一种遗传性白质脑病基因芯片及其应用

技术领域

本发明属于遗传病检测领域，特别涉及遗传性白质脑病的检测，特别是一种遗传性白质脑病基因芯片及其应用。

背景技术

遗传性白质脑病又称脑白质营养不良，是指一组主要累及中枢神经系统白质的进展性遗传性疾病，其基本特点为中枢白质的髓鞘发育异常或弥漫性变性。脑白质病变的临床特征主要包括视听损害(长传导束受累)、运动障碍、锥体束征阳性、智力运动发育迟滞或倒退，惊厥少见或在病程晚期出现。

虽然这些疾病目前缺乏根治性治疗，大多数最终会致残，甚至导致早期死亡，但是由于分子遗传学诊断的建立，目前绝大多数此类疾病可以预知，即孕早期做产前诊断，从而可以选择是否继续妊娠。因此，对于此类疾病，目前的重点首先是明确诊断，为进一步的准确遗传咨询以及产前诊断打基础。

随着高通量测序技术的发展与成熟，人类全基因组测序已经成为遗传相关致病基因突变研究和诊断的重要工具。通过全基因组测序对被测样本进行全基因组扫描，可实现对基因突变零遗漏，从而成为遗传代谢病相关致病基因突变研究和诊断的有效工具。

由于人类基因组的大小约为3Gb，对其进行全基因组测序总计约需90Gb测序数据。巨大的数据量要求所致高昂的测序成本，导致全基因组测序应用遗传代谢病的基因诊断收到限制。全基因组测序需要产生大量的测序数据量，测序成本高，因此测序深度不大可能太深。对于检查基因突变而言，想要实现突变检查的零遗漏，全基因组测序确实难以担当此任。特别是对于，一次检测数百个基因上发生的所有突变，高深度测序才能实现对突变检测的准确性。

因此，开发一款价格低廉的，准确性高的基因突变检查产品，特别是对于遗传性白质脑病基因突变的诊断产品，具有重要的意义。

发明内容

本发明人经过对大量临床病人的基因组数据进行分析，提供了一组基因探针，通过包括这些基因探针的基因芯片，实现对遗传性白质脑病的基因检测。

因此，在第一方面，本发明提供了一种遗传性白质脑病基因芯片，所述基因芯片包括针对如下基因的探针：MCCC1、AMACR、PEX1、GALC、GCDH、PANK2、PLA2G6、ARSA和ABCD1。

MCCC1突变位点为：c.980G>A和c.288+2T>A；AMACR突变位点为：c.446T>A；PEX1突变位点为：c.2245+1G>T和c.357+1G>T；GALC突变位点为：c.392C>A和c.136G>T；GCDH突变位点为：c.148T>C、c.169G>A、c.395G>A、c.533G>A和c.892G>A；PANK2突变位点为：c.260A>G和c.629T>A；PLA2G6突变位点为：c.2208T>G、c.2071C>T、c.1736C>A、c.1609C>T、c.1265+1G>A、c.1117G>A、c.991G>T和c.668C>A；ARSA突变位点为：c.1108-3C>G；ABCD1突变位点为：c.488G>C、c.521A>G、c.796G>A、c.869C>G、c.1390C>T、c.1823G>A、c.1865+1G>A和c.1979G>A。

在一个实施方案中，检测这些突变位点的探针包括SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.32、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.50、SEQ IDNO.53、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ IDNO.68、SEQ ID NO.70和SEQ ID NO.73。

在一个实施方案中，检测这些突变位点的探针分别包括选自如下各组的1-3个探针：SEQ ID NO.1-3、SEQ ID NO.4-5、SEQ ID NO.6-8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10-12、SEQID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.17-19、SEQ ID NO.20-22、SEQ ID NO.23-24、SEQ ID NO.25-27、SEQ ID NO.28-30、SEQ ID NO.31-33、SEQ ID NO.34-36、SEQ ID NO.37-39、SEQ ID NO.40-42、SEQ ID NO.43-45、SEQ ID NO.46-48、SEQ IDNO.49-51、SEQ ID NO.52-54、SEQ ID NO.55-57、SEQ ID NO.58-59、SEQ ID NO.60-62、SEQID NO.61-63、SEQ ID NO.64-66、SEQ ID NO.66-67、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69-71和SEQID NO.72-74。在优选的实施方案中，检测这些突变位点的探针分别还包括这样的探针，即上述探针的位点被突变碱基替换的探针。

在一个实施方案中，所述基因芯片包括针对如下基因的探针：ABAT、ABAT、ABCD1、ACOX1、ALDH3A2、AMACR、ARSA、AUH、CYP27A1、DDC、DLD、ERCC6、ERCC8、ETHE1、FOLR1、GALC、GCDH、L2HGDH、MCCC1、PANK2、PC、PEX1、PEX7、PHYH、PLA2G6、PLP1、PSAP、SLC16A2、SLC17A5和TRAPPC9。

在一个实施方案中，所述基因芯片包括针对表1中列出的基因的探针。

在第二方面，本发明提供了一种利用基因芯片筛查受试者基因突变的方法，所述方法包括：

1)提取所述受试者的基因组DNA，或者提取所述受试者的RNA，反转录成cDNA；

2)将所述DNA或cDNA打断至200-300bp的范围；

3)对上述打碎的基因组DNA进行DNA小片段文库的制备；

4)将DNA小片段文库和本发明第一方面的基因芯片进行杂交，检测基因突变。

在一个实施方案中，在步骤2)中采用Illumina TruSeq DNA librarypreparation试剂盒，进行DNA小片段文库的制备。

在第三方面中，本发明还提供了本发明第一方面的基因芯片用于检测遗传性白质脑病的用途。

本发明的方法和基因芯片至少有如下优点：

相对于全基因组测序，大大节约了所需要的测序数据量；

一次性检测疾病相关致病基因的大多数突变，平衡了性价比，为疾病的治疗和干预提供保障。

具体实施方式

通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。

基因芯片是近几年在高科技领域出现的重大科技进展之一，其主要原理是将能反应样本中大量基因信息的基因探针以一定顺序和密度固定在载体上形成阵列，与实际样本进行杂交反应，通过杂交信号分析可高通量获得所有待检基因的信息。该技术以其高通量、快速、准确性高等优点为癫痫遗传学诊断提供一条新的解决途径，对患儿的临床治疗、预后评估具有重要作用。

在本发明中，人类参考基因组是HG19。

在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。例如，突变(c.980G>A；p.R327H)中，c表示cDNA，p表示蛋白质，DNA水平的突变对应蛋白质水平的突变。突变(c.2245+1G>T；splicing)中，c.2245+1G>T表示c.2245后面是内含子，+1表示该内含子的第1位，这位的G突变为T；splicing表示剪接错误。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及基因序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如提及一条探针序列，实际上包括该序列以及其互补序列。例如，提及SEQ ID NO:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及一条探针序列，实际也包括相应的RNA序列。

发明人近几年在临床研究中积累了近2000例遗传性白质脑病例的外显子组序列得测序数据，原始测序片段(reads)由Illumina basecalling Software 1.7进行处理，经过过滤去污染、使用SOAPaligner 2.20(Li R,Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP:shortoligonucleotide alignment program.Bioinformatics 2008,24(5):713-714；Li R,YuC,Li Y,et al,SOAP2:an improved ultrafast tool for short readalignment.Bioinformatics 2009,25(15):1966-1967)比对参考基因组，获得比对到基因组上的唯一匹配测序片段。靶区域的基因型由SOAPsnp(Li R,Li Y,Fang X,Yang H,et al,SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res2009,19(6):1124-1132)确定。随后，对结果通过四个公共数据库(dbSNP(v131):http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp131.txt.gz.；1000人：ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp或ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp；hapmap:ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap；以及YH数据库:http://yh.genomics.org.cn)进行过滤，去掉所有已知与遗传性白质脑病无关的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。

结果发现，遗传性白质脑病例与如下表1中列出的基因的有关：

根据表1中列出的基因设计针对这些基因的检测探针，通过包括所述探针的基因芯片可以检测97％的遗传性白质脑病例。

为了简化本发明的基因芯片，综合考虑探针成本和检出率的性价比对所述基因芯片包括的探针进行优化，所述基因芯片包括针对如下基因的探针可以检测86％的遗传性白质脑病例：ABAT、ABCD1、ACOX1、ALDH3A2、AMACR、ARSA、AUH、CYP27A1、DDC、DLD、ERCC6、ERCC8、ETHE1、FOLR1、GALC、GCDH、L2HGDH、MCCC1、PANK2、PC、PEX1、PEX7、PHYH、PLA2G6、PLP1、PSAP、SLC16A2、SLC17A5和TRAPPC9。

为了简化本发明的基因芯片，进一步考虑探针成本和检出率的性价比对所述基因芯片包括的探针进行优化，所述基因芯片包括针对如下基因的探针可以检测71％的遗传性白质脑病例：MCCC1、AMACR、PEX1、GALC、GCDH、PANK2、PLA2G6、ARSA和ABCD1。

所述基因的突变位点1-31及其在染色体上的位置如下表2中所示。

突变1-31对应的探针列对应染色体上的位置表如下表3中所示：

在本实施例中，针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为120bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3。对于所述探针序列的长度，大于120bp会带来合成上的困难，小于110bp一是其捕获能力降低，二是会增加探针数量，从而增加成本，二者平衡非常重要，发明人经过不断试验，得到了120bp的较优值。对于所述探针在每两个相邻的探针序列之间的重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3，这是因为会对每一个区域都形成2层或者3层的探针覆盖，因此探针覆盖均匀，进而不影响捕获的均一性，而探针覆盖不均匀会影响到捕获的均一性。因此，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3。在所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2的情况下，优选探针长度是偶数；在所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的2/3的情况下，优选探针长度是3的整倍数。但是，在探针长度不是偶数或3的整倍数的情况下，所述重叠取所述探针长度1/2或2/3的近似整数也是可以的，虽然其效果不如探针长度是偶数或3的整倍数的情况。

将针对所述基因的探针和探针SEQ ID NO.1-74通过商业基因芯片公司制备基因芯片，每个探针序列进行三次重复。检测表2中所示突变位点的探针分别还包括这样的探针，即上述探针的位点被突变碱基替换的探针。

实施例

以Affymetrix HG U133A芯片平台各检测了648名患者和700正常对照样本的基因表达对本发明的基因芯片进行测试。基因芯片设计和测试由艾吉泰康(北京)生物技术有限公司进行。

第1步：RNA的抽提。

按照制造商提供的说明书，使用QIAGEN’s RNeasy Total RNA Isolation kit抽提800名患者和800正常人外周静脉血的总RNA；使用QIAGEN’s Oligotex Direct mRNA kit从总RNA中抽提mRNA。

第2步：RNA沉淀。

用QIAGEN’s RNeasy Total RNA Isolation kit分离或洗涤后没有必要沉淀总RNA。调整洗脱体积以制备cDNA合成接近希望的RNA浓度。大多数Poly(A)⁺mRNA分离过程都会导致得到较稀的RNA，所以需要在cDNA合成前浓缩mRNA。TRIzol分离和热酚提取后需要乙醇沉淀：1)加1/10体积3M>260/A₂₈₀应接近2.0为较纯的RNA(即比值在1.9-2.1)。

第3步：由纯化的总RNA合成双链cDNA。

HPLC纯化T7-(d7)₂₄引物；

1)第一链cDNA合成，cDNA合成前，DEPC处理水和逆转录的正确体积必须确定。它由加到反应中的RNA浓度和总体积决定。

RNA和SuperScriptⅡRT体积不要超过12μl。

合成反应可在1.5ml离心管中进行(RNase-free)，按下列组分合成cDNA。

2)第二链cDNA合成。第一链反应放置冰上，稍微离心甩下管壁试剂，在第一链合成的管中加入下列第二链反应试剂，混匀。

≥12000g离心10分钟，16℃放置2小时加2μl 10U T4DNA聚合物16℃放置5分钟，加10μl 0.5M EDTA继续纯化cDNA步骤或-20℃储存。

3)纯化双链cDNA。Phase Lock Gels(PLG)-酚/氯仿提取，≥12000g离心PLG管20-30秒，离下管壁PLG；加162μl(等体积)的(25：24：1)酚：氯仿：异戊醇(10mM Tris-HCLpH8.0,1mM EDTA饱和)到cDNA最后合成产物中(162μl)，最后体积到324μl，混匀，≥12000g离心10分钟；转移上清液至PLG管，不要混合，PLG会混入溶液中；≥12000g离心2分钟；转移上层水相到一个新的1.5ml离心管中；加0.5倍体积7.5M NH₄OA_C和2.5倍体积乙醇(-20℃储存)到样品中，混匀；立即在室温下≥12000g离心20分钟；去上清，0.5ml>

第4步：生物素标记cDNA合成。

利用BioArray High Yield RNA Transcript Labeling kit进行cDNA标记，cDNA体外转录产物(总RNA)如下表。

cDNA体外转录成分如下，37℃，4.5小时，600rpm振荡10秒/35分种。

第5步：纯化和质控体外转录(IVT)产物。

QIAGEN RNeasy Columns纯化体外转录产物，洗涤和洗脱之前将样品过柱两次；洗脱RNA时加水到柱子后，静置一分钟，再离心。cDNA质控，用分光光度计分析RNA浓度，A₂₆₀/A₂₈₀应接近2.0为较纯的RNA(即比值在1.9-2.1)。根据下面的计算公式确定调整cRNA的含量：

cRNA含量＝RNA_m-(总RNA_i)(y)

RNA_m＝体外转录后测得cRNA量(μg)

总RNA_i＝开始总RNA的量(μg)

y＝在IVT过程中使用的cDNA的倍数

凝胶电泳检测样品，同时进行纯化和没有纯化的体外转录产物的凝胶电泳有助于检测纯化过程丢失的范围，0.1％琼酯糖凝胶电泳分析0.1％的样品，RNA和溴化乙锭混合，加热到65℃，5分钟。

第6步：片段化cDNA。

在新的1.5ml RNase-free离心管中按下表加入样品，

94℃，35分钟。然后放置冰上。变性凝胶电泳，至少需要1μg cRNA。-20℃储存样品。

第7步：杂交。在新的1.5mL RNase-free离心管中按下表加入样品，

20×真核生物杂交控制试剂冻存，在使用前在65℃下5分钟。使用前室温平衡探针；在99℃下5分钟；通过加样孔加入适量体积1×杂交缓冲液湿润芯片；在45℃下60rpm预杂交芯片10分钟；处理过的样品45℃，5分钟；最大速离心5分钟；从芯片中取出缓冲液，加等体积处理好的杂交液45℃，60rpm杂交芯片16小时。

第8步：洗脱和染色。

杂交16小时后，从芯片中取出杂交液装入一个新的离心管，放置冰上或-80℃长时间保存；洗脱缓冲液A充满芯片；配制下列溶液：

SAPE液(使用前配制，4℃储存)

抗体溶液

洗脱工作站按下表工作。

第9步：扫描。

采用GeneChip Scanner 3000 7G扫描芯片，并进行芯片的图像分析处理。

结果表明，根据表1中列出的基因设计针对这些基因的检测探针，通过包括所述探针的基因芯片可以检测97％的遗传性白质脑病例。

为了简化本发明的基因芯片，综合考虑探针成本和检出率的性价比对所述基因芯片包括的探针进行优化，所述基因芯片包括针对如下基因的探针可以检测86％的遗传性白质脑病例：ABAT、ABCD1、ACOX1、ALDH3A2、AMACR、ARSA、AUH、CYP27A1、DDC、DLD、ERCC6、ERCC8、ETHE1、FOLR1、GALC、GCDH、L2HGDH、MCCC1、PANK2、PC、PEX1、PEX7、PHYH、PLA2G6、PLP1、PSAP、SLC16A2、SLC17A5和TRAPPC9。

为了简化本发明的基因芯片，进一步考虑探针成本和检出率的性价比对所述基因芯片包括的探针进行优化，所述基因芯片包括针对如下基因的探针可以检测71％的遗传性白质脑病例：MCCC1、AMACR、PEX1、GALC、GCDH、PANK2、PLA2G6、ARSA和ABCD1，即探针SEQ IDNO.1-74。

对于表3中列出的31个突变，为了达到最少28个探针有效检测突变的目的，发明人对针对这些突变位点可以设计出的探针SEQ ID NO.1-74进行了测试，发现SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.29、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.47、SEQ IDNO.50、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.65、SEQ IDNO.67、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70和SEQ ID NO.73可以最大实现遗传性白质脑病患者和正常对照的区分达到69％。所有探针SEQ ID NO.1-74可以检测71％的遗传性白质脑病例。

虽然已经结合优选实施例对本发明进行了描述，但应当理解本发明的保护范围并不局限于这里所描述的实施例。结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学湘雅医院

<120> 一种遗传性白质脑病基因芯片及其应用

<130> CP20170523

<160> 74

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgaccaaaca catcaaggtc actggcacgg tctcagatca ctcacattgt actgacgaag 60

gctgtacctc agttttgtca atgccgcctg gcgatctgct 100

<210> 2

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagatcactc acattgtact gacgaaggct gtacctcagt tttgtcaatg ccgcctggcg 60

atctgctgcc cacacgacca gcttcgcaat catggggtca 100

<210> 3

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctcagtttt gtcaatgccg cctggcgatc tgctgcccac acgaccagct tcgcaatcat 60

ggggtcataa tgcacggaaa cttcgtctcc tgaaattgaa 100

<210> 4

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agacaagcct gaattggcaa acacaagcat gcacaatctt acttttcctc ctccaccccg 60

gacggcttta atcatgacag gatagccaat tctcctggcg 100

<210> 5

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caatcttact tttcctcctc caccccggac ggctttaatc atgacaggat agccaattct 60

cctggcgtgt tccttcaggc actggtctga ttggtcctca 100

<210> 6

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agtgcgtgtg cggtcaaaaa gagccattat aatgcccagt gcacacataa ggccaccacc 60

agcaaagtca gccaggagat tcagcggggc atacggattc 100

<210> 7

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcccagtgca cacataaggc caccaccagc aaagtcagcc aggagattca gcggggcata 60

cggattctca ccacttctgc caatttttga gagaacacct 100

<210> 8

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtcagccagg agattcagcg gggcatacgg attctcacca cttctgccaa tttttgagag 60

aacacctaca tcattaaaaa caaatttaat gtctctttta 100

<210> 9

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catactttct ctggtggata tactctgacg agagagtcga gaatgtatgg ctcgatccac 60

aagtactgta aaatctctag ccacaaaccc gccagtttct 100

<210> 10

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttctttacca gtatctccca atcatctgct gagaggggtt ccacctcaac ttgttgacaa 60

gataccacat gggaacatgg cttgagaaat acctagaaaa 100

<210> 11

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tggttttctt taccagtatc tcccaatcat ctgctgagag gggttccacc tcaacttgtt 60

gacaagatac cacatgggaa catggcttga gaaataccta 100

<210> 12

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

taccagtatc tcccaatcat ctgctgagag gggttccacc tcaacttgtt gacaagatac 60

cacatgggaa catggcttga gaaataccta gaaaaaatta 100

<210> 13

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tcacgacata ataggcagtc agctgaagat tgacataagg ccagtcgaaa ccttttccca 60

gccatccagg gaatgaccat ggcaaccctg cagagagaag 100

<210> 14

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cataaggcca gtcgaaacct tttcccagcc atccagggaa tgaccatggc aaccctgcag 60

agagaaggga ggaggcaaag gtagaggagg tataacggtg 100

<210> 15

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

accccgccgc cgctgaccgc gccgatgccg tcgaactccc ggcccagccc gtcggagtcg 60

tcgagcacgt acgcgccgcc gggcgccagc agcgcacaca 100

<210> 16

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aactcccggc ccagcccgtc ggagtcgtcg agcacgtacg cgccgccggg cgccagcagc 60

gcacacagca gcaagggcac cgcggcgcgg cccgccgaac 100

<210> 17

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

acagtgatct tgcggactgg accgaggcga attccccttc ccagcctcgc gtcccgagtt 60

tgactggcag gacccgctgg tgctggagga gcagctgacc 100

<210> 18

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccccttccca gcctcgcgtc ccgagtttga ctggcaggac ccgctggtgc tggaggagca 60

gctgaccaca gatgagatcc tcatcaggga caccttccgc 100

<210> 19

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gcaggacccg ctggtgctgg aggagcagct gaccacagat gagatcctca tcagggacac 60

cttccgcacc tactgccagg agagactcat gcctcgcatc 100

<210> 20

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cctactacca ccaggatatg gctgtgctgg ggtttcgtct gtggcctatg ggctcctggc 60

ccgagagctg gagcgggtgg acagtggcta caggtcggcg 100

<210> 21

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ttcgtctgtg gcctatgggc tcctggcccg agagctggag cgggtggaca gtggctacag 60

gtcggcgatg agtgtccagt cctccctcgt catgcaccct 100

<210> 22

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gctggagcgg gtggacagtg gctacaggtc ggcgatgagt gtccagtcct ccctcgtcat 60

gcaccctatc tatgcctatg gcagcgagga acagcggcag 100

<210> 23

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ccaggcagcc ttgtgacttt gtcttgtgcc tgcagccaag ggggagctcc tgggctgctt 60

cgggctcaca gagcccaaca gcggaagtga ccccagcagc 100

<210> 24

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agccaagggg gagctcctgg gctgcttcgg gctcacagag cccaacagcg gaagtgaccc 60

cagcagcatg gagaccagag cccactacaa ctcatccaac 100

<210> 25

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ctcttggtgt ctcttgggtg ggcctgaggc gccatctcaa ccctacaggg tcccttcggc 60

tgcctgaaca acgcccggta cggcatcgcg tggggcgtgc 100

<210> 26

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

atctcaaccc tacagggtcc cttcggctgc ctgaacaacg cccggtacgg catcgcgtgg 60

ggcgtgcttg gagcttcgga gttctgcttg cacacagccc 100

<210> 27

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

aacaacgccc ggtacggcat cgcgtggggc gtgcttggag cttcggagtt ctgcttgcac 60

acagcccggc agtacgccct cgacaggtgt gtgagggctg 100

<210> 28

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tacattgact cagtcggatt caatggacgg tcacagtgct attactttga aaaccctgct 60

gattctgaaa agtgtcagaa gttaccattt gatttgaaaa 100

<210> 29

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cagtgctatt actttgaaaa ccctgctgat tctgaaaagt gtcagaagtt accatttgat 60

ttgaaaaatc cgtatcctct gcttctggtg aacattggct 100

<210> 30

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gaaaagtgtc agaagttacc atttgatttg aaaaatccgt atcctctgct tctggtgaac 60

attggctcag gggttagcat cttagcagta tattccaaag 100

<210> 31

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

cacagctttg gaaacatgat gagcaaggag aagcgagagg ctgtcagtaa agaggacctg 60

gccagagcga ctttgatcac catcaccaac aacattggct 100

<210> 32

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cgagaggctg tcagtaaaga ggacctggcc agagcgactt tgatcaccat caccaacaac 60

attggctcaa tagcaagaat gtgtgccctt aatgaagtaa 100

<210> 33

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gcgactttga tcaccatcac caacaacatt ggctcaatag caagaatgtg tgcccttaat 60

gaagtaaggg gacatggatt tctttaattg ctctaaggaa 100

<210> 34

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tgaatggacg aggtcagctg gggccggtga gaggctgggg accctcaggg tgagagcagc 60

agctggatga gcttctggaa ctcctcgcgg tgctcataga 100

<210> 35

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gctggggacc ctcagggtga gagcagcagc tggatgagct tctggaactc ctcgcggtgc 60

tcatagatgt agacctcggt ctcccagagg gcgttgacca 100

<210> 36

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

atgagcttct ggaactcctc gcggtgctca tagatgtaga cctcggtctc ccagagggcg 60

ttgaccagca ctgtgtcact gacctcatcc agcatgatgt 100

<210> 37

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

gctgagccct cacctgaagt actggatgcc gaccatctcg caccaggccc gtgcccggtc 60

cacagcccgc ccgtctggat ccgtgcactg gtgagaagca 100

<210> 38

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gccctcacct gaagtactgg atgccgacca tctcgcacca ggcccgtgcc cggtccacag 60

cccgcccgtc tggatccgtg cactggtgag aagcagcctt 100

<210> 39

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gggcggctga gccctcacct gaagtactgg atgccgacca tctcgcacca ggcccgtgcc 60

cggtccacag cccgcccgtc tggatccgtg cactggtgag 100

<210> 40

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gttggccagc agcccaccgt ccaggaagcg cccattgggt cggaagtaag taggagctgc 60

cccgctgctt cgggccgccc gccacaccag ctggtctagg 100

<210> 41

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

attgggtcgg aagtaagtag gagctgcccc gctgcttcgg gccgcccgcc acaccagctg 60

gtctaggggc ggggaaggag ggcggcccag tggcacaagg 100

<210> 42

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

gcttcgggcc gcccgccaca ccagctggtc taggggcggg gaaggagggc ggcccagtgg 60

cacaagggac tggcataaaa cccatgcact ccagatctca 100

<210> 43

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gcctgaggtt aacgttctgg ttgaaacgag gctcccggac agtttctgga gcatcgtagt 60

tccggaagag gtggagttca gccggctgcc ggtcagacag 100

<210> 44

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

cccggacagt ttctggagca tcgtagttcc ggaagaggtg gagttcagcc ggctgccggt 60

cagacagtgt ccctgtcagc atcaccctgg agagaaatga 100

<210> 45

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

agaggtggag ttcagccggc tgccggtcag acagtgtccc tgtcagcatc accctggaga 60

gaaatgaggc aggaggacgg ctgagccacc cgcccatcca 100

<210> 46

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

atccacttac gtccgcttct cgtccctcat ggagcccagg atgaacgctg gcttccgggc 60

ccgtgagatg tgcatgagat cctgtagttc tgtgaggcac 100

<210> 47

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

tctcgatcca cttacgtccg cttctcgtcc ctcatggagc ccaggatgaa cgctggcttc 60

cgggcccgtg agatgtgcat gagatcctgt agttctgtga 100

<210> 48

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

cttacgtccg cttctcgtcc ctcatggagc ccaggatgaa cgctggcttc cgggcccgtg 60

agatgtgcat gagatcctgt agttctgtga ggcacagagc 100

<210> 49

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

cagagcacat acgtctgccg attttggagg ctaggaatgt aggagtctcc ccaaagtcat 60

tcggggtgtc cacttctgct ccgaacacga tgagggcctt 100

<210> 50

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

ggaatgtagg agtctcccca aagtcattcg gggtgtccac ttctgctccg aacacgatga 60

gggccttgat catctccacg ttgtctttct gttggagatg 100

<210> 51

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tgtccacttc tgctccgaac acgatgaggg ccttgatcat ctccacgttg tctttctgtt 60

ggagatggag agaggataag acgtgcaact gccggggaag 100

<210> 52

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gggctcaccg acatggccag gtgcagcggg gtgttgccgt gctctccgcg ggcatccgcg 60

ttggccccgt gggtcagcag cactatggca cagtcgaagc 100

<210> 53

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

ttgccgtgct ctccgcgggc atccgcgttg gccccgtggg tcagcagcac tatggcacag 60

tcgaagcggt tgcgcatcac cgccacgtgc agggccgtgt 100

<210> 54

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

ccgtgggtca gcagcactat ggcacagtcg aagcggttgc gcatcaccgc cacgtgcagg 60

gccgtgttcc ccgcggagct ggtgctgttc acgttgcagc 100

<210> 55

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

caccgagcat tgcacagcag cagcacgcgg accatctcct gcttccccag ctggcaggcc 60

aggtgcagcg gggtcagccc ttggttattc acctggttca 100

<210> 56

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

atctcctgct tccccagctg gcaggccagg tgcagcgggg tcagcccttg gttattcacc 60

tggttcaggc cagccactgc gttccttcca aggagctgat 100

<210> 57

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

agcggggtca gcccttggtt attcacctgg ttcaggccag ccactgcgtt ccttccaagg 60

agctgatgaa agaggaaggg aagtttgact ccataggatg 100

<210> 58

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

ccttgtactt tccagtccgc acagcaaaaa ccccacggac ctcgtctggg taggacgggt 60

agaagaagag agactgccga gggctctggg ggcagagtca 100

<210> 59

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

cacggacctc gtctgggtag gacgggtaga agaagagaga ctgccgaggg ctctgggggc 60

agagtcaggg gtcacggggc ggggcaggcc ccaagcactg 100

<210> 60

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

cagctgctgc agtggctcct catcgccctc cctgctacct tcgtcaacag tgccatccgt 60

tacctggagg gccaactggc cctgtcgttc cgcagccgtc 100

<210> 61

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

gctaccttcg tcaacagtgc catccgttac ctggagggcc aactggccct gtcgttccgc 60

agccgtctgg tggcccacgc ctaccgcctc tacttctccc 100

<210> 62

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

gagggccaac tggccctgtc gttccgcagc cgtctggtgg cccacgccta ccgcctctac 60

ttctcccagc agacctacta ccgggtcagc aacatggacg 100

<210> 63

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

ctggtggccc acgcctaccg cctctacttc tcccagcaga cctactaccg ggtcagcaac 60

atggacgggc ggcttcgcaa ccctgaccag tctctgacgg 100

<210> 64

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

ccctcggcca tcgccggcct cgtggtgttc ctcacggcca acgtgctgcg ggccttctcg 60

cccaagttcg gggagctggt ggcagaggag gcgcggcgga 100

<210> 65

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

acggccaacg tgctgcgggc cttctcgccc aagttcgggg agctggtggc agaggaggcg 60

cggcggaagg gggagctgcg ctacatgcac tcgcgtgtgg 100

<210> 66

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

ttcggggagc tggtggcaga ggaggcgcgg cggaaggggg agctgcgcta catgcactcg 60

cgtgtggtgg ccaactcgga ggagatcgcc ttctatgggg 100

<210> 67

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

aagggggagc tgcgctacat gcactcgcgt gtggtggcca actcggagga gatcgccttc 60

tatgggggcc atgaggtggg gcaggttggg gtgccgggca 100

<210> 68

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

cccagggagc tagaggacgc tcaggcgggg tctgggacca taggccggtc tggtgtccgt 60

gtggagggcc ccctgaagat ccgaggtaag gctgtcccct 100

<210> 69

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

cgcctaggtt gggaggctat gtgtgactgg aaggacgtcc tgtcgggtgg cgagaagcag 60

agaatcggca tggcccgcat gttctaccac aggtgagcac 100

<210> 70

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

aggttgggag gctatgtgtg actggaagga cgtcctgtcg ggtggcgaga agcagagaat 60

cggcatggcc cgcatgttct accacaggtg agcactccgg 100

<210> 71

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

gcccccgcct aggttgggag gctatgtgtg actggaagga cgtcctgtcg ggtggcgaga 60

agcagagaat cggcatggcc cgcatgttct accacaggtg 100

<210> 72

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

ccagcgccgt gagcatcgac gtggaaggca agatcttcca ggcggccaag gacgcgggca 60

ttgccctgct ctccatcacc caccggccct ccctgtggta 100

<210> 73

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

tcttccaggc ggccaaggac gcgggcattg ccctgctctc catcacccac cggccctccc 60

tgtggtaggt gccctgtctc cctgcctggg gtcggtggga 100

<210> 74

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

tgctctccat cacccaccgg ccctccctgt ggtaggtgcc ctgtctccct gcctggggtc 60

ggtgggagtg gctgcctgag gggaggaggt ggcctggcgg 100