一种花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应的方法

技术领域

本发明涉及一种花生基因组研究方法，特别涉及一种花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应的方法。

背景技术

花生是世界上重要的油料和经济作物，是众多发展中国家重要的油脂、蛋白质来源。中国是世界上最大的花生生产、消费和出口国。因此提高花生产量、品质和抗性对保障我国食用植物油的安全供给和提高人民生活水平等方面具有重要意义。研究认为，良种对作物增产的贡献率超过40％，因此，培育优良品种尤其是聚合了花生高产、优质和抗病等重要性状的品种对花生产业发展尤为重要。

花生栽培种(Arachis hypogaea L.，2n＝4x＝40，AABB)是异源四倍体，基因组庞大(约2.7GB)且复杂。相对于小麦、水稻和玉米等作物，花生基础研究薄弱，使得高效聚合育种受限。为了改善这种状况，花生研究者近些年在花生细胞、分子标记、连锁图谱、BAC库、物理图谱和基因组测序等方面作了很多努力。如基于细胞学标记，纠正了花生野生种基因组分类中的许多错误，确认花生栽培种A和B基因组野生供体亲本分别是A.duranensis和发现了花生属野生种物种的染色体在演化过程中曾发生了频繁的染色体重排；利用BAC探针构建了较高清晰度的栽培种花生染色体核型。

A.duranensis是栽培花生A基因组供体野生亲本，在分子和细胞学等方面得到了大量研究。分子方面，利用2,319个标记(971个SSRs，221个SSCP和1,127个SNPs标记)人们构建了AA基因组(A duranensis×A.duranensis)高密度连锁图谱。并构建了分别覆盖约7.4倍基因组的A.duranensis BAC库。2016年结合连锁图谱和BAC物理图谱等信息，人们完成了A duranensis基因组草图绘制，并公布到PeanutBase网站上。在细胞学研究方面，2004年Seijo利用45S rDNA、5S rDNA和异染色质带，依据染色体从大到小及随体染色体最后的规则构建了A.duranensis FISH核型，发现A.duranensis所有染色体均有明亮的着丝粒DAPI带，其中两条染色体(A2和A10)有45S rDNA位点，1条染色体(A3)有5S rDNA位点。后来研究者利用端粒探针进一步精细化了A.duranensis核型，发现端粒信号主要分布在染色体端部，但两对染色体(A5和A7)存在明显ITRs。尽管如此，A.duranensis的基因组序列图与染色体核型并不对应，严重影响了花生基因组研究。

染色体序列图与染色体核型实现对应是联系测序信息与花生染色体遗传规律的纽带的，可以将基因组测序得到的各种生物学信息直接联系整合到染色体上，揭示花生染色体交换、重组和进化规律，并最终应用到育种。染色体序列图与染色体核型序号不对应，造成BAC和注释基因在染色体上的物理位置不明确，致使基因组研究和优异基因利用困难。因此，本发明围绕花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应的难题，利用生物信息学方法开发花生染色体特异寡核苷酸库，通过寡核苷酸库荧光原位杂交来实现花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应。

发明内容

本发明要解决的技术问题：利用花生野生种A.duranensis基因组序列草图，开发花生染色体单拷贝寡核苷酸库，并利用该探针库结合顺序荧光原位杂交，首次实现花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号相对应。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应的方法，包括以下步骤：

(1)染色体特异寡核苷酸探针的设计

利用花生PeanutBase公布的花生野生种A.duranensis染色体基因组序列草图，选择目标区段，然后设计分析参数：(a)寡核苷酸长度42-48nt；(b)寡核苷酸密度>2oligos/kb；(c)寡核苷酸dTm>10℃；将目标区段序列和分析参数进行生物信息学分析，剔除重复序列，获得长度为42-48nt的单拷贝寡核苷酸序列，从中选择单拷贝寡核苷酸序列，使单拷贝寡核苷酸密度>2oligos/kb，并使其均匀分布在基因组上，再将单拷贝寡核苷酸人工合成寡核苷酸库，并命名为Oligos library 6A-1；

(2)对寡核苷酸库Oligos library 6A-1进行探针标记；

(3)利用顺序荧光原位杂交将花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应

首先以步骤(2)寡核苷酸探针库Oligos library 6A-1为探针，对A.duranensis中期细胞染色体进行第一次荧光原位杂交，照相后，再经过制片探针反洗，洗掉探针杂交信号；然后用45S rDNA质粒和Oligo DP-1探针进行第二次荧光原位杂交；再经过制片探针反洗，用Oligo DP-5探针进行第三次荧光原位杂交，建立A.duranensis中期细胞染色体核型，实现Oligos library 6A-1与实际核型染色体对应。

所述的目标区段为基因富集区，>40基因/Mb。

单拷贝寡核苷酸人工合成寡核苷酸库时，在寡核苷酸两端分别加上游引物(F：T7RNA polymerase promoter)和下游引物(R：5’-CGTGGTCGCGTCTCA-3’)作为引物接头。

步骤(2)的具体方法为：将Digoxigenin-5′-CGTGGTCGCGTCTCA-3′标记到寡核苷酸库Oligos library 6A-1中的寡核苷酸序列上。

步骤(3)的具体方法为：

①第一次荧光原位杂交

(a)染色体标本变性：在有丝分裂中期制片，-70℃冰冻揭片，载玻片在100％酒精中脱水6h后，放置在70％的甲酰胺溶液中，78℃变性70s，再在-20℃条件下分别在70％、95％、100％的酒精中梯度脱水各5min，吹干载玻片；

(b)杂交液的制备：先在离心管中配制杂交液，一张染色体标本制片所用杂交液包括去离子甲酰胺分析纯7.5μl、20×SSC缓冲液1.5μl、50％的硫酸葡聚糖溶液2μl、10mg/ml的鲑鱼精DNA 0.5μl和步骤(2)浓度为150ng/μl的寡核苷酸探针库Oligos library 6A-12.5μl，杂交液在离心管内混匀后75℃变性13min，然后将离心管立即置于-20℃的100％酒精中10-15min；

(c)第一次荧光原位杂交：将步骤(b)的杂交液滴到步骤(a)的载玻片上，盖上盖玻片，于37℃杂交6-8h；42℃条件下，弃盖玻片，分别用2×SSC缓冲液浸泡3次，各10min，然后在室温下用1×TNT缓冲液浸泡5min；将载玻片沥干，每张载玻片上加49μl 1×TNB缓冲液和1μl Anti-digoxigenin-rhodamine，放入37℃暗盒中室温培育30min，用1×TNT缓冲液室温洗涤载玻片3次，每次5min，最后将载玻片吹干，在每张载玻片上加含0.5μg/ml DAPI的DAPI缓冲液500μl，染色3-4min，用DAPI缓冲液冲洗4-5次，滴7μl防荧光淬灭封片剂，盖上20mm×20mm盖玻片，荧光显微镜照相获取图片；

②制片探针反洗和第二次荧光原位杂交

将步骤(c)照相后的制片揭去盖玻片，置于1×PBS缓冲液中浸泡5min，吹干载玻片，放置在70％的甲酰胺溶液中，78℃变性70s，再在42℃条件下分别用2×SSC缓冲液浸泡3次，各10min，然后在室温下用1×PBS缓冲液浸泡5min，室温下分别在70％、95％、100％的酒精中梯度脱水各5min，吹干载玻片，洗去第一次荧光原位杂交信号；

用45S rDNA质粒和Oligo-1探针进行第二次荧光原位杂交，一张染色体标本制片的杂交液包括去离子甲酰胺分析纯7.5μl、20×SSC缓冲液1.5μl、50％的硫酸葡聚糖溶液2μl、45S rDNA质粒探针2.5μl和浓度为1μg/μl的Oligo DP-1 1μl，杂交液在离心管内混匀后103℃变性13min，然后将离心管立即置于-20℃的100％酒精中10-15min，后续步骤同第一次荧光原位杂交；

③制片探针反洗和第三次荧光原位杂交

用Oligo-5探针进行第三次荧光原位杂交，方法同步骤②的制片探针反洗和第二次荧光原位杂交；第三次荧光原位杂交的一张染色体标本制片的杂交液包括去离子甲酰胺分析纯7.5μl、20×SSC缓冲液1.5μl、50％的硫酸葡聚糖溶液2μl和浓度为1μg/μl的OligoDP-5 1.5μl；

④染色体核型对应分析

利用Adobe Photoshop进行图片叠加，确定寡核苷酸库Oligos library 6A-1与花生野生种A.duranensis实际核型染色体序号对应，最终确定花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应。

所述的2×SSC缓冲液包含0.3M的柠檬酸三钠Na₃C₆H₅O₇·2H₂O和3M的NaCl。

所述的1×TNT缓冲液包含0.1M的Tris-HCl、0.15M的NaCl和0.05％的Tween-20。

所述的1×PBS缓冲液包含0.14M NaCl、0.0027M KCl、0.01M Na₂HPO₄、0.0018MKH₂PO₄。

所述的1×TNB缓冲液包含0.5M的Tris-HCl、0.15M的NaCl和0.5％的BlockingReagent。

所述的DAPI缓冲液包含0.1M柠檬酸和0.05M Na₂HPO₄。

所述的Oligo DP-1探针的序列为：TAMARA-5′-TGCGATCATACCAGCACTAATGCACCGGATCCCGTCAGAACTCTGAAGTTAAGCGTG-3′。

所述的Oligo DP-5探针的序列为：FAM-5′-TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGG G-3′。

其它花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应。

本发明的有益效果：

1、本发明利用花生野生种A.duranensis基因组序列草图，开发花生染色体单拷贝寡核苷酸库，通过探针标记和顺序荧光原位杂交首次实现花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号相对应。

2、本发明首次实现了花生野生种A.duranensis基因组的一条染色体序号为A6序列图与实际核型染色体序号为A3染色体对应，为整合花生基因组信息、染色体标记信息和遗传连锁图谱信息奠定了基础，进而为揭示花生染色体交换、重组和进化规律开辟了新的途径，能够用于花生育种研究的发展。

3、本发明为构建花生物理图谱和物理定位单基因奠定基础，能够促进基因的研究和利用。

附图说明

图1为以寡核苷酸探针库Oligos library 6A-1为探针的A.duranensis顺序FISH。(a)中蓝色为DAPI染色；(b)中红色为Oligos library 6A-1探针信号；(c)为a和b叠加图。

图2为以Oligo DP-5(a和e，绿色)、45S rDNA(b和f，红色)和Oligo DP-1(c和g，绿色)为探针的A.duranensis顺序FISH以及它们的染色体信号叠加图(d和h)。

(d)和(h)中45S rDNA为红色信号，Oligo DP-1为白色信号，是(c)和(g)中绿色信号转换而来，Oligo DP-5为绿色信号。

图3为寡核苷酸库Oligos library 6A-1为探针的A.duranensis顺序FISH及以45SrDNA、Oligo DP-1和Oligo DP-5为探针的A.duranensis的顺序FISH。图中蓝色为DAPI染色；(a)和(c)为Oligos library 6A-1FISH(红色)信号；(b)和(d)为45S rDNA(红色)、OligoDP-1(白色)和Oligo DP-5(绿色)信号FISH叠加图，其中Oligo DP-1白色信号由绿色信号转换而来；(e)图从左向右依次为Oligos library 6A-1信号染色体；染色体核型中的A3染色体，探针信号颜色同(b)和(d)图；Oligos library 6A-1信号染色体和染色体核型中的A3染色体模式图；染色体序列图A6染色体及Oligos library 6A-1序列对应的 0-8.5Mb染色体区域。图a-d箭头所示为Oligos library 6A-1定位染色体。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂商所建议的条件与实施步骤。文中如果没有特别说明，其中的百分含量均为重量百分含量。

本发明所用部分试剂如下：

2×SSC缓冲液包含0.3M的柠檬酸三钠Na₃C₆H₅O₇·2H₂O和3M的NaCl。

1×TNT缓冲液包含0.1M的Tris-HCl、0.15M的NaCl和0.05％的Tween-20。

1×PBS缓冲液包含0.14M NaCl、0.0027M KCl、0.01M Na₂HPO₄、0.0018M>2PO₄。

1×TNB缓冲液包含0.5M的Tris-HCl、0.15M的NaCl和0.5％的Blocking Reagent。

DAPI缓冲液包含0.1M柠檬酸和0.05M Na₂HPO₄。

实施例

一种花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应的方法，包括以下步骤：

(1)染色体特异寡核苷酸(oligo)探针的设计

利用花生PeanutBase(https://peanutbase.org/gbrowse_aradu1.0)公布的花生野生种A.duranensis染色体基因组序列草图，选择基因富集区A6短臂末端0-8.5Mb为目标区段。然后设计分析参数：(a)寡核苷酸长度42-48nt；(b)寡核苷酸密度>2oligos/kb；(c)寡核苷酸dTm(DNA熔解温度-发夹DNA熔解温度)>10℃；将目标区段基因组序列和分析参数送由MYcroarray公司(美国)进行生物信息学分析，由MYcroarray公司利用RepeatMasker软件分析目标区段，剔除目标区段基因组重复序列(http://www.repeatmasker.org)，然后将目标区段的基因组序列每隔5nt切割成48nt单元的寡核苷酸库，剔除多于6nt寡核苷酸的聚合物，再与基因组参考序列BLAT比对，识别同源性>75％的寡核苷酸序列，计算dTm，dTm>10℃的留作寡核苷酸库，获得了长度为42-48nt的单拷贝寡核苷酸序列，从中选择单拷贝寡核苷酸序列20,000条，使单拷贝寡核苷酸密度为2.4oligos/kb，并使其均匀分布在基因组上。再由MYcroarray公司合成寡核苷酸库，合成时在单拷贝寡核苷酸两端分别加上游引物(F：T7RNA polymerase promoter，5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’)和下游引物(R：5’-CGTGGTCGCGTCTCA-3’)作为引物接头，命名为Oligos library 6A-1。

(2)采用Murgha et al.2014(Murgha YE,Rouillard JM,Gulari E(2014)Methodsfor the preparation of large quantities of complex single-strandedoligonucleotide libraries[J].Plos One 9(4):e94752)的寡核苷酸库探针标记方法将Digoxigenin-5′-CGTGGTCGCGTCTCA-3′标记到寡核苷酸库Oligos library 6A-1中的20,000条寡核苷酸序列上。

(3)利用顺序荧光原位杂交将花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应

①用地高辛标记的寡核苷酸库Oligos library 6A-1进行第一次荧光原位杂交

(a)染色体标本变性：在A.duranensis有丝分裂中期制片，-70℃冰冻揭片，载玻片在100％酒精中脱水6h后，放置在70％的甲酰胺溶液中，78℃变性70s，再在-20℃条件下分别在70％、95％、100％的酒精中梯度脱水各5min，吹干载玻片；

(b)杂交液的制备：先在离心管中配制杂交液，一张染色体标本制片所用杂交液包括去离子甲酰胺分析纯7.5μl、20×SSC缓冲液1.5μl、50％的硫酸葡聚糖溶液2μl、10mg/ml的鲑鱼精DNA 0.5μl和步骤(2)浓度为150ng/μl的寡核苷酸探针库Oligos library 6A-12.5μl，杂交液在离心管内混匀后75℃变性13min，然后将离心管立即置于-20℃的100％酒精中10-15min；

(c)第一次荧光原位杂交：将步骤(b)的杂交液滴到步骤(a)的载玻片上，盖上盖玻片，于37℃杂交6-8h；42℃条件下，弃盖玻片，分别用2×SSC缓冲液浸泡3次，各10min，然后在室温下用1×TNT缓冲液浸泡5min；将载玻片沥干，每张载玻片上加49μl 1×TNB缓冲液和1μl Anti-digoxigenin-rhodamine(Roche，货号：11207750910)，放入37℃暗盒中室温培育30min，用1×TNT缓冲液室温洗涤载玻片3次，每次5min，最后将载玻片吹干，在每张载玻片上加含0.5μg/ml DAPI的DAPI缓冲液500μl，染色3-4min，用DAPI缓冲液冲洗4-5次，滴7μl防荧光淬灭封片剂(VECTA shield mounting)，盖上20mm×20mm盖玻片，荧光显微镜照相获取图片，如图1。图1中可以明显看Oligos library 6A-1在一对染色体上有明显的信号。

②制片探针反洗和用45S rDNA质粒和Oligo DP-1探针进行第二次荧光原位杂交

(d)制片探针反洗：将步骤(c)照相后的制片揭去盖玻片，置于1×PBS缓冲液中浸泡5min，吹干载玻片，放置在70％的甲酰胺溶液中，78℃变性70s，再在42℃条件下分别用2×SSC缓冲液浸泡3次，各10min，然后在室温下用1×PBS缓冲液浸泡5min，室温下分别在70％、95％、100％的酒精中梯度脱水各5min，吹干载玻片，洗去第一次荧光原位杂交信号；

(e)第二次荧光原位杂交：首先制备杂交液，一张染色体标本制片的杂交液包括去离子甲酰胺分析纯7.5μl、20×SSC缓冲液1.5μl、50％的硫酸葡聚糖溶液2μl、45S rDNA质粒探针2.5μl和浓度为1μg/μl的Oligo DP-1 1μl，杂交液在离心管内混匀后103℃变性13min，然后将离心管立即置于-20℃的100％酒精中10-15min，后续荧光原位杂交步骤同第一次荧光原位杂交，荧光显微镜照相获取图片，见图2；所述的Oligo DP-1探针的序列为：TAMARA-5′-TGCGATCATACCAGCACTAATGCACCGGATCCCGTCAGAACTCTG AAGTTAAG CGTG-3′(SEQ IDNO.1)。

③制片探针反洗和用Oligo DP-5探针进行第三次荧光原位杂交

(f)制片探针反洗：将步骤(e)照相后的制片揭去盖玻片，置于1×PBS缓冲液中浸泡5min，吹干载玻片，放置在70％的甲酰胺溶液中，78℃变性70s，再在42℃条件下分别用2×SSC缓冲液浸泡3次，各10min，然后在室温下用1×PBS缓冲液浸泡5min，室温下分别在70％、95％、100％的酒精中梯度脱水各5min，吹干载玻片，洗去第二次荧光原位杂交信号；

(g)第三次荧光原位杂交：首先制备杂交液，一张染色体标本制片所用杂交液包括去离子甲酰胺分析纯7.5μl、20×SSC缓冲液1.5μl、50％的硫酸葡聚糖溶液2μl和浓度为1μg/μl的Oligo DP-5 1.5μl，杂交液在离心管内混匀后103℃变性13min，然后将离心管立即置于-20℃的100％酒精中10-15min，后续荧光原位杂交步骤同第二次荧光原位杂交，荧光显微镜照相获取图片见图2；所述的Oligo DP-5探针的序列为：FAM-5′-TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTT AGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGG G-3′(SEQ ID NO.2)；

④染色体核型对应分析

利用Adobe Photoshop进行图片叠加(图3)，确定寡核苷酸库Oligos library 6A-1与花生野生种A.duranensis实际核型染色体序号对应，最终确定花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应。

图3中可以明显看出序号为A6染色体序列图上开发的单拷贝寡核苷酸库Oligoslibrary6A-1信号位于染色体核型中的序号为A3染色体上，表明基因组序列中A6染色体序列图与花生实际染色体A3对应。因此证明，本发明的探针库结合顺序荧光原位杂交能够实现花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院

<120> 一种花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcgatcata ccagcactaa tgcaccggat cccgtcagaa ctctgaagtt aagcgtg 57

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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