一种常见眼内感染病毒多重实时荧光PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种眼内病毒多重PCR检测技术。

背景技术

眼内病毒感染性疾病是常见的眼科疾病，如未得到及时诊治，可对眼组织造成严重损伤，甚至失明；而若能够及早诊断，并施以有效的治疗，多数是能够治愈的。

眼内病毒感染最常见的病原体主要是人类疱疹病毒(Human herpes virus，HHV)家族。人类疱疹病毒可分为8型，HHV1～8型分别为单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplexvirus，HSV-Ⅰ)、单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)、水痘-带状疱疹病毒(varicella-herpeszoster virus，VZV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人类巨细胞病毒(cytomegalovirusretinitis，CMV)、人类疱疹病毒6型(HHV-6)、人类疱疹病毒7型(HHV-7)和人类疱疹病毒8型(HHV-8)。其中最常引起眼内病毒感染的是HSVⅠ及Ⅱ型、VZV、CMV及EBV。

眼内病毒感染可以引起从眼前段到眼后段的炎症。由于眼内病毒感染可以造成视功能的巨大损害，因此及时早期的抗病毒治疗是关键的一步。而目前国内对于眼内病毒感染性疾病主要是医生依靠患者病史及临床表现做出诊断，在缺乏明确的实验室病原学诊断依据的情况下对部分患者采用经验性的抗病毒治疗。然而即使出现了典型的临床表现，也不能百分之百明确诊断。事实上，具有典型临床表现的眼内病毒感染性疾病并不多见，而具有不典型临床表现的患者大有人在，因此临床医生在诊断时常常感到棘手。如果在未明确病因之前，盲目地单纯使用糖皮质激素或免疫抑制剂可能造成感染扩散、耽误病情。当前中国已经进入了精准医疗计划的时代，我国眼内病毒感染性疾病的诊断和治疗不能再局限于病人的主诉和临床症状体征，实现对眼内病毒感染性疾病的病原学诊断尤为重要。通过对眼内液病毒的检测最终实现眼内病毒感染性疾病的诊断、治疗效果评价及指导用药。

当前国内眼内病毒感染性眼病眼内液检测主要采用的是商品化的PCR检测试剂盒，已有的试剂盒每次只能检测一种到三种疱疹病毒。而且传统的荧光PCR检测，都是以病毒DNA为样本进行定性检测，不能对病毒进行定量分析，而病毒的数量对治疗方案的确定有极大帮助。对DNA进行定性检测，则需要较大量的组织标本来提取足够量的病毒DNA，否则会因为DNA获取量太少而造成假阴性的结果，而从眼部器官获取较大量的组织样本有不小的挑战。

在不同的眼部组织中，病毒感染的种类又往往有很大差异，具体到眼内液体(前房水和玻璃体)感染，最常见的病毒类型为HSV1、HSV2、VZV、CMV和EBV五种。本发明提出一种新型的多重荧光PCR病毒检测技术，直接以标本组织液为PCR模板，在一个反应管里对5种常见眼部感染病毒进行定性检测，并同时进行病毒进行定量分析，弥补当前检测技术的不足，是一种非常有应用前景的快速诊断方法。

发明内容

本发明的目的在于公开一种眼内病毒多重PCR检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种常见眼内感染病毒多重实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒含有可以同时检测HSV1、HSV2、VZV、CMV和EBV病毒的引物和探针。

优选的，检测HSV1的引物是：

正向引物：5’-CCCTCCGGCTCCCGCTCG-3’(SEQ ID NO：1)；

反向引物：5’-GAGGCGCCCAAGCGTCCG-3’(SEQ ID NO：2)；

探针序列是：5’-TTCGTCCTCGTCCTCCCCCTCCT-3’(SEQ ID NO：3)。

优选的，检测HSV2的引物是：

正向引物：5’-GGTCTCGCGCGCGACCTC-3’(SEQ ID NO：4)；

反向引物：5’-TCGACAAGGAGGCGCCCAAG-3’(SEQ ID NO：5)；

探针序列是：5’-TCCCCGTCCTCGTCCCCGTC-3’(SEQ ID NO：6)。

优选的，检测VZV的引物是：

正向引物：5’-CGACAGACTGGGTTTTGGGTGG-3’(SEQ ID NO：7)；

反向引物：5’-CCGTGGGCACTGTCACAGTCTT-3’(SEQ ID NO：8)；

探针序列是：5’-CTGCCAACAACCCCCCATTATTACGAGT-3’(SEQ ID NO：9)。

优选的，检测CMV的引物是：

正向引物：5’-GGAGATGTGGTGGGGGTCAATAC-3’(SEQ ID NO：10)；

反向引物：5’-TCCAGGTCTTCATTGATGGGCTT-3’(SEQ ID NO：11)；

探针序列是：5’-TCGCTTTGAACGTAATATCGTCTGCACCTC-3’(SEQ ID NO：12)。

优选的，检测EBV的引物是：

正向引物：5’-CCCTCTGGACTTCCATGTCTACG-3’(SEQ ID NO：13)；

反向引物：5’-ACCACATACCCCTGTTTATCCGA-3’(SEQ ID NO：14)；

探针序列是：5’-TACACGCACGAGAAATGCGCCGT-3’(SEQ ID NO：15)。

进一步优选的，检测探针的荧光基团是FAM、VIC、TAMRA、ROX、CY5中的至少一种。

进一步优选的，检测探针的淬灭基团是BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一种。

本发明的有益效果是：本发明涉及的多重PCR检测试剂盒可以用一个反应同时对5种常见眼部感染病毒进行定量分析，弥补当前检测技术的不足。另一方面，该检测试剂盒可以直接应用于组织液中，这样也大大提高了检测效率。

附图说明

图1本发明申请的5重PCR体系检测5种病毒组织混合样本。

图2本发明申请的5重PCR体系检测5种病毒DNA混合样本。

图3对照组，现有技术检测5种病毒组织混合样本。

图4对照组，现有技术检测5种病毒DNA混合样本。

具体实施方式

实施例一：

根据HHV各型基因组特点，设计特异性探针引物组合，发明引物探针组见表1：

表1发明引物探针组

实施例二

用5重PCR体系分别检测单种类病毒组织及标准品质粒和5种病毒组织混合样品。样品种类如表2：

表2 5重PCR体系所加样品种类

结果：5重PCR体系分别检测HSV1、HSV2、VZV、CMV、EBV单病毒组织和与之对应的阳性对照质粒，每一种病毒组织与对应的阳性质粒都只有一种荧光通道信号具有典型实时扩增曲线，显示HSV1、HSV2、VZV、CMV、EBV单病毒组织和与之对应的阳性对照质粒都只能唯一检测，特异性符合要求。进一步，用5重PCR检测5种病毒组织混合样本扩增曲线，各病毒扩增曲线正常，无模板ddH₂O无明显扩增曲线。

实施例三：

对5种单病毒组织样本分别提取DNA，在同一个反应板中同时检测单病毒组织样本与单病毒DNA样本，检测本发明的灵敏度与高效性。使用病毒DNA提取试剂盒提取5种单病毒组织DNA，其浓度分别为HSV1 0.05ng/uL；HSV2 0.12ng/uL；VZV 0.29ng/uL，CMV 0.05ng/uL，EBV 0.106ng/uL。对五种单病毒组织及5种单病毒DNA分别检测，结果表明不管是病毒组织样本，还是病毒DNA样本，均能有很高的扩增效率，从扩增曲线Ct值判断，即使病毒DNA低至0.05ng/uL，依然能得到稳定扩增，显示本发明不管是检测病毒样本还是病毒DNA样本，均有很高的灵敏性。

实施例四：病毒定量

从第三方平台购买已知拷贝数浓度的标准病毒株样本，各病毒样本拷贝数浓度见表3。

表3病毒标准株拷贝数浓度

对5种病毒阳性对照质粒混合，使各个病毒质粒终浓度均为10⁵copie/uL,然后进行系列梯度稀释为10⁴copies/uL；10³copies/uL；10²copies/uL；10copies/uL。在同一反应板，使用5重PCR分别检测5种标准病毒株混合样本与5种阳性对照病毒质粒混合系列浓度样本，计算平均Ct值，制作标准曲线，计算各病毒真实拷贝数。结果如表4～6所示。表4是各病毒标准品质粒系列浓度平均Ct值；表5是各病毒质粒标准曲线线性方程；表6是各病毒标准株Ct值及根据标准曲线计算的起始拷贝数。

表4 5种病毒标准品质粒系列浓度平均Ct值

表5 5种病毒标准曲线线性方程

表6标准病毒株Ct值及起始拷贝数

根据标准扩增曲线，当质粒浓度为10copies/uL时，依然能成功扩增，说明5种病毒扩增效率可以检测低至20copies的病毒量；而对5种病毒标准株用标准曲线进行拷贝数计算，在误差范围内，拷贝数与购买的病毒拷贝数浓度相一致，显示本发明能对样本病毒数进行定量，计算样本病毒体量。

实施例5：本试剂盒采用的引物探针组(发明引物探针组)对组织样本、病毒DNA的检测效果与已公布的检测HSV1、HSV2、VZV、CMV、EBV 5种病毒的引物探针(对照引物探针阻)做比较。

1、样品1：HSV1、HSV2、VZV、CMV、EBV 5种病毒组织混合物

样品2：从样品1中提取DNA，即含有5种病毒DNA的混合物。

2、分别用对照组和本发明的技术方案检测样品1和样品2，检测结果如表7以及图1～4所示：

表7检测得到的Ct值

结论：

由图1与图2可得：本试剂盒在检测方面，组织样本和DNA样本的5重检测均能够很好的且特异性的检出。

图1和图3对比，图2与图4对比可得：已公布的引物探针组进行5重检测HSV1、HSV2、VZV、CMV、EBV病毒DNA样本时，灵敏度与特异性均低于本发明的设计引物探针组，检测效率较差；且不具有直接检测组织样本的功能。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州基迪奥生物科技有限公司

<120> 一种常见眼内感染病毒多重实时荧光PCR检测试剂盒

<130>

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccctccggct cccgctcg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaggcgccca agcgtccg 18

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcgtcctcg tcctccccct cct 23

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtctcgcgc gcgacctc 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcgacaagga ggcgcccaag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tccccgtcct cgtccccgtc 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgacagactg ggttttgggt gg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgtgggcac tgtcacagtc tt 22

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctgccaacaa ccccccatta ttacgagt 28

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggagatgtgg tgggggtcaa tac 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tccaggtctt cattgatggg ctt 23

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcgctttgaa cgtaatatcg tctgcacctc 30

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccctctggac ttccatgtct acg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

accacatacc cctgtttatc cga 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tacacgcacg agaaatgcgc cgt 23