一种黑脉羊肚菌膳食多酚的制备方法

技术领域

本发明涉及植物活性成分提取技术领域，尤其是涉及一种黑脉羊肚菌膳食多酚的制备方法。

背景技术

黑脉羊肚菌属盘菌目羊肚菌属，主要分布于我国云南、四川、新疆、甘肃、西藏、青海等地，欧洲及北美东部亦有分布，是一种名贵的野生食药用真菌。黑脉羊肚菌富含蛋白质、维生素及多种必需氨基酸，并含有钾、钠、钙、镁和锌、铁等多种常量和微量元素。研究表明黑脉羊肚菌多酚含量丰富，多酚结构中存在的羟基基团可与体内自由基结合，从而消灭自由基，因而具有抗氧化、抗癌等功能活性，并成为国内外研究的热点。

现有技术中，卢可可（不同产地尖顶羊肚菌多酚组成及抗氧化活性研究[J]. 食品科学，2015，36: 6～12）采用两步法提取黑脉羊肚菌多酚，过程中首先提取游离酚，接着在碱性条件下提取结合酚，该工艺复杂，且制备过程中黑脉羊肚菌多酚不稳定，易分解，导致最终产品的收率低，提高了工艺成本，经济效益低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺过程少、产品纯度大、经济效益高的黑脉羊肚菌膳食多酚的制备方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种黑脉羊肚菌膳食多酚的制备方法，所述方法包括黑脉羊肚菌的预处理、膳食多酚的一步提取、膳食多酚的纯化。一步提取黑脉羊肚菌膳食多酚，简化了工艺过程，降低了生产成本，为工业化应用提供了有利条件。

作为优选，黑脉羊肚菌的预处理过程中，黑脉羊肚菌采摘后10～12h内速冻，于-15～-20℃条件下冻藏，操作前取出冷冻黑脉羊肚菌于60～70℃烘箱烘干至恒重量，用中药粉碎机粉碎，过70～75目筛后密封备用。常温条件下，黑脉羊肚菌膳食多酚在贮藏期会急剧下降，导致最终产品的产率极低，造成了资源的浪费。

作为优选，膳食多酚的一步提取过程中，取0.1～0.2mol/L乙酸钠缓冲液25～35份，向其中加入2～4份黑脉羊肚菌粉体，搅拌3～6min，再加入30～35份正己烷，静置5～8min后搅拌15～20min，在4000～4200r/min下离心5～10min，除去脂肪层，再向其中加入210～240U/g的单宁酸酶，在35～40℃下水解20～24h，接着加入50～70份体积比为2/1～1/1的丙酮与乙酸乙酯的混合液，静置5～10min后搅拌提取15～20min，将其在6000～6200r/min下离心10～15min，收集上清液，抽滤后于40～45℃旋转蒸干，用30～35份甲醇定容，过0.4～0.45µm有机滤膜后，贮于-85～-90℃条件下备用。采用酶法提取黑脉羊肚菌中的多酚，安全无毒，提高了黑脉羊肚菌膳食多酚的食药价值，增加了制备方法的经济效益。

作为优选，膳食多酚的纯化过程中，将上步过滤所得的滤液通过交换树脂，并用混合洗脱剂洗脱，向洗脱液中加入5～10份活性多肽，经减压浓缩干燥，得黑脉羊肚菌膳食多酚。交换树脂对黑脉羊肚菌膳食多酚有较好的吸附和解吸性能，能在较短时间内完成对多酚的吸附和解吸作用，缩短了黑脉羊肚菌膳食多酚的制备时间，利用工业化应用。

作为优选，黑脉羊肚菌膳食多酚的制备中，所加入活性多肽的氨基酸序列为HSHACACRARRCGYYVSKAHCRRARRCGYYVSHRGRCYCRCLRCRVLHPGKLCVCVNCSR。黑脉羊肚菌膳食多酚活性强，很不稳定，活性多肽的加入提高了黑脉羊肚菌膳食多酚的稳定性，增加了工艺过程的收率，且掩盖了制备过程中所产生的臭味，提高了工艺过程的应用价值。

作为优选，膳食多酚的纯化过程中，混合洗脱剂由乙醇与丙酮混合制备，其中乙醇与丙酮的体积比为3/1～4/1。乙醇能够溶出黑脉羊肚菌中的小分子多酚类，丙酮能够溶出黑脉羊肚菌中的大分子多酚类，它们的混合使用提高了黑脉羊肚菌的产率，充分利用了原材料。

作为优选，膳食多酚的纯化过程中，洗脱液在绝对压力0.01～0.02MPa，温度65～75℃下真空浓缩，置于80～90℃干燥。该条件下，乙醇和丙酮可以快速蒸出，保证了产品的纯度。

与现有技术相比，本发明的优点在于：制备的黑脉羊肚菌膳食多酚品质高，抗氧化性能强，本发明优化了传统工艺中黑脉羊肚菌中的游离酚和结合酚的分步提取，采用一步法提取黑脉羊肚菌膳食多酚，简化了工艺过程，且制备过程中所加的活性多肽增加了黑脉羊肚菌膳食多酚的稳定性，提高了收率，使资源得到了最大化利用，降低了生产成本，为工业化应用提供了有利条件。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明：

实施例1：

一种黑脉羊肚菌膳食多酚的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)黑脉羊肚菌的预处理：黑脉羊肚菌采摘后10h内速冻，于15℃条件下冻藏，操作前取出冷冻黑脉羊肚菌于60℃烘箱烘干至恒重量，用中药粉碎机粉碎，过70目筛后密封备用。常温条件下，黑脉羊肚菌膳食多酚在贮藏期会急剧下降，导致最终产品的产率极低，造成了资源的浪费；

2)膳食多酚的一步提取：取0.1mol/L乙酸钠缓冲液25份，向其中加入2份黑脉羊肚菌粉体，搅拌3min，再加入30份正己烷，静置5min后搅拌15min，在4000r/min下离心5min，除去脂肪层，再向其中加入210U/g的单宁酸酶，在35℃下水解20h，接着加入50份体积比为2/1的丙酮与乙酸乙酯的混合液，静置5min后搅拌提取15min，将其在6000r/min下离心10min，收集上清液，抽滤后于40℃旋转蒸干，用30份甲醇定容，过0.4µm有机滤膜后贮于85℃条件下备用。采用酶法提取黑脉羊肚菌中的多酚，安全无毒，提高了黑脉羊肚菌膳食多酚的食药价值，增加了制备方法的经济效益；

3)膳食多酚的纯化：将上步过滤所得的滤液通过NKA～Ⅱ型交换树脂，并用混合洗脱剂洗脱，混合洗脱剂由体积比为3/1的乙醇与丙酮混合制备，接着向洗脱液中加入5份活性多肽，洗脱液在绝对压力0.01MPa，温度65℃下真空浓缩，置于80℃干燥，得黑脉羊肚菌膳食多酚。乙醇能够溶出黑脉羊肚菌中的小分子多酚类，丙酮能够溶出黑脉羊肚菌中的大分子多酚类，它们的混合使用提高了黑脉羊肚菌的产率，充分利用了原材料。黑脉羊肚菌膳食多酚活性强，很不稳定，活性多肽的加入提高了黑脉羊肚菌膳食多酚的稳定性，增加了工艺过程的收率，且掩盖了制备过程中所产生的臭味。

实施例2：

一种黑脉羊肚菌膳食多酚的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)黑脉羊肚菌的预处理：黑脉羊肚菌采摘后11h内速冻，于17℃条件下冻藏，操作前取出冷冻黑脉羊肚菌于62℃烘箱烘干至恒重量，用中药粉碎机粉碎，过72目筛后密封备用。常温条件下，黑脉羊肚菌膳食多酚在贮藏期会急剧下降，导致最终产品的产率极低，造成了资源的浪费；

2)膳食多酚的一步提取：取0.15mol/L乙酸钠缓冲液30份，向其中加入2份黑脉羊肚菌粉体，搅拌4min，再加入32份正己烷，静置6min后搅拌16min，在4100r/min下离心6min，除去脂肪层，再向其中加入220U/g的单宁酸酶，在36℃下水解22h，接着加入55份体积比为1.5/1的丙酮与乙酸乙酯的混合液，静置6min后搅拌提取16min，将其在6100r/min下离心12min，收集上清液，抽滤后于42℃旋转蒸干，用32份甲醇定容，过0.42µm有机滤膜后贮于87℃条件下备用。采用酶法提取黑脉羊肚菌中的多酚，安全无毒，提高了黑脉羊肚菌膳食多酚的食药价值，增加了制备方法的经济效益；

3)膳食多酚的纯化：将上步过滤所得的滤液通过NKA～Ⅱ型交换树脂，并用混合洗脱剂洗脱，混合洗脱剂由体积比为3.5/1的乙醇与丙酮混合制备，接着向洗脱液中加入6份活性多肽，洗脱液在绝对压力0.015MPa，温度70℃下真空浓缩，置于82℃干燥，得黑脉羊肚菌膳食多酚。乙醇能够溶出黑脉羊肚菌中的小分子多酚类，丙酮能够溶出黑脉羊肚菌中的大分子多酚类，它们的混合使用提高了黑脉羊肚菌的产率，充分利用了原材料。黑脉羊肚菌膳食多酚活性强，很不稳定，活性多肽的加入提高了黑脉羊肚菌膳食多酚的稳定性，增加了工艺过程的收率，且掩盖了制备过程中所产生的臭味。

实施例3：

一种黑脉羊肚菌膳食多酚的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)黑脉羊肚菌的预处理：黑脉羊肚菌采摘后12h内速冻，于20℃条件下冻藏，操作前取出冷冻黑脉羊肚菌于68℃烘箱烘干至恒重量，用中药粉碎机粉碎，过75目筛后密封备用。常温条件下，黑脉羊肚菌膳食多酚在贮藏期会急剧下降，导致最终产品的产率极低，造成了资源的浪费；

2)膳食多酚的一步提取：取0.2mol/L乙酸钠缓冲液35份，向其中加入2份黑脉羊肚菌粉体，搅拌6min，再加入35份正己烷，静置8min后搅拌20min，在4200r/min下离心10min，除去脂肪层，再向其中加入240U/g的单宁酸酶，在40℃下水解24h，接着加入70份体积比为1/1的丙酮与乙酸乙酯的混合液，静置10min后搅拌提取20min，将其在6200r/min下离心15min，收集上清液，抽滤后于45℃旋转蒸干，用35份甲醇定容35份，过0.45µm有机滤膜后贮于90℃条件下备用。采用酶法提取黑脉羊肚菌中的多酚，安全无毒，提高了黑脉羊肚菌膳食多酚的食药价值，增加了制备方法的经济效益；

3)膳食多酚的纯化：将上步过滤所得的滤液通过NKA～Ⅱ型交换树脂，并用混合洗脱剂洗脱，混合洗脱剂由体积比为4/1的乙醇与丙酮混合制备，接着向洗脱液中加入10份活性多肽，洗脱液在绝对压力0.02MPa，温度75℃下真空浓缩，置于90℃干燥，得黑脉羊肚菌膳食多酚。乙醇能够溶出黑脉羊肚菌中的小分子多酚类，丙酮能够溶出黑脉羊肚菌中的大分子多酚类，它们的混合使用提高了黑脉羊肚菌的产率，充分利用了原材料。黑脉羊肚菌膳食多酚活性强，很不稳定，活性多肽的加入提高了黑脉羊肚菌膳食多酚的稳定性，增加了工艺过程的收率，且掩盖了制备过程中所产生的臭味。

采用卢可可（不同产地尖顶羊肚菌多酚组成及抗氧化活性研究[J]. 食品科学，2015，36: 6～12）的方法为对照组，黑脉羊肚菌预处理后，先用丙酮溶液提取游离酚，再用碱法提取结合酚。采用Folin～酚法测定黑脉羊肚菌多酚含量，比较实施例1～3与对照组，结果如下：

从上表中可以看出，相比传统的制备方法，本发明所提取黑脉羊肚菌膳食多酚纯度大，收率高，具有良好的经济前景。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>西南大学

<120>一种黑脉羊肚菌膳食多酚的制备方法

<130>1

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>60

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

His Ser His Ala Cys Ala Cys Arg Ala Arg Arg Cys Gly Tyr Tyr Val

1 5 1015

Ser Lys Ala His Cys Arg Arg Ala Arg Arg Cys Gly Tyr Tyr Val Ser

202530

His Arg Gly Arg Cys Tyr Cys Arg Cys Leu Arg Cys Arg Val Leu His

354045

Pro Gly Lys Leu Cys Val Cys Val Asn Cys Ser Arg

505560