蓝靛果忍冬中ACEI活性成分在制备抗高血压药物中的应用

技术领域

本发明涉及天然ACEI活性成分在制备抗高血压药物中的应用，具体涉及蓝靛果忍冬中ACEI活性成分在制备抗高血压药物中的应用。

背景技术

高血压病是当今最常见的心血管疾病之一，常常伴随有脑血管意外〔如脑中风)、心力衰竭、肾功能衰竭、冠心病等并发症，危害性极高。由此可见，抗高血压药物的研制与开发对于提高国民体质、改善生活质量具有十分重要的意义。高血压致病因素及发病机制比较复杂，已知的体内有多个系统参与血压调节。其中，肾素-血管紧张素系统(RAS)和激肽释放酶-激肽系统(KKS)对机体血压的调节起着重要的作用。血浆中血管紧张素原在肾素作用下，生成无活性的血管紧张素I，在血管紧张素转化酶(ACE)作用下转变成血管紧张素II。血管紧张素II可增强心肌的收缩力，并同时使血管平滑肌收缩造成血压上升。另一方面，激肽释放酶-激肽系统也受到ACE的调控，它可使具有血管舒张作用的缓激肽转变为没有活力的缓释肽。两个系统在ACE的协同作用下，造成了人体内血压的升高。因此，如果能有效抑制ACE在体内的活性，就可起到降压的作用。

当前，治疗高血压的药物主要有五种类型：血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor，简称ACEI)、血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)，钙通道阻滞剂(CCB)，β受体阻滞剂和利尿剂。其中，ACEI近年来发展最为迅速，现在应用于临床的ACEI已达20余种，是治疗高血压的一线药物。目前，大多用化学合成的ACE抑制剂来治疗高血压，这类药物虽然降压效果快，但都具有一定甚至较明显的副作用，如咳嗽、血管神经性水肿等，停药后血压回升快，难以达到长期治疗和预防的目的。而天然ACEI安全性高，降压效果温和、专一、持久，无副作用。因此，随着经济的发展，生活水平的提高，人们对ACEI药物的疗效、安全性及耐受性提出了更高的要求，从天然资源中寻找安全性高，毒副作用小的ACEI药物，已成为国内外学者研究的重要课题。

目前，从天然资源中得到的ACEI主要有三大类，源于食物蛋白的肽类物质、有机多酚酸及黄烷醇类物质和生物碱类物质。其中，通过酶解ACE降压肽的报道最为多见，科学研究者们已经从昆虫、动物、植物、奶制品和海洋生物蛋白的酶解物中发现了大量具有ACEI活性的短肽。除ACE抑制肽外，有机多酚酸类和黄烷醇类物质对ACE的抑制活性报道也较多。例如我国20余年前从植物沙棘中提取出的总黄酮化合物-醋柳黄酮，已用于临床，研究表明可降低内皮素，升高NO，抑制ACE的活性和Ang II生成而降压。Actis-Goretta组的实验结果表明，富含黄烷醇的物质，如红酒、白酒、茶和巧克力等对ACE的活性具有抑制作用。Ottaviani等人测得花青素的二聚物、四聚物和六聚物对ACE抑制活性的IC50值分别为97.0、4.4和8.2mM。Loizzo等从中药高樗中发现了6个具有ACE抑制活性的黄酮化合物。高小平等人从丹参水溶性部分提取出具有ACE抑制活性的丹酚酸B。有关生物碱类物质对ACE抑制作用的报道较少，kang等人发现贝母提取物对ACE有抑制作用，其中去氢贝母碱、贝母碱和贝母素为活性成分。

忍冬属是忍冬科的模式属，全世界约200种，我国有98种，广布于各省区。属内有不少药用植物，如金银花是有悠久历史的著名中药，本属植物的花蕾作为金银花中药材商品的约有18种。由于该属植物有多种生理活性且分布广泛，长久以来，忍冬属植物的化学成分和生物活性成为研究的热点之一。研究显示，该属植物中含有大量的黄酮类、有机酸类和环烯醚萜类化合物，还有咖啡酸类物质、皂苷类、香豆素类等。药理活性研究主要集中在抗菌、抗炎及抗病毒等方面。

蓝靛果忍冬(Lonicera edulis Turcz.)是忍冬科(Cap rifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物，落叶灌木。蓝靛果忍冬具有观赏价值，可做观赏树种。蓝靛果具有降压、抗疲劳、保护肝脏、抗菌、抗氧化、抗突变、提高免疫功能、调节血脂等药理作用，可以清热解毒、泻火、化湿热，治疗肠风、赤痢等。目前，国内外对蓝靛果忍冬的化学成分和药理活性研究报道较少，也未见从蓝靛果忍冬寻找活性高、毒副作用小的ACEI活性成分，并进一步开发利用蓝靛果忍冬植物资源，为新型降压药物的研制寻找先导化合物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种蓝靛果忍冬中ACEI活性成分在制备抗高血压药物中的应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，蓝靛果忍冬中ACEI活性成分在制备抗高血压药物中的应用，所述ACEI活性成分为蓝靛果忍冬乙酸乙酯提取物中分离的单体化合物。

进一步，所述单体化合物为E-p-coumaryl hexacosanate、谷甾醇、2，6-dihydroxyhumula-3(12)，7(13)，9(E)-triene、环阿尔廷-25-烯-3β，24ξ-二醇、二十四烷酸或2，4-二羟基-3，5-二甲基苯甲酸甲酯。

进一步，所述单体化合物为2，4-二羟基-3，5-二甲基苯甲酸甲酯。

本发明将蓝靛果忍冬干燥花蕾或全草粉碎后，用95％乙醇回流提取3次，合并提取液，减压回收乙醇，残留物挥尽乙醇后加水稀释；然后分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚提取物，乙酸乙酯提取物，正丁醇提取物。其中，乙酸乙酯提取物经硅胶柱层析、大孔树脂、反相C18等柱层析、制备薄层层析等分离得到单体化合物，即为ACEI活性成分。

本发明蓝靛果忍冬乙酸乙酯萃取物具有较强的ACEI活性，对血管紧张素转化酶(ACE)显示出了非常出色的抑制活性。经活性测试表明，分离的单体化合物2，4-二羟基-3，6-二甲基苯甲酸甲酯显示较强的ACE抑制活性，在100μM/mL浓度时，抑制率为85％。

附图说明

图1为蓝靛果忍冬的提取分离图。其中，a：石油醚∶丙酮＝10∶1～0∶2和丙酮∶甲醇＝1∶2；b：石油醚∶乙酸乙酯＝10∶0.3～1∶2和石油醚∶丙酮＝1∶2；c：氯仿∶石油醚∶甲醇＝4∶4∶1；d：水，35％～95％乙醇；A：石油醚∶丙酮＝3∶2。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步加以说明。

1、仪器与试剂

材料：蓝靛果忍冬采自四川成都西南，由滨洲医学院天然药物研究中心鉴定为忍冬科忍冬属植物蓝靛果忍冬的干燥全草。

试剂：甲醇；三氯甲烷；冰醋酸；无水乙醇；丙酮；乙酸乙酯；石油醚；以上试剂均都是分析纯。

仪器：SIB-III循环水多用途真空泵(郑州长城科工技术有限公司)；

大孔吸附树脂：RE-53A旋转蒸发仪(上海亚荣仪器设备有限责任公司)；层析柱(盐城泓宇玻璃仪器厂)；葡聚糖凝胶(Pharmadex LH-30，瑞典Amersham Pharmacia公司生产LH-30)；常压柱层析硅胶H(70-90目，100-210目，220-350目)；KQ5510D型数控超声清洗机(昆山市超声波仪器公司)；硅胶薄层板(青岛海洋化工有限公司)；电子天平(Metter-Toledo仪器公司)；EL304电子精密天平(梅特勒-托利多仪器公司)；DHG-9742A型电热鼓风干燥箱(上海精宏实验公司)；AB-9(天津市海光化工有限责任公司)；ZF-2型三用紫外分析仪(北京普析通用仪器公司)。

显色剂：10％的稀硫酸的乙醇溶液。

实施例1

1、提取

将蓝靛果忍冬的全草进行粉碎，称取7Kg，先用95％的乙醇在常温下先后提取三次；第一次用溶剂量为10倍于原材料的乙醇，提取时间2小时，第二次用溶剂量为8倍于原材料的乙醇，提取2小时，第三次用溶剂量为6倍于原材料的乙醇，提取1.5小时，然后回收乙醇直到无醇味，得流浸膏500g。

2、分离

将提取所得到的流浸膏500g分散到2L水中，用2L乙酸乙酯萃取三次，得水层物、乙酸乙酯层物。

将乙酸乙酯层浓缩后，得样品150g，用石油醚∶丙酮＝10∶1～0∶2和丙酮∶甲醇＝1∶2作为洗脱剂在硅胶柱层析进行分离(1200g，200-300mesh，φ80mm×L 1300mm)，以2000ml为一流份，再浓缩至青霉素小瓶中，通过TLC监测分析将所得物合并，浓缩得到7个组分A1、A2(15.34g)、A3(20.2g)、A4(33.01g)、A5(28.06g)、A6(24.73g)、A7(6.72g)。

将A3经硅胶柱层析分离(300g，100-150mesh，φ30mm×L700mm)，用石油醚∶乙酸乙酯＝10∶0.3～1∶2和石油醚∶丙酮＝1∶2作为洗脱剂，以400ml为一流份，浓缩装到青霉素的小瓶中，通过TLC分析检测将所得物合并，主要得到八个组分I(2.35g)、II(0.61g)、III(2.3g)、IV(1.23g)、V(8.76g)、VI(1.61g)、VII(0.37g)、VIII(0.41g)。

将组分V经凝胶柱层析分离，用氯仿∶石油醚∶甲醇＝4∶4∶1洗脱，每管接收15ml，通过TLC分析将所得物合并，主要得到九个组分。

再经过凝胶柱层析进一步分离，用氯仿∶石油醚∶甲醇＝4∶4∶1洗脱，每管接收15ml，通过TLC分析将所得产物合并，最后得到6个单体化合物。

3、分离到的化合物

分离到6个化合物分别为：E-p-coumaryl hexacosanate(1)、谷甾醇(2)、2，6-dihydroxyhumula-3(12)，7(13)，9(E)-triene(3)、环阿尔廷-25-烯-3β，24ξ-二醇(4)、二十四烷酸(5)、2，4-二羟基-3，5-二甲基苯甲酸甲酯(6)。

4、成分的生物活性

将5～10mM的底物马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)和ACE于37℃的水浴中反应30min，用1M的盐酸终止反应，接着用乙酸乙酯萃取反应生成的马尿酸，把乙酸乙酯蒸干后，溶于水中，再用分光光度计于228nm处测定产品马尿酸的吸光度值。对于每一个样品都设立空白对照、阴性对照和阳性对照。假设字母N、S、B分别代表阴性对照的吸光度值，测定样品的吸光度值和空白对照的吸光度，那么，

样品ACE抑制率％＝100％(N-S)/(N-B)

经活性测试表明：化合物6，即2，4-二羟基-3，5-二甲基苯甲酸甲酯显示较强的ACE抑制活性在100μM/mL浓度时，抑制率为85％。