸序列同源区”)，拥有一个或者多个三级核酸序列的染色体称为人工合成半染色体。需要注意的是，在一条人工合成半染色体中，三级核酸序列是指二级核酸序列通过同源重组后成功替换上染色体的那部分序列，而非整个染色体实体。即三级核酸序列只是人工合成半染色体序列的一部分。

人工合成半染色体：拥有一个或者多个三级核酸序列的染色体称为人工合成半染色体，人工合成左臂染色体和人工合成右臂染色体是其中的两种类型，人工合成左臂染色体是指该人工合成半染色体中包含着丝粒序列的左半部分序列是合成型序列，而右半部分序列则是野生型序列；反之，人工合成右臂染色体是指该人工合成半染色体的左半部分序列是野生型序列，而包含着丝粒序列的右半部分序列是合成型序列。人工合成左臂染色体和人工合成右臂染色体可通过整合获得人工合成全染色体，人工合成全染色体是指该合成染色体上所有序列均是合成型的。人工合成左臂染色体的合成型序列和人工合成右臂染色体的合成型序列之间有同源区(在本文中，也被称为“整合同源区”)。

人工染色体：指的是通过同源重组整合得到的染色体，其序列既可以是合成型也可以是野生型，其中序列均是合成型的称之为人工合成全染色体。

第一酶切位点，也称为2k酶切位点，对应的酶称为2k酶，是一级核酸序列两端的酶切位点，用于将一级核酸序列和其所在载体分离。

可筛选标志物组装酶位点，也称为mar酶切位点，对应的酶称为mar酶，是部分一级核酸序列中的酶切位点，用于将多个一级核酸序列和可筛选标志物，组装成二级核酸序列。

第二酶切位点，也称为10k酶切位点，对应的酶称为10k酶，是二级核酸序列两端的酶切位点，用于将二级核酸序列和其所在载体分离。

可筛选标志物切割酶位点，也称为sub酶切位点，对应的酶称为sub酶，是部分二级核酸序列中的酶切位点，用于将二级核酸序列中的可筛选标志物切割分离，亦用于部分一级核酸序列的组装中。

第三酶切位点，用于人工合成半染色体之间的同源重组整合。

体外组装：指在细胞体外将核酸片段组装成更长片段的技术。体外组装大体上包含三类：基于酶切链接的组装(如Golden gate组装)，基于序列同源性的组装(如Gibson组装)，基于序列桥接的组装(如LCR组装)。体外组装的片段一般装载在质粒载体中。

体内组装：指在细胞内将核酸片段组装成更长片段的技术，体内组装一般是基于序列同源性的组装(如酵母和大肠杆菌的体内重组)。体内组装的片段直接装载在基因组中。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种在靶细胞中构建人工染色体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)提供多个一级核酸序列，所述多个一级核酸序列是基于所述人工染色体的序列以及所使用的组装核酸载体的序列而确定的，并且沿着所述人工染色体的序列，相邻两个所述一级核酸序列之间存在一级核酸序列同源区；

(2)利用组装体系，将所述多个一级核酸序列中的至少一部分进行组装，以便获得多个二级核酸序列，所述二级核酸序列的至少一部分中含有与所述靶细胞的染色体同源的野生型同源区(在本文中，也被称为“wt-Ho”)，并且沿着所述人工染色体的序列，相邻两个所述二级核酸序列之间存在二级核酸序列同源区(在本文中也被称为“Ho”)；

(3)将所述多个二级核酸序列的至少一部分引入靶细胞，以便使所述二级核酸序列与所述靶细胞的染色体发生同源重组，从而在所述靶细胞的染色体中形成由所述多个二级核酸序列的至少一部分组成的三级核酸序列(在本文中，也被称为“megachunk”)，并且沿着所述人工染色体的序列，相邻两个所述三级核酸序列之间存在三级核酸序列同源区(在本文中也被称为“HoM”)；

(4)重复步骤(3)至少一次，以便在所述靶细胞中形成所述人工合成半染色体；以及

(5)将位于不同靶细胞的两条人工合成半染色体通过同源重组整合形成人工染色体。

由于本发明将染色体切分为半染色体、三级核酸序列、二级核酸序列、一级核酸序列，通过逐级组装以及同源重组等方法构建人工合成染色体。因此，本发明的方法能够极大地缩短在细胞中尤其是真核细胞例如酵母细胞诸如酿酒酵母中构建人工染色体的时间，降低成本，提高效率。

在本发明的实施例中，所述靶细胞为真核细胞。在本发明的实施例中，所述真核细胞为酵母细胞。在本发明的实施例中，所述酵母细胞为酿酒酵母细胞。本发明的发明人发现，通过本发明的方法，能够有效地在真核细胞例如酵母细胞诸如酿酒酵母细胞中成功地构建人工染色体。

在本发明的实施例中，所述一级核酸序列的长度为2-4Kb。

在本发明的实施例中，每个所述一级核酸序列的两侧含有第一酶切位点，所述第一酶切位点的选择是基于所述一级核酸序列的特征确定的。在本发明的实施例中，所述第一酶切位点的选择是基于下列原则确定的：

i.该第一酶切位点不能出现在该一级核酸序列及其相邻的一级核酸序列中。

ii.在该一级核酸序列两侧添加上该第一酶切位点后，不会因为甲基化活性而导致该酶在宿主细胞中的酶切活性降低。

iii.在符合前两条原则的酶的初筛列表中，选择价格最便宜的酶作为最终选择的酶。

在本发明的实施例中，所述第一酶切位点对应酶(在本文中，也被称为2k酶)为选自表3所示酶的至少之一，优选表3所示酶中最适温度为37摄氏度的酶的至少之一。

表3

在本发明的实施例中，所述一级核酸序列的至少一部分含有可筛选标志物组装酶的识别位点，所述可筛选标志物组装酶的识别位点的选择是基于所述一级核酸序列的特征和所使用的可筛选标志物而确定的，

在本发明的实施例中，所述可筛选标志物组装酶为选自表3所示酶的至少之一，优选表3所示酶中最适温度为37摄氏度的酶的至少之一，

在本发明的实施例中，所述一级核酸序列储存于携带抗性基因的核酸载体中。

在本发明的实施例中，所述一级核酸序列同源区的长度为35～45bp。在本发明的实施例中，所述一级核酸序列同源区的Tm值为64～72摄氏度。在本发明的实施例中，所述一级核酸序列同源区的Gibbs自由能为至少-8。本发明的发明人发现，采用这些参数，能够有效地提高一级核酸序列组装为二级核酸序列的效率，并且避免不期望的重组事件。

在本发明的实施例中，所述多个一级核酸序列中的至少一部分中含有loxPsym位点。优选地，在本发明的实施例中，所述loxPsym位点距离所述一级核酸序列同源区的距离为至少40bp。由此，可以避免反向重复的loxPsym序列可能造成的组装错误。

在本发明的实施例中，所述组装体系为体外组装体系，优选基于同源臂的组装体系，更优选Gibson组装体系。

在本发明的实施例中，所述组装体系为体内组装体系。

在本发明的实施例中，所述二级核酸序列的长度为8-12Kb。

在本发明的实施例中，所述二级核酸序列的两侧含有第二酶切位点，所述第二酶切位点的选择是基于所述二级核酸序列的特征和所使用的组装载体而确定。在本发明的实施例中，所述第二酶切位点的选择是基于下列原则确定的：

i.该第二酶切位点不能出现在该二级核酸序列及其相邻的二级核酸序列中。

ii.在该二级核酸序列两侧添加上该酶切位点后，不会因为甲基化活性而导致该酶在宿主细胞中的酶切活性降低。

iii.在符合前两条原则的酶的初筛列表中，选择价格最便宜的酶作为最终选择的酶。

在本发明的实施例中，所述第二酶切位点对应酶(在本文中，也被称为10k酶)为选自表3所示酶的至少之一，优选表3所示酶中最适温度为37摄氏度的酶的至少之一。

在本发明的实施例中，所述二级核酸序列储存在组装载体中，所述组装载体的抗性由组成二级核酸序列的一级核酸序列的载体抗性确定。

需要说明的是，在本发明的实施例中，储存一级核酸序列的载体为普通载体，没有明确要求，优选地，一级核酸序列储存于携带抗性基因的载体中；组装二级序列所用的载体(即组装载体)要和组装方法配对。在本发明的一些实施例中，使用组装体系为Gibson组装体系，所用的组装载体为pSBGAA和pSBGAK，其中pSBGAA载体的抗性为Amp，pSBGAK载体的抗性为Kan。

在本发明的实施例中，每个所述二级核酸序列是基于4～6个所述一级核酸序列而形成的。

在本发明的实施例中，所述野生型同源区与所述二级核酸序列同源区的长度分别独立地为800～1200bp。由此，可以提高二级核酸序列在靶细胞中与野生型染色体间发生同源重组获得三级核酸序列，并且进一步提高三级核酸序列之间在靶细胞中发生重组最终获得人工染色体的效率。

在本发明的实施例中，所述二级核酸序列同源区为所述多个一级核酸序列之一。所述一级核酸序列可重复用于构建相邻两个二级核酸序列。由此，可以进一步降低合成人工染色体的成本。

在本发明的实施例中，所述二级核酸序列同源区中不含有loxPsym位点。由此，可以避免反向重复的loxPsym可能造成的替换错误。

在本发明的实施例中，所述二级核酸序列同源区与所述靶细胞背景DNA的相似性小于0.6，并且相似区的长度为100bp以下。由此，可以降低同源重组替换时出现错误替换的概率，进而提高组装准确度。

在本发明的实施例中，在组成三级核酸序列的最末端的二级核酸序列中包括可筛选标志物。由此，便于确定二级核酸序列与靶细胞所发生的同源重组事件。在本发明的实施例中，所述可筛选标志物为营养缺陷型。由此，可以进一步提高确定二级核酸序列与靶细胞所发生的同源重组事件的效率。在本发明的实施例中，所述可筛选标志物为URA3或LEU2。由此，可以进一步提高确定二级核酸序列与靶细胞所发生的同源重组事件的效率。

在本发明的实施例中，沿着所述人工染色体的序列，相邻两个所述三级核酸序列的可筛选标志物不同。

在本发明的实施例中，针对两条人工合成半染色体，其中一条人工合成半染色体的最右端的二级核酸序列包含可筛选标志物URA3，另一条人工合成半染色体的最左端的二级核酸序列包含可筛选标志物URA3。由此，可以在筛选和整合时，能够使用正筛和反筛(FOA筛选)。

在本发明的实施例中，所述可筛选标志物的序列为所述多个一级核酸序列之一。携带可筛选标志物的一级核酸序列可重复用于构建携带可筛选标志物的二级核酸序列。由此，可以进一步降低合成人工染色体的成本。

在本发明的实施例中，所述可筛选标志物的序列位于非必须的、功能已知或者功能未定义的编码序列中。由此，可以提高经过改造的靶细胞的存活率。

在本发明的实施例中，在包含所述可筛选标志物的二级核酸序列中，不包含自主复制起始位点(ARS)。由此，可以降低筛选的假阳性率。

在本发明的实施例中，所述多个二级核酸序列的至少一部分中含有可筛选标志物切割酶识别序列。由此，可以在实践操作中，通过对可筛选标志物切割酶(在本文中，也被称为sub酶)进行切割来替换可筛选标志物。在本发明的实施例中，所述可筛选标志物切割酶为选自表3所示酶的至少之一。

在本发明的实施例中，所述多个一级核酸序列的一部分含有所述第一酶切位点、第二酶切位点或者可筛选标志物切割酶识别序列。

在本发明的实施例中，针对两条人工合成半染色体，其中一条人工合成半染色体的最右端的二级核酸序列含有第三酶切位点，另一条人工合成半染色体的最左端的二级核酸序列中含有第三酶切位点。需要说明的是，在引入第三酶切位点时，第三酶切位点对应酶必须满足以下条件：整个靶细胞基因组中没有该酶的识别序列。以防止第三酶切位点对应酶对靶细胞基因组产生作用。在本发明的实施例中，所述第三酶切位点位于所述二级核酸序列同源区与其他区域之间。由此，可以通过产生双键断裂提高同源重组效率。在本发明的实施例中，所述第三酶切位点为选自I-SceI、I-CeuI、PI-PspI和PI-SceI位点的至少之一，优选I-SceI位点。由此，能够有效实现在合成型序列和sub酶识别位点之间形成双键断裂，从而提高同源重组效率。

在本发明的实施例中，每个所述三级核酸序列是基于4～6个所述二级核酸序列而形成的。

在本发明的实施例中，所述三级核酸序列的长度为40～60Kb。

在本发明的实施例中，所述三级核酸序列同源区为所述多个一级核酸序列之一。由此，可以进一步降低合成人工染色体的成本。

在本发明的第二方面，本发明还提出了一种在靶细胞中构建人工染色体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)基于染色体的基因组序列，进行切分设计：

A.确定左右半合成染色体的整合区，并引入第三酶切位点，用于在合成型序列和sub酶识别位点之间形成双键断裂；

B.将半合成染色体切分为三级核酸序列，进而设计为二级核酸序列，在三级核酸序列中交替使用可筛选标志物；

C.将二级核酸序列切分为一级核酸序列，相邻的二级核酸序列拥有二级核酸序列同源区片段，相邻的三级核酸序列拥有三级核酸序列同源区片段；

(2)利用前面所述的在靶细胞中构建人工染色体的方法，在靶细胞中构建人工染色体。

在本发明的实施例中，4-6个所述二级核酸序列组成1个所述三级核酸序列。

在本发明的实施例中，4-6个所述一级核酸序列组成1个所述二级核酸序列。

在本发明的实施例中，所述第三酶切位点为选自I-SceI、I-CeuI、PI-PspI和PI-SceI位点的至少之一，优选I-SceI位点。由此，能够有效实现在合成型序列和sub酶识别位点之间形成双键断裂，从而提高同源重组效率。

在本发明的实施例中，所述可筛选标志物为LEU2和URA3。

需要说明的是，前面对第一种在靶细胞中构建人工染色体的方法的描述，同样适用于第二种在靶细胞中构建人工染色体的方法，在此不再赘述。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种真核细胞，根据本发明的实施例，所述真核细胞的染色体之一是通过前面所述的任意一种在靶细胞中构建人工染色体的方法构建的。

在本发明的实施例中，所述细胞为酵母细胞。

在本发明的实施例中，所述酵母为酿酒酵母。

根据本发明的实施例的方法设计大片段DNA或者染色体，会得到设计好的8-12k的DNA片段(在本文中称之为chunk)，和在这些8-12k的DNA片段基础上设计好的2-4kb的DNA片段(在本文中称之为minichunk)。这些minichunk片段可以使用到已有的DNA组装方法来组装成为chunk片段，然后这些chunk片段会以4-6个chunk片段为一个单元(在本文中称之为megachunk)的方式来进行在载体上的组装(如在酿酒酵母等宿主体内进行同源重组，替换到野生型的染色体上)。这种替换的工作可以分成两部分并行，再进行两部分的整合，对于染色体来说，可以进行从染色体左端和染色体右端的替换，两端替换到产生指定位置后，可以利用第三酶切位点对应的酶在带有抗性标记的野生部分和合成部分之间产生双键断裂，促使合成染色体的左端和右端进行同源重组，最终获得人工合成染色体。

需要说明的是，本发明的方法重在针对大片段DNA、所使用的组装载体和筛选标记(此处包含抗性筛选和营养缺陷筛选)的特征，以及实验上对包括Gibson组装和同源重组替换在内的组装流程的改用经验，为实验人员提供成熟的大片段DNA或者染色体的合成、组装、替换、验证方案。该切分设计方法可使用SegMan(由深圳华大基因研究院提供，该软件的软件著作权申请证书登记号为：2015SR026088，通过参照将其全文并入本文)来实施，也可以通过其他可实现等同功能的软件来实施。

根据本发明的一些实施例，本发明的方法的核心分为三部分：染色体至半染色体的设计，半染色体至8-12kb片段(即chunk)的设计，chunk至2-4kb片段(即minichunk)的设计。在实验上，则是minichunk经组装成(可通过基于同源臂、酶连、“桥”片段连接的各种组装方法)chunk，然后chunk从染色体两端以4-6个chunk为单位(即megachunk)开始组装或者替换(可通过同源重组替换、酶切连接组装替换)至载体上(载体可以是质粒、人工染色体、野生染色体等)。最后采取双向策略，将两个携带有人工合成半染色体的载体进行基于第三酶切位点的同源重组整合，得到整条人工合成染色体。

根据本发明的一些实施例，以人工合成酿酒酵母的一条染色体为例展示切分技术方案：

将酿酒酵母的染色体分为三个步骤设计：

A.确定左右半合成染色体的整合区，并引入I-sceI，用于在合成型序列和sub酶识别位点之间形成双键断裂；

B.将半合成染色体切分为megachunk，进而设计为chunk，在megachunk中交替使用筛选标记物(比如LEU2和URA3)，多个chunk(比如4-6个)组成一个megachunk；

C.将chunk切分为minichunk，多个minichunk(比如4-6个)组成一个chunk,同时还有两个特殊的minichunk的设计，相邻chunk拥有的同源区设计为Ho片段，相邻megachunk拥有的同源区设计为HoM片段。

本发明的方法考虑了大量目标DNA或者染色体、所使用的组装载体和抗性筛选标记的特征，如单个染色体的局部与整个宿主背景DNA的同源性，非必须的、功能已知或者功能未定义的编码序列、ARS、引入的loxpSym序列的位置，载体和抗性标记的酶切位点，染色体的局部Tm值和Minimal Gibbs Free Energy等。根据本发明的一些实施例，本发明的方法涉及的参数如下：

一、基本参数

1、megachunk的长度为40kb-60kb，chunk的长度为8-12kb，minichunk的长度为2-4kb；染色体左端和右端的syn同源区长度为2000-5000bp，chunk之间的syn同源区和wt同源区的长度为800-1200bp，minichunk之间的同源区为35bp-45bp，minichunk之间同源区的Tm值范围为64-72℃，最小Gibbs自由能大于-8。

二、同源臂参数

1.chunk之间同源区与宿主(以酿酒酵母为例)背景DNA的相似性小于0.6，相似区长度小于100bp，以降低同源重组替换时，出现替换错误的概率。

2.chunk之间同源区不含有loxpSym位点，minichunk之间同源区距离loxPsym位点至少40bp，以避免反向重复的loxPsym可能造成的未知的组装错误。

酶参数：

3.第一酶切位点、第二酶切位点对应酶、可筛选标志物组装酶和可筛选标志物切割酶在酶切后都留有5’单链或者平末端(或者都留有3’单链或者平末端)，使得酶切后进行同源重组替换时，不会引入scar单核苷酸突变。上述第一酶切位点、第二酶切位点对应酶，以及可筛选标志物切割酶均可选自表3所示酶的至少之一。

4.设计可筛选标志物切割酶，使得共用的minichunk——HoM片段能被重复利用；

5.第一酶切位点、第二酶切位点对应酶、可筛选标志物组装酶以及可筛选标志物切割酶的最适温度尽量在37℃附近，尽量使用低价且没有甲基化沉默活性的酶。

三、特殊参数

1.在染色体左右端的最后一个chunk的合成型序列和sub酶识别位点之间插入第三酶切位点，例如I-sceI位点，以便于左右臂整合。第三酶切位点可将合成型序列和sub酶识别位点分开，产生双键断裂，增大同源重组率。

2.可筛选标记物的插入位置在非必须的、功能已知或者功能未定义的编码序列中。使得可筛选标志物的插入不会影响到生物体的基本生长。

3.携带可筛选标志物的chunk中没有ARS，以避免在同源重组替换的实验过程中，没有替换上去的chunk片段能够自我复制，使得细胞具有该可筛选标志物的抗性，增加筛选的假阳性率。

4.Megachunk之间的同源区设计为标记HoM的minichunk，chunk之间的同源区设计为标记Ho的minichunk。

5.设计插入可筛选标志物切割酶的酶切位点，使得可筛选标志物成为minichunk，可以重复利用，进一步降低合成成本。

另外，根据本发明实施例的方法考虑了大量目标DNA或者染色体、所使用的组装载体和抗性筛选标记的特征，如单个染色体的局部与整个宿主背景DNA的同源性，非必须的、功能已知或者功能未定义的编码序列、ARS、引入的loxpSym序列的位置，载体和抗性标记的酶切位点，染色体的局部Tm值和Minimal Gibbs Free Energy(最小Gibbs自由能)等。

另外，根据本发明的实施例，还可以对Gibson组装产物的SNV进行验证，具体步骤包括：在每个chunk的minichunk之间的同源区的上游或者下游设计引物，以便于利用第一代测序技术sanger测序来进行验证。

由此，根据本发明的实施例，切分设计方法能够采用双向策略将大片段DNA或者染色体切分设计为8-12kb大小的DNA和2-4kb大小的DNA片段。相比现有的方法，这种切分设计方法的步骤简单、实验周期短，且组装错误率低、费用低。

在实验上，则是minichunk经组装成(可通过基于同源臂的各种组装方法)chunk，然后chunk从染色体两端以多个chunk为单位(即megachunk)开始组装或者替换(可通过同源重组替换)至载体上(载体可以是质粒、人工染色体、野生染色体等)。替换采取双向策略，最终将两个携带有人工合成半染色体的载体进行基于第三酶切位点的同源重组整合，获得整条人工合成染色体。

通常而言，针对较大的DNA片段，如染色体规模的片段来说，现有的切分设计方法是将染色体切分为30kb、10kb、750bp、70nt的DNA片段，然后进行70nt至750bp的OE-PCR，750bp至10kb的Gibson组装，10kb至30kb的酶切连接，30kb至染色体的单向替换。从以上步骤可看到，若采用现有的切分设计方法，一个1Mb的染色体从头到尾进行合成、组装、替换，需要4个核心步骤，需要做至少30870个70nt至750bp的OE-PCR、至少1470个750bp至10kb的Gibson组装、至少105个10kb至30kb的酶切连接和至少35个30kb至染色体的单向替换。再结合上必须的质控、除错、筛选等，步骤非常繁杂而且耗时耗力。而根据本发明的实施例的方法将70nt至2kb-4kb的组装这一步转交给DNA合成方，直接使用2kb-4kb大小的片段(即minichunk)至8-12kb大小的片段(即chunk)进行组装，接着抛弃10kb至30kb酶切连接一步，直接进行以4-6个chunk为单位(即megachunk)的同源重组替换；该组装和替换均从染色体两端同时进行，加上最后的左右端同源重组整合，总共是3个核心步骤。以酿酒酵母的合成型7号染色体来说，长约1.03Mb的synchr07只需要485个minichunk至chunk的Gibson组装和129个chunk至染色体的替换。即便加上质控、除错、筛选和后续的同源重组整合，步骤大幅减少，使用的时间精力也大幅下降。

根据本发明实施例的方法，所需要的人工成本，实验物料仪器成本、水电储存等成本能够得到大幅降低。

另外根据本发明实施例的方法，在minichunk的设计中，也对minichunk的重复利用进行特殊设计。一，将megachunk之间的和chunk之间的同源区(约1kb)设计为共用的minichunk，用于上下两个相邻chunk的组装；二，将marker作为一个共用的minichunk来使用，在对应chunk的组装中重复被利用。以synchr07为例，总共有127个Ho或者HoM片段，以平均长度900bp来算，这点总共节省了114.3kb的合成成本；两种marker总共使用了23次，以平均长度700bp来算，这点总共节省了14.7kb的合成成本。上述两点节省的成本占总合成成本的8％左右。

根据本发明实施例的方法，步骤简单、实验周期短、且组装错误率低、费用低。

在根据本发明的实施例的方法中，除去了10kb至30kb的酶切连接的步骤，同时对组装的minichunk之间的同源区附近设计引物，通过sanger测序进行质控，从根本上解决了组装错误率的两大错误来源问题，使得组装错误率较低。

实施例：

本实施例通过染色体切分设计、minichunk至chunk的组装、chunk至megachunk的体内替换、左右臂同源重组整合，共4个部分，构建酿酒酵母合成型7号染色体，具体如下：

一、酿酒酵母合成型7号染色体(synchr07)切分设计方案。

使用切分设计软件SegMan(由深圳华大基因研究院提供，该软件的软件著作权申请证书登记号为：2015SR026088，通过参照将其全文并入本文)来进行酿酒酵母合成型7号染色体(酿酒酵母野生型7号染色体数据可通过SGD数据库(http://www.yeastgenome.org/)获得，可根据需要对其进行多种序列的修改后，即可获得酿酒酵母合成型7号染色体的数据)的切分设计。具体操作方法参照软件使用说明书。

发明人通过对目标染色体序列进行切分得到标记为A1-Y5的129个chunk的genbank格式和fasta格式的信息文件，也得到在chunk的基础上设计的485个minichunk的genbank格式和fasta格式的信息文件。Chunk设计的结果如图4所示(部分)。

图4显示了synchr07的切分设计示意图。黑灰和浅灰色方块分别代表奇数位和偶数位的megachunk，深灰和浅灰色椭圆形分别代表抗性筛选标记LEU2和URA3，深灰色方块代表每个megachunk的野生型染色体区域。通过该图可以获得chunk设计的直观了解。

表1显示了切分设计好的B megachunk的chunk信息，表2显示了切分设计好的B4chunk的minichunk信息。

表1

表2

二、以chunk B4的所有minichunk为例进行minichunk至chunk的Gibson组装

1.制备待拼接的minichunk质粒B3HO，B4F1，B4F2，B4F3，B4HO

1.1取出12mL圆底培养管，各倒入液体LB培养基5mL，分别加对应的抗生素(如minichunk质粒携带的是KanR抗性，则加入卡那霉素)至50μg/mL。接种10μL菌液至圆底培养管中，在37℃下200rpm摇培过夜。

1.2用1.5mL离心管12000rpm离心1min收集菌体2次，使用天根快速质粒小提试剂盒提取质粒，用50μL TB buffer溶解DNA。使用Nanodrop 2000测定所提质粒DNA的浓度，要求DNA浓度≥120ng/μL。

2.进行minichunk质粒的酶切回收

2.1取1μL DNA电泳检测。琼脂糖凝胶浓度为1％，6μL Wide-Range DNA Marker，电压为130V，电泳时间为1h。

2.2在1.5mL离心管中，配制以下体系对minichunk质粒进行酶切，在酶的最适温度反应3h：

2.3取1μL酶切产物电泳检测。琼脂糖凝胶浓度为1％，6μL Wide-Range DNAMarker，电压为130V，电泳时间为1h。图5为待拼接minichunkB3HO，B4F1，B4F2，B4F3，B4HO的酶切结果电泳图。

图5红框中从左到右为B3.HO、B4.F1、B4.F2、B4.F3、B4.Ho使用2k酶酶切的结果。根据设计的结果，目标片段分别为1063bp、2729bp、2204bp、2773bp、1075bp，载体片段大小分别为2356bp、2356bp、2278bp、2278bp、2374bp。

2.4使用QIAquick PCR Purification Kit纯化回收酶切产物，用15μL EB buffer溶解DNA。

使用Nanodrop 2000测定所回收DNA的浓度，将回收的DNA放入-20℃冰箱保存备用。

3.进行Gibson组装并转化

3.1设用于拼接的minichunk条数为N，编号为F₁-F_N；minichunk质粒的总长度为Y，minichunk长度为X，回收的DNA浓度为C，则minichunk浓度为C_N＝X/Y×C；组装载体pSBGAK浓度为C_V(Gibson组装体系及其载体，来自NEB提供的Gibson>

3.2将配好的拼接体系在Thermomixer中50℃反应1h。

3.3用冰盒取适量的冰，从-80℃冰箱拿1管大肠杆菌DH5α感受态细胞，迅速放在冰上。

取10μL拼接反应液，加入到1.5mL离心管中，放在冰上预冷。待感受态细胞融化后，取50μL感受态细胞加入到离心管中，吹吸3次与拼接反应液混匀，冰浴30min。期间调Thermomixer至42℃，打开摇床调至37℃200rpm。将离心管迅速放入Thermomixer中，42℃热激90sec。迅速取出离心管放回冰上，冰浴4min。在超净台上，加700μL SOC液体培养基到离心管中，将离心管放入摇床，37℃200rpm培养45min。取出离心管，12000rpm离心30sec，在超净台中去掉600μL上清液，用余下的上清液吹吸混匀沉淀，涂在对应抗性的平板上。(筛选平板对应的氨苄西林工作浓度为50μg/mL，卡那霉素的工作浓度为30μg/mL。)

3.9将涂好的平板在超净台上晾干，37℃培养过夜。

4.对Gibson产物进行鉴定

4.1取5个12mL圆底培养管，分别倒入4mL LB液体培养基，加氨苄西林至50μg/mL。取出转化平板，用10μL移液器吸头挑5个单克隆，分别接种到5个圆底培养管中，在37℃下200rpm培养过夜。

4.3用1.5mL离心管12000rpm离心1min收集菌体1次，使用天根快速质粒小提试剂盒提取质粒，用50μL TB buffer溶解DNA。

4.4取2μL DNA电泳检测。琼脂糖凝胶浓度为1％，6μL Wide-Range DNA Marker，电压为130V，电泳时间为1h。图6所示为酿酒酵母chr07_B4拼接结果质粒电泳图。

图6黑框中为B4片段的4个单克隆菌提取的质粒，从左到右标记为B4#2、B4#3、B4#4、B4#5。组装成功的B4片段连同载体一共12265bp，由此，B4#2、B4#4、B4#5为疑似拼接成功的结果。

4.5根据电泳结果，选2-3个大小正确的质粒，在DNA大片段两段选择合适的酶切位点(即表1chunk质粒的酶)，按下表配制反应体系进行酶切鉴定，在酶的最适温度下反应3h：

4.6取10μL酶切产物电泳检测。琼脂糖凝胶浓度为1％，6μL Wide-Range DNAMarker，电压为130V，电泳时间为1h。图7所示为chr07_B4的酶切鉴定结果。

图7黑框中为B4片段的10k酶切产物。目标片段为9555bp，载体片段为2716bp。3个结果显示，质粒均被切开，且片段大小均与预期一致。

由此，B4片段(8-12kb片段)已组装成功。

三、以B1-B5(5个10kb片段)替换至synchr07A(50kb部分)为例，进行chunk至megachunk的酵母同源重组替换

1.提取质粒

1.1在12mL圆底培养管中加入5mL LB液体培养基和加5μL对应的抗生素(例如质粒的抗性是KanR，则加入卡那霉素)。每管接10μL菌液，每个菌株接2管，在37℃下200rpm摇培过夜。

1.2用2mL离心管12000rpm离心1min收集菌体3次，使用天根快速质粒小提试剂盒提取质粒，用50μL TB buffer溶解DNA。使用Nanodrop 2000测定所提质粒DNA的浓度，-20℃冰箱保存。

1.3取0.5μL质粒DNA与2μL 10×loading buffer，吹吸混匀，点样，点3μLλ-HindIII DNA Marker；1.2％琼脂糖，120V电泳40min，染胶10min(质粒浓度<400ng/μL时取1μL电泳，>400ng/μL时取0.5μL电泳)。

2.酶切回收

2.1在1.5mL离心管中，配制以下20μL体系，对chunk质粒进行酶切，在酶的最适温度反应3h，每个质粒切2管：

2.2取1μL酶切产物与2μL 10×loading buffer，吹吸混匀，点样，点3μLλ-HindIIIDNA Marker；1.2％琼脂糖，120V电泳40min，染胶10min。使用Qiagen凝胶回收试剂盒纯化回收酶切产物(将相同的两管酶切产物放到同一个管中以增加产物的量)，用20μL EB buffer溶解DNA。使用Nanodrop 2000测定所回收DNA的浓度，-20度冰箱保存。

3.酵母感受态细胞制备及转化

3.1取出12mL圆底培养管，加入4mL YPD液体培养基和10μL菌液，在30℃下200rpm摇培过夜进行复苏。

3.2在锥形瓶中加入50mL YPD液体培养基，接种过夜培养的菌液，在30℃下200rpm摇培至OD值介于0.6-1.0之间。

3.3将50mL菌液倒入50mL离心管中，3000rpm离心5min。去除上清，悬空加入50mL灭菌水，颠倒混匀，3000rpm离心5min。去除上清，悬空加入20mL 0.1mol/L的醋酸锂溶液，颠倒混匀，3000rpm离心5min。去除上清，加入1mL的0.1mol/L的醋酸锂溶液，将菌体吹打混匀,至此，酵母感受态细胞制备完成。

3.4在1.5mL离心管中加入100μL的酵母感受态细胞，然后依次加入2.2中酶切回收的DNA片段各200-500ng，25μL ssDNA，41μL 1mol/L的醋酸锂溶液，312μL 50％PEG3350，将菌体吹打混匀或振荡混匀，置于30℃培养箱放置30min，加入50μL DMSO，稍微振荡混匀后，将离心管置于42℃的金属浴锅上放置15min，取出离心管，3000rpm离心2min，小心吸去上清，加入1mL>2溶液吹打混匀，3000rpm离心1min，仔细去除上清，加入100μL>2溶液，将菌体吹打混匀。

3.5在SC-Ura平板上倒上灭菌的玻璃珠，在平板中央滴上100μL>2溶液，然后在平板的CaCl₂溶液中央加入15μL样品，用玻璃珠将液体涂布均匀，稍稍晾干后，将平板放置到30℃培养箱倒置培养2-3天。

4.鉴定同源重组替换产物

4.1将3.5的平板上的菌影印到灭菌的天鹅绒布上，再通过绒布将拷贝的菌落分别转移到SC-Ura和SC-Leu培养基的选择平板上，30℃培养箱倒置培养过夜。

4.2取出培养好的选择平板，挑选出在SC-Ura平板上菌落饱满而在SC-Leu平板上菌落扁平的菌，用牙签将这些克隆涂布到SC-Ura的选择平板上，30℃培养箱倒置培养过夜后，再次将拷贝的菌落分别转移到SC-Ura和SC-Leu培养基的选择平板上，30℃培养箱倒置培养过夜。

4.3再次挑选出在SC-Ura平板上菌落饱满而在SC-Leu平板上菌落扁平的菌，将菌体从平板上挂下来，分别加入到1.5mL离心管中，加入100μL SDS将菌体吹打混匀，然后加入玻璃珠和100μL PCI。将装有上述溶液的离心管在振荡器上振荡3min，然后加入100μL灭菌水，继续振荡混匀10s。将上述溶液的离心管，12000rpm离心10分钟，用150μL体积吸取上层清液到干净的1.5mLEP管中，做好标记，-20℃冰箱保存。即得酵母的gDNA。

4.6为了鉴定上一步得到的gDNA是否正确，我们从每一个替换的10kb片段上各选取一对合成型引物和一对野生型引物。关于引物的说明：在设计酿酒酵母合成型7号染色体序列时，由于设计的基因编码区域序列与野生型基因序列不同，并且序列之间的差异大于33％，因此，以这些具有差异的序列作为模板，使用引物设计软件即可设计出对应的合成型引物和野生型引物。

配制以下体系，对gDNA进行PCR鉴定。

图8是5个酵母菌落gDNA样本的PCR初筛电泳结果图。在每一个进行替换的chunk(B1、B2、B3、B4、B5)上，各挑选1对合成型引物和1对野生型引物进行PCR。图中每一个样本的B1、B2、B3、B4、B5均各有两条泳道，左边泳道是野生型引物扩增结果、右边泳道是合成型引物扩增结果。野生型引物扩增均没有产物条带，合成型引物扩增均有产物条带的样本是正确的，即编号为1、2、3、5的样本初筛结果是正确的。

4.7PCR程序：

94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；12℃，∞。30个循环。

4.8取1μLPCR产物电泳检测。琼脂糖凝胶浓度为1.5％，6μL DL2000DNA Marker，电压为130V，电泳时间为40min，染胶10min。

4.9经电泳检测正确的样品，按照上述体系，选取全部的PCR Taq，再次进行PCR和电泳检测。

图9是野生型酵母BY4741和初筛正确的编号为1的样本的全引物PCR复筛电泳结果图。其中，图9中，上图为野生型酵母BY4741的PCR结果，下图为编号为1的样本的PCR结果。对于上下两部分(即上图和下图)PCR结果，又细分为野生型引物和合成型引物的PCR结果。每一个泳道则是对应产物的ID。对于野生型酵母BY4741来说，野生型引物扩增后均有条带而合成型引物扩增均无条带是正常的对照；对于编号为1的样本来说，野生型引物扩增后均无条带而合成型引物扩增均有条带证明该样本已经替换成功。

经鉴定正确的样品，挑取其在平板上对应的克隆，在YPD培养基中，30℃摇培过夜，在灭菌的超净台中，取500μL过夜培养的酵母菌液加入灭菌的EP管中，加入等体积50％的甘油，吹打混匀，做好标记，-80℃冰箱保存。

四、以酵母7号人工合成左臂染色体和人工合成右臂染色体的同源重组整合为例进行人工合成左臂染色体和人工合成右臂染色体的整合

1.半合成菌株杂交

挑人工合成左臂染色体和人工合成右臂染色体单克隆各1个，共同接种至3mL YPD液体培养基中，30℃200rpm摇培过夜，取适量菌液涂SC-Lys-Met培养基平板，30℃培养直至长出单克隆。

2.染色体整合

2.1表达载体转化

在杂交平板上挑Lys+Met+单克隆，使用醋酸锂法(可参照：Schiestl,R.H.andGietz,R.D.(1989)High efficiency transformation of intact yeast cells usingsingle stranded nucleic acids as a carrier.Curr.Genet.,16,339–346.)将I-SceI表达载体pRS413-ISceI(由美国约翰霍普金斯大学Jef D Boeke教授提供)转入二倍体合成染色体菌株中，涂SC-His培养基平板，30℃培养直至长出单克隆。

2.2诱导整合

在转化平板上挑His+单克隆，接种至3mL SC-His液体培养基中，30℃200rpm摇培过夜；1/10接种至SC-His(棉籽糖)液体培养基中，摇培至对数中期(OD600＝0.4)；离心收集菌体，用SC-His(半乳糖)液体培养基重悬菌体，摇培诱导2h；接适量菌液至3mL YPD液体培养基中，30℃200rpm摇培过夜。

3诱导产孢

3.1诱导产孢

取1mL诱导菌液，涂SPOR产孢培养基平板，室温放置1d，30℃诱导产孢7-10d。

3.2孢子筛选

在产孢平板上用黄枪头刮适量菌体至25μL酵母细胞壁裂解酶Zymolyase-100T溶液(1mg/mL，缓冲液为1mol/L的山梨醇)中，37℃处理30-50min；处理结束后加500μL ddH2O，涡旋混匀，取适量菌液涂SC+FOA培养基平板，30℃至长出单克隆。将SC+FOA平板影印到SC-LEU平板，30℃培养箱倒置培养过夜。

4PCR鉴定

对比SC-LEU的克隆情况，在SC+FOA平板上挑LEU-的单克隆，在合成染色体上megachunkA和megachunkY挑一对合成型、野生型引物对单克隆进行PCR初次筛选(方法同上述鉴定同源重组替换产物中的步骤4.6)，再在其他的每个megachunk(B到X)上挑一对合成、野生引物对单克隆进行PCR二次筛选，得到筛选后的菌株。

图10是PCR初次筛选的电泳结果图。图中每一个样本各有两条泳道，左边泳道是合成型引物扩增结果、右边泳道是野生型引物扩增结果。如图可知，8个样本中4、5、6、7四个样本是正确的。

图11是PCR二次筛选的电泳结果图。图中每一个样本各有两条泳道，左边泳道是合成型引物扩增结果、右边泳道是野生型引物扩增结果。如图可知，4、5、6、7四个样本中样本7是完全正确的(标记为I7-7)。

5.测序鉴定

对PCR二次筛选正确的编号为I7-7的菌株进行基因组的提取、建库，以及使用iontorrent公司的PGM测序仪进行测序。

图12是测序分析的结果一览。从上到下分别是测序深度，染色体的位置(坐标轴)，PCRtag类型(浅灰色代表合成型，深灰色代表野生型)，loxPsym位点信息(浅灰色代表存在，无则代表不存在)，各个chunk的相对位置。PCRtag类型均是合成型，loxPsym位点均是存在状态，synchr07左右两个半染色体整合完毕。

其中，上述实施例中所使用的培养基配方如下：

YPD培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。

SPOR培养基：醋酸钾10g/L，酵母粉1.25g/L，葡萄糖1g/L，琼脂粉20g/L。

SC+FOA培养基：5-FOA 1g/L，-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基础氮源(不含氨基酸、硫酸铵)1.7g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖20g/L，100×Ura 10mL/L，50×Leu 20mL/L，100×Met10mL/L，100×Lys 10mL/L，333×His 3mL/L；琼脂粉30g/L。

SC-His(葡萄糖)养基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基础氮源(不含氨基酸、硫酸铵)1.7g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖20g/L，100×Ura 10mL/L，50×Leu 20mL/L，100×Met10mL/L，100×Lys 10mL/L。

SC-His(棉籽糖)养基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基础氮源(不含氨基酸、硫酸铵)1.7g/L，硫酸铵5g/L，棉籽糖20g/L，葡萄糖1g/L，100×Ura 10mL/L，50×Leu 20mL/L，100×Met 10mL/L，100×Lys 10mL/L。

SC-His(半乳糖)养基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基础氮源(不含氨基酸、硫酸铵)1.7g/L，硫酸铵5g/L，半乳糖20g/L，100×Ura 10mL/L，50×Leu 20mL/L，100×Met10mL/L，100×Lys 10mL/L。

-5氨基酸混合粉末：腺嘌呤1.5g，丙氨酸6g，精氨酸6g，天冬氨酸6g，天冬酰胺6g，半胱氨酸6g，谷氨酸6g，谷氨酰胺6g，甘氨酸6g，异亮氨酸6g，苯丙氨酸6g，脯氨酸6g，丝氨酸6g，苏氨酸6g，色氨酸6g，酪氨酸6g，缬氨酸6g。

100×Ura：尿嘧啶2.24g/L。

50×Leu：亮氨酸13g/L。

100×Met：甲硫氨酸7.5g/L。

100×Lys：赖氨酸18.3g/L。

333×His：组氨酸21g/L。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。