胱硫醚β‑裂解修饰酶的制备方法及含胱硫醚β‑裂解修饰酶试剂盒

技术领域

本发明涉及一种胱硫醚β-裂解修饰酶的制备方法及含胱硫醚β-裂解修饰酶试剂盒，属于酶技术领域。

背景技术

胱硫醚β-裂解酶可以催化L-胱硫醚生成同型半胱氨酸和丙酮酸，是循环法检测同型半胱氨酸中重要的酶之一。

同型半胱氨酸是氨基酸半胱氨酸的异种，在旁链部份硫醇基(-SH)前包含一个额外的亚甲基(-CH₂-)。

1969年Mccμlly从遗传性同型半胱氨酸尿症死亡儿童尸检中发现，其体循环内存在广泛的动脉血栓形成及动脉粥样硬化(AS)的病理表现，由此提出高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHCY)可导致动脉粥样硬化性血管性疾病的假说。此后，各国学者对HCY与心脑血管疾病的相关关系做了大量研究。研究结果表明，Hcy可以直接或间接导致血管内皮细胞损伤，促进血管平滑肌细胞增殖，影响低密度脂蛋白的氧化，增强血小板功能，促进血栓形成。

血清内同型半胱氨酸的高水平是心血管疾病及中风的风险因素，是这种疾病的标记。

同型半胱氨酸循环检测法的原理为：HCY在胱硫醚β-合酶(CBS)催化下和丝氨酸反应生成L-胱硫醚(CYS)。L-胱硫醚(CYS)在胱硫醚β-裂解酶(CBL)催化下生成HCY、丙酮酸和NH3。该循环反应生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下，引起β-NADH转化为β-NAD+，340nm处吸光度变化与样品中HCY浓度成正比。此反应中，胱硫醚β-合酶和胱硫醚β-裂解酶为的性能最为关键。然而这些年，对于胱硫醚β-合酶的研究已经越来越深入，胱硫醚β-合酶的表达纯化技术也已较为完善，而对于胱硫醚β-裂解酶的研究还相当有限，使得胱硫醚β-裂解酶的稳定性有限，导致同型半胱氨酸检测试剂盒稳定性的不佳。

目前，国内普遍的HCY检测试剂盒的开封稳定性为14～21天，而进口试剂的开封稳定性可达到28～30天。主要差异便在于胱硫醚β-裂解酶在试剂中的稳定性。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种胱硫醚β-裂解酶的修饰方法和含该修饰酶的试剂盒。本发明提供一种胱硫醚β-裂解酶的修饰方法，同时利用该方法修饰的胱硫醚β-裂解酶，发明了一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒。该试剂盒准确度好、稳定性佳，测定结果准确可靠。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种对胱硫醚β-裂解酶进行修饰的方法，其包括如下步骤：

S1：去除胱硫醚β-裂解酶功能性氨基酸链中的Cys的氨基酸侧链的巯基，得到胱硫醚β-裂解酶非功能性氨基酸链；

S2：切除所述胱硫醚β-裂解酶非功能性氨基酸链中的12个氨基酸，完成修饰。

作为优选方案，步骤S1中所用的去除试剂为N-(1-芘)马来酰亚胺、甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺、聚乙二醇甲醚马来酰亚胺中的一种或几种的混合。

作为优选方案，步骤S2中所用的切除试剂为弹性蛋白酶。

第二方面，本发明提供了一种可由前述的方法得到的胱硫醚β-裂解修饰酶。

第三方面，本发明还提供了一种含有前述的胱硫醚β-裂解修饰酶的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中，所述试剂R2包含有按下列浓度计的各组分：

作为优选方案，所述试剂R1包含有按下列浓度计的各组分：

作为优选方案，所述试剂R1和试剂R2中的缓冲液均为Good’s缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种或几种；试剂R1和试剂R2中的缓冲液的PH均为6.0～8.0。

作为优选方案，所述试剂R1和试剂R2中的表面活性剂均为吐温20、吐温80、曲拉通-100、十二烷基苯磺酸钠中的一种或几种。

作为优选方案，所述试剂R1和试剂R2中的稳定剂均为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、螯合剂EDTA类中的一种。

作为优选方案，所述试剂R1和试剂R2中的防腐剂均为叠氮钠或proclin系列防腐剂。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、胱硫醚β-裂解酶因为功能性氨基酸链中含有Cys，侧链含有-SH。在溶液中会自发形成二硫键，导致功能性氨基酸链的空间构象发生变化，酶活力丧失，故稳定性不佳。使用本发明中的修饰剂修饰后，去除了-SH，并且对酶本身活力没有明显的影响，从而提高了胱硫醚β-裂解酶在溶液中的稳定性。

2、胱硫醚β-裂解酶的非功能性氨基酸链很长，受到酶空间构象的影响，功能性氨基酸链与底物结合往往不够充分，导致酶活力受到影响，正常反应条件下酶与L-胱硫醚结合的Km值为2mmol/L。经过弹性蛋白酶的水解，我们可以去除非功能性氨基酸链末端的12个氨基酸。使得酶空间构象发生改变。大大提高了反应条件下酶的活力。修饰后的酶在正常反应条件下酶与L-胱硫醚结合的Km值可达到6mmol/L，活力提高了很多。

3、通常的胱硫醚β-裂解酶的最适反应PH值为8.0，而胱硫醚β-合酶的最适反应PH值为8.4～9.0。最适反应PH的差异导致在正常的反应条件下，不能使得2个酶都最高效的得到利用。而使用本发明方法修饰后的胱硫醚β-裂解酶，因为酶构象的改变，酶的最适反应PH变化为8.6。这样可以使得在正常的反应条件下，2个酶都达到他们最佳的反应条件。

4、使用本发明修饰后的胱硫醚β-裂解酶因为不会自身之间发生二硫键的反应，所以试剂中不需要加入硫醇类还原剂。试剂中含有多个的酶，硫醇类还原剂可能会和其他酶产生反应，导致试剂盒性能的下降。使用本发明方法修饰的胱硫醚β-裂解酶的同型 半管氨酸试剂盒，可以避免这个问题，使得试剂盒的检测结果更为准确，稳定性更强。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明试剂校准曲线图；

图2为本发明试剂和日本旭化成公司试剂血清相关性图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例涉及一种胱硫醚β-裂解酶的修饰方法，包括如下步骤：

1、胱硫醚β-裂解酶功能性氨基酸链的修饰：将胱硫醚β-裂解酶与N-(1-芘)马来酰亚胺进行连接，胱硫醚β-裂解酶侧链中的-SH基团被马来酰亚胺基团取代。

2、胱硫醚β-裂解酶非功能性氨基酸链的修饰：将步骤1中修饰后的胱硫醚β-裂解酶与弹性蛋白酶进行水解，弹性蛋白酶与非功能性氨基酸链中Lys的C端发生反应，水解去除Lys之后的12个氨基酸。

实施例2

本实施例提供一种含使用本发明方法修饰后的胱硫醚β-裂解酶的检测试剂盒，组成如下：

试剂R1各组分及浓度为：

试剂R2各组分及浓度为：

本实施例描述的HCY检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表1。分析方法：速率法，即试剂R1；R2的用量分别为250μl和25μl，样本量16.5μl；250μl试剂R1加入16.5μl样本于37℃下5min后加入25μlR2，延迟90秒开始读点，读数时间约120秒；检测波长分别主波长340nm，副波长405nm。

采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的HCY标准品的曲线，如图1所示。

表1

实施例3

检测试剂的相关性试验

本实验目的是检测本发明试剂和现有试剂的相关性。

使用本法发明试剂(具体配方同实施例1)和对照试剂A公司的HCY试剂，对50份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数进行测定，对测定值进行相关性分析。测定结果见图2，X，Y轴均为测定值(HCY的含量μmol/L)。分别采用本发明试剂和日本旭化成公司的HCY试剂，对50份人血清(包含正常和异常标本)按各自参数进行测定，对测定值进行相关分析。

由图2的结果看出，两种试剂的相关系为R²＝0.9974，回归方程为y＝0.997x+0.0649。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。

此外，以上实验本试剂是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。

实施例4

准确度试验

本实验目的是检测试剂在测试样本时的准确度。

采用实验例1试剂、对照试剂、标准品、质控品。

操作步骤：测定质控样本10次，计算偏差系数。

表2显示，含使用本发明方法修饰的胱硫醚β-裂解酶的试剂盒，偏差均小于1％。比含未修饰的胱硫醚β-裂解酶的试剂盒的准确度偏差小了很多。同时从表中CV值可以看出试剂的重复性也很好。

表2

实施例5

稳定性试验

本实验目的是检测试剂的稳定性。

采用实验例1试剂、标准品、质控品。

操作步骤：

1.试剂盒在加热(37℃)条件下保存7天后，取出试剂盒测定各质控3次。

2.试剂盒开封后，2～8℃开盖保存，每隔一周测定质控，连续35天。

3.试剂盒在冷藏(2～8℃)条件下，每2个月取出试剂盒测定质控。

表3显示，试剂在加热(37℃)条件下保存7天后，检测的准确度仍然很好。

表4显示，试剂盒开封后，2～8℃开盖保存条件下，一个月内试剂准确度保持良好。

表5显示，试剂盒在冷藏(2～8℃)条件下，保存14个月后，试剂准确度保持良好。

从表3～5中结果可以看出本发明试剂稳定性良好，能长时间保存。适合临床要求。

表3 37℃加热7天的稳定性

表4 开封35天的稳定性

表5 冷藏14个月的稳定性

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特 定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。