超薄片层状功能化二硫化钼纳米复合材料及其在糖肽富集中的应用

技术领域

本发明属于材料领域，涉及一种超薄片层状功能化二硫化钼纳米复合材料及其在糖肽富集中的应用。

背景技术

蛋白质的糖基化修饰是一种最常见且复杂的蛋白质翻译后修饰。它能赋予前体蛋白质一些新的功能，如其结合的特异性与稳定性等。糖蛋白参与活细胞的许多重要的功能，如细胞的相互识别，细胞分化，信号传导和免疫应答等。如今，糖蛋白已经作为癌症诊断和监测的生物标志物。因此，对糖蛋白的深度覆盖与准确鉴定对全面研究蛋白质的各种功能是至关重要的。

目前基于生物质谱技术的糖蛋白组学策略已经成为一种非常普遍的研究手段。但是，由于糖基化蛋白的丰度非常低并且动态范围广，且发生糖基化修饰的蛋白不容易电离形成分子离子并在质谱分析时受到非糖肽的抑制，导致无法对糖基化的蛋白进行检测，因而对糖基化蛋白的研究仍然面临比较多的挑战。

为了解决这一问题，现有的研究方法是先将糖基化蛋白酶解成糖基化肽段，然后进行鉴定。然而，由于酶切产物中存在大量的非糖基化肽段，对糖基化肽段在质谱检测中的响应信号有较强的抑制作用。所以，在样品处理过程中有必要对糖肽进行富集后再进行质谱分析。

目前已经发展出了多种不同的糖肽富集策略，包括凝集素亲和色谱法、硼酸化学法、亲水相互作用色谱法及肼化学法。其中凝集素亲和色谱法是目前应用最广泛的糖蛋白、糖肽富集方法，但是只对特定糖型的糖肽/糖蛋白有着非常良好的作用，缺乏通用性。肼化学法是基于利用高碘酸钠将糖链上的邻二羟基氧化成醛基，然后使用酰基功能化材料与醛基进行共价结合，从而实现对糖肽/糖蛋白的富集，因此具有较高的富集选择性，但共价键的生成导致糖链结构难以释放，无法实现对所富集的糖蛋白、糖肽进行糖型分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种超薄片层状功能化二硫化钼纳米材料及其在糖肽富集中的应用。

本发明提供的功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料，由二硫化钼纳米片、纳米贵金属和功能分子组成；

所述功能分子为含巯基的糖肽富集功能分子；也即该功能分子中含有巯基，也具有糖肽富集的功能。

所述纳米贵金属通过配位键固定于所述二硫化钼纳米片的表面；

所述功能分子通过巯基与所述纳米贵金属相连。

上述功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料中，所述二硫化钼纳米片的最长边长度为50～500nm；厚度为0.69nm；

所述纳米贵金属为纳米金、纳米银或纳米铂；

所述纳米贵金属的形态为纳米颗粒或者纳米线；

所述纳米颗粒的粒径为2～20nm；所述纳米线的长度为2～5nm；

所述功能分子为L-半胱氨酸或巯基苯硼酸。

所述二硫化钼、贵金属与功能分子的用量比为10mg：1.5-5mg：40-100mg。

该复合材料的结构示意图如图1所示。

本发明提供了两种制备所述功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料的方法，其中，方法一基于硼酸化学法，包括如下步骤：

将所述二硫化钼纳米片和纳米贵金属通过配位键相连得到二硫化钼-贵金属后，与功能分子分散于溶剂中，搅拌混匀进行硫-贵金属反应，反应完毕离心收集沉淀，即得所述功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料；

所述功能分子为含巯基且具糖肽富集功能的分子。

上述方法的硫-贵金属反应步骤中，温度为10-60℃，具体为室温；时间为12-24h；

所述溶剂为无水乙醇；

所述二硫化钼-贵金属、功能分子与溶剂的用量比为5～20mg：30～100mg：2～5mL；

所述离心步骤中，离心力为1000-10000g，具体为4500g；时间为5-30分钟，具体为15分钟。

方法二基于亲水富集原理，包括如下步骤：

将所述二硫化钼纳米片和纳米贵金属通过配位键相连得到二硫化钼-贵金属后，与功能分子的乙醇水溶液搅拌后，离心收集沉淀，依次用乙醇和水洗涤后取沉淀而得；

所述功能分子为含巯基且具糖肽富集功能的分子。

上述方法的功能分子的乙醇水溶液中，乙醇水溶液的体积百分浓度为50-80％，具体为75％；

所述功能分子与乙醇水溶液的用量比为40-100mg：4mL，具体为100mg：4mL；

所述搅拌步骤中，时间为12-24小时；

所述离心步骤中，离心力为1000-10000g，具体为4500g；时间为5-30分钟，具体为15分钟；

所述洗涤步骤中，用乙醇和水洗涤的次数均为3-10次，具体为3次。

上述两方法的示意图如图2所示。

上述两方法中，所述二硫化钼纳米片和所述纳米贵金属通过配位键相连，可按照各种常规方法制得，如均可通过包括如下步骤的方法实现：

将二硫化钼的正己烷悬浮液与贵金属盐和油胺的正己烷溶液混合，超声后，加入还原剂混匀后室温静置后，加入无水乙醇，离心收集沉淀，再加入正己烷溶解后，加入无水乙醇混匀离心，收集沉淀而得；

具体的，所述贵金属盐为三水合四氯化金、硝酸银或四氯铂酸钾；

所述还原剂为三异丙基硅烷(TIPS)；

所述二硫化钼的正己烷悬浮液中，二硫化钼与正己烷的用量比为10～50mg：1～5mL；

所述贵金属盐和油胺的正己烷溶液中，贵金属盐、油胺与正己烷的用量比为3～15mg：100～500μL：2～8mL，具体为3mg：100μL：1.5mL；

所述还原剂与二硫化钼的用量比为100～500μL：10～50mg，具体为150μL：10mg；

所述静置步骤中，时间为4-5小时；

所述离心步骤中，离心力均为1000-10000g，具体为4500g；时间均为5-30分钟，具体为15分钟。

另外，上述本发明提供的功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料在糖基化肽段的富集和/或检测中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种富集糖肽的方法，该方法包括如下步骤：

1)用富集缓冲液洗涤所述功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料后，将待分离糖肽样品与所述功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料在富集缓冲液中共同震荡孵育，离心收集沉淀；

2)用富集缓冲液洗涤步骤1)所得沉淀后，再置于洗脱缓冲液中震荡孵育，离心收集上清液，即完成所述待分离糖肽样品的富集。

上述方法的步骤1)孵育步骤中，时间为30～60分钟；步骤2)孵育步骤中，时间为10-30分钟；所述步骤1)和步骤2)孵育的温度均为室温；

所述功能化二硫化钼-纳米金复合材料为二硫化钼-纳米金-L-半胱氨酸时，富集缓冲液为由体积比为86：13.9：0.1的乙腈、水和三氟乙酸组成的混合液；

所述洗脱缓冲液为由体积比为30：69：1的乙腈、水和三氟乙酸组成的混合液；

所述功能化二硫化钼-纳米金复合材料为二硫化钼-纳米金-巯基苯硼酸时，富集缓冲液为50mM的碳酸氢铵的水溶液；

所述洗脱缓冲液为由体积比为50：49：1的乙腈、水和三氟乙酸组成的混合液；

所述待分离糖肽样品具体可为IgG胰蛋白酶酶切肽段。

该富集方法的示意图如图3所示。

本发明基于一种二维超薄片层结构的二硫化钼纳米材料为基质，表面负载上纳米金等贵金属，最后通过一步接枝上含巯基且具糖肽富集功能的基团，通过Au-S键制备出了含巯基的具有糖肽富集功能的纳米材料。

本发明的优点：

1)超薄片层二硫化钼提高了材料的比表面积，其表面裸露的活性硫原子可使原位还原生成纳米金，同时也克服了纳米金易团聚的不足，并且可以通过化学反应生成稳固的Au-S键的方法，在新型超薄二维纳米片材料上负载大量的功能基团，材料合成方法简单、容易、清洁、快速。

2)通过与糖肽的亲水相互作用，实现对糖肽的选择性富集。

3)通过表面的硼酸基团与糖肽之间形成稳固而又可逆的共价键，实现对糖肽的选择性富集。

4)可以实现低浓度糖肽的高灵敏度富集检测，最低可检测浓度为0.1fmol/μL的糖肽。

附图说明

图1为功能化二硫化钼-纳米金复合材料特征结构图。

图2为功能化二硫化钼-纳米金复合材料合成示意图。(a)基于亲水富集原理，(b)基于硼酸化学法。

图3为功能化二硫化钼-纳米金复合材料富集糖肽示意图。

图4为实施例1中MALDI-TOF质谱图。(a)直接分析IgG胰蛋白酶酶切肽段(6.7pmol)，(b)功能化二硫化钼-纳米金复合材料富集后的IgG胰蛋白酶酶切肽段(6.7pmol)

图5为实施例2中MALDI-TOF质谱图。功能化二硫化钼-纳米金复合材料富集后的IgG胰蛋白酶酶切肽段：(a)0.67pmol；(b)20fmol；(c)10fmol。

图6为实施例3中MALDI-TOF质谱图,(a)功能化二硫化钼-纳米金复合材料富集后的BSA与IgG胰蛋白酶酶切肽段(IgG:BSA,1:200,w/w,2μg)；(b)功能化二硫化钼-纳米金复合材料富集后的BSA与IgG胰蛋白酶酶切肽段(IgG:BSA,1:500,w/w,2μg)。

图7为实施例4中MALDI-TOF质谱图,(a)直接分析HRP胰蛋白酶酶切肽段(6.7pmol)；(b)功能化二硫化钼-纳米金复合材料富集后的HRP胰蛋白酶酶切肽段(6.7pmol)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

实施例1、基于亲水富集原理的功能化二硫化钼-纳米金复合材料对糖肽的富集和检测，包括以下步骤：

一、制备二硫化钼-纳米金：

(1)将10mg二硫化钼粉末超声分散在1mL正己烷中。

(2)将3mg三水合四氯化金和100μL油胺溶解在1.5mL正己烷中。

(3)将步骤(1)中所得的产物与步骤(2)中所得的产物进行混合后超声分散。

(4)向步骤(3)中所得的产物混合液中加入150μL的三异丙基硅烷(TIPS)，混匀后静置4小时。

(5)将步骤(4)中所得的产物中加入无水乙醇，混匀后于4,500g离心15分钟。

(6)取步骤(5)中所得的沉淀，加入正己烷使沉淀溶解后，接着加入无水乙醇，混匀后混匀后于4,500g离心15分钟。

(7)重复步骤(6)2次后，取沉淀为二硫化钼-纳米金。

二、制备功能化二硫化钼-纳米金复合材料：

(8)将100mgL-半胱氨酸溶解于4mL 75％(v/v)的乙醇水溶液中。

(9)将步骤(7)中所得的二硫化钼-纳米金与与步骤(8)所得的溶液进行混合。在室温环境中，使用混合仪进行搅拌混合24小时。

(10)将步骤(9)中所得的产物于4,500g离心15分钟后弃上清取沉淀。将得到的产物依次使用乙醇和水清洗3次后取沉淀，即为本发明提供的功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料。

三、糖肽的富集：

(11)称取1mg步骤(10)中所得材料震荡分散于1mL富集缓冲液(乙腈/水/三氟乙酸,86:13.9:0.1,v/v/v)中，取20μL上述悬浮液，离心后取下层沉淀，并用该富集缓冲液洗涤3次。

(12)取2组(记为组1和组2)各含IgG胰蛋白酶酶切肽段的100μL富集缓冲液(乙腈/水/三氟乙酸,86:13.9:0.1,v/v/v)，每组中IgG胰蛋白酶酶切肽段为6.7pmol。

(13)将步骤(11)中所得沉淀悬浮于步骤(12)中组1溶液后，在室温下震荡孵育30min。然后，离心弃液体，用100μL富集缓冲液充分洗涤，重复3次，保留沉淀。

(14)将步骤(13)所得沉淀悬浮于20μL洗脱缓冲液(乙腈/水/三氟乙酸,30:69:1,v/v/v)中，在室温下震荡孵育10min后，离心收集上清液。同时，将所得沉淀再次悬浮于20μL洗脱缓冲液(乙腈/水/三氟乙酸,30:69:1,v/v/v)中，在室温下震荡孵育10min后，离心收集上清液并合并。

四、糖肽的检测：

取1μL上述所收集的上清液，滴加于MALDI靶板上，待其自然风干后，滴加一定量(1μL)的DHB基质(25mg/mL2,5-二甲基苯甲酸，乙腈/水/磷酸，70:29:1，v/v/v)，待其挥发结晶后，进行MALDI-TOF MS分析。

同时，取一定量(1μL)的步骤(12)中组2溶液，滴加于MALDI靶板上，待其自然风干后，滴加一定量(1μL)的DHB基质(25mg/mL 2,5-二甲基苯甲酸，乙腈/水/磷酸，70:29:1，v/v/v)，待其挥发结晶后，作为空白对照，进行MALDI-TOF MS分析。

结果如附图4所示，通过对比富集前的空白对照样品与富集后上清液的质谱图结果，表明该功能化二硫化钼－纳米金复合材料对IgG胰蛋白酶酶切肽段中的糖肽具有特异性富集性能。结果是在未对样品进行富集的情况下，其MALDI-TOF MS的图谱上，仅能鉴定到5条糖肽，并且在分子量为1000-2000的范围内出现大量的高丰度非糖肽信号。而在使用本发明提供的功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料对样品进行糖肽富集的情况下，其MALDI-TOF MS的图谱上，能鉴定到多达32条糖肽，并且在分子量为1000-2000的范围内的大量的高丰度非糖肽信号被去除。因此，该结果表明所制备的功能化二硫化钼－纳米金复合材料对糖基化肽段的富集有着优异的性能。

实施例2、基于亲水富集原理的功能化二硫化钼－纳米金复合材料对糖肽富集灵敏度检测，包括以下步骤：

一、糖肽的富集：

(11)称取1mg实施例1所得功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料，震荡分散于1mL富集缓冲液(乙腈/水/三氟乙酸,86:13.9:0.1,v/v/v)中，取20μL上述悬浮液，离心后取下层沉淀，并用富集缓冲液洗涤3次。

(12)取3组(记为组1、组2和组3)各含IgG胰蛋白酶酶切肽段的100μL富集缓冲液(乙腈/水/三氟乙酸,86:13.9:0.1,v/v/v)，其中组1、组2和组3中的IgG胰蛋白酶酶切肽段含量分别为6.7pmol,20fmol和10fmol。

(13)将步骤(11)中所得沉淀分别悬浮于步骤(12)中组1、组2和组3溶液后，在室温下震荡孵育30min。然后，离心弃液体，用100μL富集缓冲液充分洗涤，重复3次，保留沉淀。

(14)将步骤(13)中所得沉淀分别悬浮于20μL洗脱缓冲液(乙腈/水/三氟乙酸,30:69:1,v/v/v)中，在室温下震荡孵育10min后，离心收集上清液为洗脱液。同时，将所得沉淀再次悬浮于20μL洗脱缓冲液(乙腈/水/三氟乙酸,30:69:1,v/v/v)中，在室温下震荡孵育10min后，离心收集上清液为洗脱液，合并上述洗脱液。

二、糖肽的检测：

各取1μL上述所收集的上清液，分别滴加于MALDI靶板上，待其自然风干后，滴加一定量(1μL)的DHB基质(25mg/mL 2,5-二甲基苯甲酸，乙腈/水/磷酸,70:29:1,v/v/v)，待其挥发结晶后，进行MALDI-TOF MS分析。

结果如附图5所示，通过对低含量的IgG酶切肽段的富集后洗脱液进行质谱分析，表明该功能化二硫化钼－纳米金复合材料对IgG胰蛋白酶酶切肽段中的糖肽具有高灵敏度的富集性能。结果是含量为6.7pmol的IgG酶切肽段时，其MALDI-TOF MS的图谱上，能鉴定到28条糖肽，并且在分子量为1000-2000的范围内的大量的高丰度非糖肽信号被去除。而在含量低至20fmol的IgG酶切肽段时，其MALDI-TOF MS的图谱上，能鉴定到6条糖肽，并且在分子量为1000-2000的范围内的大量的高丰度非糖肽信号被去除。在含量最低至10fmol的IgG酶切肽段时，其MALDI-TOF MS的图谱上，能鉴定到1条糖肽的信号强度非常明显，并且在分子量为1000-2000的范围内的大量的高丰度非糖肽信号被去除。因此，该结果表明所制备的功能化二硫化钼－纳米金复合材料对低丰度糖基化肽段的富集具有高灵敏度。

实施例3、基于亲水富集原理的功能化二硫化钼－纳米金复合材料对糖肽富集选择性和特异性检测，包括以下步骤：

一、糖肽的富集：

(11)称取1mg实施例1所得功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料，震荡分散于1mL富集缓冲液(乙腈/水/三氟乙酸,86:13.9:0.1,v/v/v)中，取20μL上述悬浮液，离心后取下层沉淀，并用富集缓冲液洗涤3次。

(12)取3组(记为组1和组2)含IgG和牛血清白蛋白(BSA)酶切产物的混合物的100μL富集缓冲液(乙腈/水/三氟乙酸,86:13.9:0.1,v/v/v)，其中组1和组2中的各含2μgIgG和BSA酶切产物的混合物的质量比分别为1:200和1:500。

(13)将步骤(11)中所得沉淀分别悬浮于步骤(12)中组1和组2溶液后，在室温下震荡孵育30min。然后，离心弃液体，用100μL富集缓冲液充分洗涤，重复3次，保留沉淀。

(14)将步骤(13)中所得沉淀分别悬浮于20μL洗脱缓冲液(乙腈/水/三氟乙酸,30:69:1,v/v/v)中，在室温下震荡孵育10min后，离心收集上清液为洗脱液。同时，将所得沉淀再次悬浮于20μL洗脱缓冲液(乙腈/水/三氟乙酸,30:69:1,v/v/v)中，在室温下震荡孵育10min后，离心收集上清液为洗脱液，合并上述洗脱液。

二、糖肽的检测：

各取1μL上述所收集的上清液，分别滴加于MALDI靶板上，待其自然风干后，滴加一定量(1μL)的DHB基质(25mg/mL2,5-二甲基苯甲酸，乙腈/水/磷酸，70:29:1，v/v/v)，待其挥发结晶后，进行MALDI-TOF MS分析。

结果如附图6所示，通过观察不同质量比的IgG和BSA酶切产物的混合物富集后洗脱液的质谱图结果，表明该功能化二硫化钼－纳米金复合材料对IgG胰蛋白酶酶切肽段中的糖肽具有高灵敏度的富集性能。结果是在来自大量的BSA胰蛋白酶酶切产物中非糖基化肽段的干扰下的情况进行富集，其MALDI-TOF MS的图谱上，在IgG与BSA质量比为1:200和1:500时，分别可鉴定到7条和5条糖肽，并且在分子量为1000-2000的范围内的大量的高丰度非糖肽信号被去除。因此，该结果表明所制备的功能化二硫化钼－纳米金复合材料对低丰度糖基化肽段的富集具有高选择性。

实施例4、基于硼酸化学法的功能化二硫化钼－纳米金复合材料对糖肽富集选择性和特异性检测，包括以下步骤：

一、、制备功能化二硫化钼-纳米金复合材料：

(8)称取5mg实施例1所得二硫化钼-纳米金，与30mg 4-巯基苯硼酸分散于2mL无水乙醇中，室温环境下磁力搅拌24小时。

(9)将步骤(8)中所得的产物于4,500g离心15分钟后取沉淀。

(10)将步骤(9)中所得沉淀加入2mL无水乙醇洗涤3次后取沉淀，即为本发明提供的功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料。

二、糖肽的富集：

(11)称取1mg步骤(10)中所得材料震荡分散于1mL富集缓冲液50mMNH₄HCO₃的水溶液中，取20μL上述悬浮液，离心后取下层沉淀，并用富集缓冲液洗涤3次。

(12)取2组(记为组1和组2)各含HRP胰蛋白酶酶切肽段的100μL富集缓冲液(50mMNH₄HCO₃)，每组中HRP胰蛋白酶酶切肽段为6.7pmol。

(13)将步骤(11)中所得沉淀悬浮于步骤(12)中组1溶液后，在室温下震荡孵育30min。然后，离心弃液体，用100μL富集缓冲液充分洗涤，重复3次，保留沉淀。

(14)将步骤(13)所得沉淀悬浮于20μL洗脱缓冲液(乙腈/水/三氟乙酸,50:49:1,v/v/v)中，在室温下震荡孵育10min后，离心收集上清液。同时，将所得沉淀再次悬浮于20μL洗脱缓冲液(乙腈/水/三氟乙酸,50:49:1,v/v/v)中，在室温下震荡孵育10min后，离心收集上清液并合并。

三、糖肽的检测：

取1μL上述所收集的上清液，滴加于MALDI靶板上，待其自然风干后，滴加一定量(1μL)的DHB基质(25mg/mL 2,5-二甲基苯甲酸，乙腈/水/磷酸，70:29:1，v/v/v)，待其挥发结晶后，进行MALDI-TOF MS分析。

同时，取一定量(1μL)的步骤(12)中组2溶液，滴加于MALDI靶板上，待其自然风干后，滴加一定量(1μL)的DHB基质(25mg/mL 2,5-二甲基苯甲酸，乙腈/水/磷酸,70:29:1,v/v/v)，待其挥发结晶后，作为空白对照，进行MALDI-TOF MS分析。

结果如附图7所示，通过对比富集前的空白对照样品与富集后洗脱液的质谱图结果，表明本发明提供功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料对HRP胰蛋白酶酶切肽段中的糖肽具有特异性富集性能。在未对样品进行富集的情况下，其MALDI-TOF MS的图谱上，仅能鉴定到5条糖肽，并且出现大量的高丰度非糖肽信号。而在使用功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料对样品进行糖肽富集的情况下，其MALDI-TOF MS的图谱上，能鉴定到多达23条糖肽，并且大量的高丰度非糖肽信号被去除。因此，该结果表明本发明提供的功能化二硫化钼-纳米贵金属复合材料对糖基化肽段的富集有着优异的性能。