一种抑制杜氏盐藻养殖过程中杂藻污染的方法

技术领域

本发明涉及一种抑制杜氏盐藻养殖过程中杂藻污染的方法，特别适用于杜氏盐藻养殖企业在养殖过程中杂藻的污染控制。

背景技术

杜氏盐藻（Dunalselal salana），是一种嗜盐的单细胞真核藻类，是到现在为止发现最耐盐和嗜盐的真核单细胞生物之一，从属绿藻门,真绿藻纲,团藻目，盐藻科,杜氏盐藻没有细胞壁，细胞表面带有正电荷，是杜氏藻中具有代表性的藻种。杜氏盐藻在特定的生长环境中，可产生大量类胡萝卜素，其中β-胡萝卜素含量最高，可占其干重的14%。β-胡萝卜素属四萜类化合物,是一种重要的天然食用色素,广泛地存在于植物、藻类和真菌中,是全部类胡萝卜素中含量最大和研究的最多的一种。β-胡萝卜素具有很强的清除氧自由基的功能，能防治癌症、肿瘤和心血管疾病以及老年性痴呆和白内障等与年龄有关的退化性疾病，是一种重要的保健品，而且是维生素A的前体和食品加工业的天然色素。目前从盐藻中提取出来的胡萝卜素已经制成多种应用于抗辐射、保护视力、缓解眼疲劳的营养物质。因此，杜氏盐藻具有很高的市场价值，养殖杜氏盐藻的企业也越来越多。

杜氏盐藻在在户外大规模养殖过程中，由于养殖条件较为粗犷、企业多藻种养殖等因素的影响，杜氏盐藻很容易受到杂藻的污染。而这种污染一方面会与杜氏盐藻在生长过程中竞争培养基，更不利于杜氏盐藻的生物量的积累，降低藻液中β-胡萝卜素的含量，这会直接影响杜氏盐藻藻粉的质量，降低企业效益，不利于企业长远发展。而传统的抑制杜氏盐藻养殖过程中杂藻污染的方法是增加培养基盐度（NaCl），使跑道池中藻液盐度达到17波美以上，但盐度过高会影响杜氏盐藻生物量的积累，并且会使养殖成本大大增加。因此，企业迫切需要找到一种效果更好、养殖成本较低的抑制杜氏盐藻养殖过程中杂藻污染的方法。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的问题，降低养殖成本，提高产品质量，本发明提供了一种抑制杜氏盐藻养殖过程中杂藻污染的方法，包括以下四个部分:

第一部分：确定杜氏盐藻养殖过程中污染杂藻的种类；具体为:

利用普通光学显微镜和荧光倒置显微镜对生长到对数期的被杂藻污染的杜氏盐藻进行取样、制片和观察，并拍照记录藻液中杂藻的形态结构特征，同时参照《淡水微型生物图谱》、《微藻生物技术》和《中国淡水藻类》等相关书籍对污染藻种进行分类鉴定；

第二部分：确定生长到稳定期的杜氏盐藻藻液中各种污染杂藻的细胞数并计算其与藻液中细胞总数和杜氏盐藻细胞数之比；具体操作步骤为:

①确定单位体积藻液中藻细胞总数a与杜氏盐藻细胞数b；

②计算单位体积藻液中污染杂藻的细胞数c，计算公式为：

c = a – b

③计算单位体积藻液中污染杂藻细胞的比例K1，计算公式为：

K1 = c / a ×100%

④计算单位体积藻液中污染杂藻细胞数与杜氏盐藻细胞数之比K2，计算公式为：

K2 = c / b

第三部分：确定不同Mg²⁺浓度的培养基条件下单位体积藻液中污染杂藻细胞所占比例；具体步骤为：

①配制杜氏盐藻培养基：配置具有Mg²⁺浓度梯度的培养液，并将配好的培养基置于容器中；

②接种：在每个容器中接入被杂藻污染的杜氏盐藻藻液，摇匀后测定β-胡萝卜素含量与单位体积藻液中污染杂藻细胞的细胞数，并计算单位体积藻液中污染杂藻细胞所占的比例K1与单位体积藻液中污染杂藻细胞数与杜氏盐藻细胞数之比K2；

③培养：对接入了被杂藻污染的杜氏盐藻藻液的杜氏盐藻进行培养；

④单位体积藻液中污染杂藻的细胞数：在容器中的藻液培养过程中，每天固定时间（与接种时间保持一致）对每个容器中的藻液进行取样并测定β-胡萝卜素含量与单位体积藻液中污染杂藻细胞的细胞数，并计算单位体积藻液中污染杂藻细胞所占的比例K1与单位体积藻液中污染杂藻细胞数与杜氏盐藻细胞数之比K2，直到藻细胞生长到稳定期为止；

第四部分：对第三部分得到的结果进行对比分析，找出培养基所用最佳Mg²⁺浓度。

作为进一步优选的技术方案，所述第二部分的步骤①中，确定单位体积藻液中藻细胞总数与杜氏盐藻细胞数是使用血球计数板的方式对企业内长到稳定期的随机五个跑道池中养殖的杜氏盐藻藻液进行计数，计数结果取平均值，可对企业养殖杜氏盐藻的污染情况有进一步把握。确定长到稳定期的单位体积藻液中藻细胞总数a与杜氏盐藻细胞数b，能把企业养殖杜氏盐藻的污染情况用数据表示出来，有利于后续工作的开展。

作为进一步优选的技术方案，所述第二部分的步骤②，杜氏盐藻藻液中污染杂藻种类多，细胞形态较杜氏盐藻细胞差距大，因此计算单位体积藻液中污染杂藻的细胞数更加简单并能直接反映问题。

作为进一步优选的技术方案，所述第三部分的步骤①中，将培养基中Mg²⁺浓度（MgSO₄·7H₂O）设置成0，1，2，3，4，5mmol/L六个梯度，每个梯度三个平行，且培养基中其他成分与企业所用盐藻养殖培养基成分浓度保持一致，并将配好的培养基置于25升的容器中，每个容器装10升培养基。分梯度配置培养基，既能把企业养殖杜氏盐藻所用培养基中镁离子的浓度包括进去，又可对不同Mg²⁺浓度梯度的培养实验进行对比分析，以使实验结果更理想。同时，对处于每个Mg²⁺浓度梯度的培养基设置三个平行梯度，能让实验结果更加准确。另外，除了Mg²⁺浓度，培养基中其他成分与企业所用盐藻养殖培养基成分浓度保持一致，可保证单一变量的原则，并能确保实验结果的准确性。

进一步，所述第三部分中所述容器为透明塑料桶。使用透明塑料桶，可以方便人们观察和记录数据，同时透明塑料桶可以最大限度的保证试验样品与跑道池中的藻液接受相同的光照。

作为进一步优选的技术方案，所述第三部分的步骤②，每个容器中接入被杂藻污染的杜氏盐藻藻液1L。这可在不影响杜氏盐藻正常生长的前提下，使接种藻液镁离子浓度对整个培养基中镁离子浓度的影响降到最低。接种摇匀后测定β-胡萝卜素含量与单位体积藻液中污染杂藻细胞的细胞数，可对实验初始藻液的污染程度有一定把握并提供具体的数据，为后续实验数据提供对比。接种摇匀后计算单位体积藻液中污染杂藻细胞所占的比例K1与单位体积藻液中污染杂藻细胞数与杜氏盐藻细胞数之比K2，既能对实验初始藻液的污染程度有进一步把握，又可对实验结果提供更正确的理论与数据依据。

作为进一步优选的技术方案，所述第三部分中的培养方式为将接种后的容器放入养殖盐藻的跑道池中，并用绳子固定，每隔一个小时手摇一次。由于企业养殖杜氏盐藻的光照强，温度高，水的比热容较大，直接将大塑料桶置于光照下，会使大塑料桶内藻液温度急剧升高，藻细胞很快会死亡，将接种后的透明塑料桶放入养殖盐藻的跑道池中，并用绳子固定，可利用跑道池藻液表面积大散热快的特点，既能保证大塑料桶内藻液温度恒定，又能保证与跑道池内藻液温度保持一致，并且接受的光照强度也一致，确保了单一变量的原则。培养过程汇中，对大塑料桶内藻液每隔一个小时手摇一次，能保证藻液中藻细胞充分接受光照，提高藻细胞的光和效率。

本发明技术效果显著，主要体现在：

杜氏盐藻在培养基中镁离子缺乏时，会启用上述污染杂藻没有的光和系统备用保护机制，即合成β-胡萝卜素，因此，降低培养基中镁离子浓度会抑制藻液中杂藻的生长，但对杜氏盐藻的生长影响较小，而且镁离子缺乏会诱导杜氏盐藻细胞积累β-胡萝卜素。本发明所述方法与现有高盐度抑制杜氏盐藻养殖过程中杂藻污染的方法相比，成本低，效果明显，操作程序简单，并可诱导杜氏盐藻细胞积累β-胡萝卜素，可谓一举两得。用该方法处理，对杜氏盐藻生物量几乎没有影响，因此藻粉产量恒定，并且使藻粉质量提高，企业经济效益增长明显，对于杜氏盐藻养殖业的发展意义重大。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，便于更好的理解本发明，但不用于限制本发明。本实施例中所涉及的实验技术为本领域技术人员所熟知的常用技术，实验材料和试剂，如未特别说明，均为市售商品。

本发明提供了一种抑制杜氏盐藻养殖过程中杂藻污染的方法，包括以下四个部分:

第一部分：确定杜氏盐藻养殖过程中污染杂藻的种类；具体为:

利用普通光学显微镜和荧光倒置显微镜对生长到对数期的被杂藻污染的杜氏盐藻进行取样、制片和观察，并拍照记录藻液中杂藻的形态结构特征，同时参照《淡水微型生物图谱》、《微藻生物技术》和《中国淡水藻类》等相关书籍对污染藻种进行分类鉴定；

第二部分：确定生长到稳定期的杜氏盐藻藻液中各种污染杂藻的细胞数并计算其与藻液中细胞总数和杜氏盐藻细胞数之比；具体操作步骤为：

①用血球计数板对企业内长到稳定期的随机五个跑道池中养殖的杜氏盐藻藻液进行计数，计数结果取平均值，确定单位体积藻液中藻细胞总数a与杜氏盐藻细胞数b和藻液中β胡萝卜素含量；

②计算单位体积藻液中污染杂藻的细胞数c，计算公式为：

c = a – b

③计算单位体积藻液中污染杂藻细胞的比例K1，计算公式为：

K1 = c / a ×100%

④计算单位体积藻液中污染杂藻细胞数与杜氏盐藻细胞数之比K2，计算公式为：

K2 = c / b

第三部分：确定不同Mg²⁺浓度的培养基条件下单位体积藻液中污染杂藻细胞所占比例；具体步骤为：

①配制杜氏盐藻培养基：将培养基中Mg²⁺浓度（MgSO₄·7H₂O）设置成0，1，2，3，4，5mmol/L六个梯度，每个梯度三个平行，培养基中其他成分与企业所用盐藻养殖培养基成分浓度保持一致，将配好的培养基置于25升透明塑料桶中，每个透明塑料桶装10升培养基；

②接种：每个透明塑料桶接入被杂藻污染的杜氏盐藻藻液1L，摇匀后测定β-胡萝卜素含量与单位体积藻液中污染杂藻细胞的细胞数，并计算单位体积藻液中污染杂藻细胞所占的比例K1与单位体积藻液中污染杂藻细胞数与杜氏盐藻细胞数之比K2；

③培养：将接种后的透明塑料桶放入养殖盐藻的跑道池中，并用绳子固定，每隔一个小时手摇一次；

④单位体积藻液中污染杂藻的细胞数：在透明塑料桶中的藻液培养过程中，每天固定时间（与接种时间保持一致）对每个透明塑料桶中的藻液进行取样并测定β-胡萝卜素含量与单位体积藻液中污染杂藻细胞的细胞数，并计算单位体积藻液中污染杂藻细胞所占的比例K1与单位体积藻液中污染杂藻细胞数与杜氏盐藻细胞数之比K2，直到藻细胞生长到稳定期为止;

第四部分：对第三部分得到的结果进行对比分析，找出培养基所用最佳Mg²⁺浓度。

其中第一部分，确定杜氏盐藻养殖过程中污染杂藻的种类为微小杜氏藻（绿藻门）、小球藻（绿藻门）、拟微球藻（绿藻门）、盐生隐杆藻（蓝藻门）。

其中第二部分的步骤①具体为：用血球计数板对企业跑道池中生长到稳定期的杜氏盐藻藻液中细胞总数和杜氏盐藻细胞数进行计数，分别为85× 10⁴个/ml、64.5>4个/ml。用有机溶剂萃取法对藻液中β-胡萝卜素进行萃取，并用分光光度计在波长450nm处测定吸光度OD₄₅₀,然后利用公式计算藻液中β-胡萝卜素含量为6.9>

其中第二部分的步骤②得到单位体积藻液中污染杂藻的细胞数c=20.5× 10⁴个/ml。

其中第二部分的步骤③得到单位体积藻液中污染杂藻细胞的比例K1=24.1%。

其中第二部分的步骤④得到单位体积藻液中污染杂藻细胞数与杜氏盐藻细胞数之比K2=0.318。

附表7给出了实施例1-实施例6的实验结果对比汇总，具体的各实施例的技术方案如下：

实施例1：杜氏盐藻培养基中Mg²⁺浓度为0>

实验材料及设备：透明塑料桶，血球计数板、移液管、洗耳球、分光光度计

实验条件：自然条件

实验结果如附表1所示：

附表1

实施例2：杜氏盐藻培养基中Mg²⁺浓度为1>

实验材料及设备：透明塑料桶，血球计数板、移液管、洗耳球、分光光度计

实验条件：自然条件

实验结果如附表2所示：

附表2

实施例3：杜氏盐藻培养基中Mg²⁺浓度为2>

实验材料及设备：透明塑料桶，血球计数板、移液管、洗耳球、分光光度计

实验条件：自然条件

实验结果如附表3所示：

附表3

实施例4：杜氏盐藻培养基中Mg²⁺浓度为3>

实验材料及设备：透明塑料桶，血球计数板、移液管、洗耳球、分光光度计

实验条件：自然条件

实验结果如附表4所示：

附表4

实施例5：杜氏盐藻培养基中Mg²⁺浓度为4>

实验材料及设备：透明塑料桶，血球计数板、移液管、洗耳球、分光光度计

实验条件：自然条件

实验结果如附表5所示：

附表5

实施例6：杜氏盐藻培养基中Mg²⁺浓度为5>

实验材料及设备：透明塑料桶，血球计数板、移液管、洗耳球、分光光度计

实验条件：自然条件

实验结果如附表6所示：

附表6

对上述实例进行对比分析，对比结果如附表1所示。结果表明，当培养基中Mg²⁺浓度为2mmol/L时，可使杜氏盐藻藻液中污染杂藻比例降低50%以上，杜氏盐藻生物量的增加影响很小，相对增加了β-胡萝卜素的积累量；

附表7为稳定期杜氏盐藻藻液中各项生长指标对比分析表：

附表7