法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-01-24
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N 5/071 专利号:ZL2018101471202 申请日:20180212 授权公告日:20200310
专利权的终止
2020-03-10
授权
授权
2018-06-15
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N5/071 申请日:20180212
实质审查的生效
2018-05-22
公开
公开
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种内皮祖细胞提取分离培养方法，特别是涉及一种来源为胎鼠的内皮祖细胞的提取、分离和培养方法。
背景技术
内皮祖细胞(ENDOTHELIAL PROGENITOR CELLS，简称“EPCS”)是血管内皮前体细胞，能定向分化为成熟的内皮细胞，亦称血管母细胞。机体缺血时，EPCS可从骨髓中动员进入外周血，到达缺血组织参与血管新生。把体外培养和扩增的EPCS输入体内，提高循环中EPCS的数量和质量，可促进缺血部位的血管新生。因此，EPCS移植成为了治疗缺血性血管疾病的一条新思路。
对于内皮祖细胞的提取，文献报道的主要是采集脐带血或出生后不同年龄的动物骨髓、外周血，通过密度梯度离心法获取单个核细胞，然后接种于特殊物质包被的培养瓶或培养皿中进行体外诱导培养。
内皮祖细胞临床应用的关键是探寻其理想的组织来源，但内皮祖细胞募集、分离和培养的方法存在较大差异，并且得到的内皮祖细胞数量少、扩增效率及细胞增殖较慢。而本发明采取新的来源途径提取内皮祖细胞，即采用胎鼠的肺组织为组织来源，为内皮祖细胞的提取分离、培养提供了一种新的切实可行的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胎鼠肺来源内皮祖细胞的提取分离培养方法，本发明的方法采用胎鼠的肺组织为内皮祖细胞的新来源，经提取、分离、培养获得内皮祖细胞。
本发明一种胎鼠肺来源内皮祖细胞的提取、分离培养方法，包括以下步骤：
(1)取胎鼠的肺脏，放入含有500U-1000U青霉素和链霉素双抗的预冷PBS中，并将肺组织破碎；
(2)用胰酶消化步骤(1)中的破碎组织；
(3)消化完后，用含FBS的DMEM培养基培养15-18H；
(4)然后取出非贴壁的细胞，离心，取其沉淀；
(5)将步骤(4)的沉淀用含生长因子和FBS的血清的EBM-2培养基悬起，以浓度接种于孔板中，置于恒温培养箱中培养；
(6)每2-4天换一次液，当原代细胞生长融合达80-90％时，用胰酶消化传代培养，持续传代直至细胞呈现均一形态即完成培养。
上述本发明的方法，所述胎鼠，其获得的方法包括：(1)将孕鼠麻醉后取出串珠样受孕子宫，放入含有500U-1000U青霉素和链霉素双抗的预冷PBS中浸泡；(2)将浸泡后的受孕子宫分离出连接胎鼠肚脐与胎盘的脐带组织后，胎鼠放入含有500U-1000U高强度青霉素和链霉素双抗的预冷PBS的平皿中，洗涤后得到胎鼠。
在具体实施方案中，本发明的一种胎鼠肺来源内皮祖细胞的提取分离培养方法通过以下实施方案实现，包括以下步骤：
(1)将孕鼠麻醉后取出取出串珠样受孕子宫，放入含有500U-1000U青霉素和链霉素双抗的预冷PBS中浸泡；
(2)将浸泡后的受孕子宫分离出连接胎鼠肚脐与胎盘的脐带组织后，胎鼠放入含有各500U-1000U的青霉素和链霉素双抗的预冷PBS的平皿中，洗涤；
(3)取出胎鼠的肺脏，放入含有500U-1000U青霉素和链霉素双抗的预冷PBS中，并将肺组织破碎；
(4)用0.25％胰酶消化步骤(3)中的破碎组织；
(5)消化完后，用含10％FBS的DMEM培养基培养16H；
(6)然后取出非贴壁的细胞，离心，取其沉淀；
(7)将步骤(6)的沉淀用含生长因子和2％FBS的血清的EBM-2培养基悬起，以106/ML细胞浓度接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养；
(8)每3天换一次液，当原代细胞生长融合达80-90％时，用0.25％的胰酶消化传代培养，持续传代直至细胞呈现均一形态即完成培养。
在上述实施方案中，本发明的方法，步骤(1)中，所述浸泡，浸泡时间为3-5分钟，所述孕鼠为孕龄达15-19天的孕鼠；步骤(2)中所述洗涤，其洗涤次数为2次；步骤(3)中所述破碎组织，破碎后的组织大小为0.5-1.0MM3；步骤(4)中所述胰酶消化是采用分步消化法，每步均置于37℃细胞培养箱中孵育10MIN，直至组织完全消化；步骤(6)中所述离心为1000RPM，5MIN。
在一具体实施方案中，一种胎鼠肺来源内皮祖细胞的提取、分离培养方法，包括以下步骤：
(1)将孕龄达15-19天的孕鼠，予10％水合氯醛麻醉，麻醉后立即放入75％消毒酒精中浸泡15分钟，移入细胞间，将孕鼠腹部朝上，四肢固定。
(2)用无菌眼科剪和镊子将孕鼠腹部表皮和粘膜层逐层剪开，取出串珠样受孕子宫，放入含有500U-1000U高强度青霉素和链霉素双抗的预冷PBS中浸泡，然后移入超净台。
(3)用眼科剪剪开子宫，除去羊水，剔净羊膜层，分离出连接胎鼠肚脐与胎盘的脐带组织，将胎鼠放入含有500U-1000U高强度青霉素和链霉素双抗的预冷PBS的平皿中，洗涤2次。
(4)用眼科剪和镊子小心取出胎鼠的肺脏，放入含有500U-1000U高强度青霉素和链霉素双抗的预冷PBS的平皿中，并将其逐个剪碎。
(5)用0.25％胰酶消化步骤(4)中的组织，采用分步消化法，每此均置于37℃细胞培养箱中孵育10MIN，直至组织完全消化。
(6)消化完后，用含10％FBS的DMEM培养基，培养16H。
(7)然后后取出非贴壁的细胞，1000RPM，5MIN，离心，取其沉淀。
(8)将步骤(7)中的沉淀用含生长因子和血清(2％FBS)的EBM-2培养基悬起，以106/ML细胞浓度接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
(9)以后每3天换一次液，当原代细胞生长融合达80-90％时，用0.25％的胰酶消化传代培养，持续传代直至细胞呈现均一形态，完成培养。
将本发明的方法培养得到的内皮祖细胞进行鉴定，鉴定方法如下：
1)内皮祖细胞形态学观察，
2)细胞免疫荧光鉴定EPCS表面标志:CD34、CD133、CD31、VEGFR-2抗原，
3)流式细胞术鉴定EPCS表面标志：CD34、CD133、CD31、VEGFR-2抗原，
4)激光共聚焦检测EPCS吞噬功能：摄取DIL-ACLDL及结合FITC-UEA-1能力，
5)EPCS体外官腔形成实验：基质胶。
将本发明的方法培养得到的内皮祖细胞进行生长增殖能力检测：如CCK8。
上述本发明的方法，其中，步骤(1)中孕鼠的孕龄以15-19天为宜，孕龄太小，胎鼠尚未成熟，其肺脏较小，分离较难；步骤(2)、(3)、(4)中由孕体内分离出来的子宫、胎鼠、肺组织宜放入含高强度双抗抗生素PBS中浸泡和洗涤：双抗青霉素和链霉素可应用的浓度均为500U-1000U，浸泡时间为5-10分钟；步骤(6)、(8)中，500U-1000U浓度的双抗不仅有效抑菌，而且对细胞没有任何副作用；
上述本发明的方法，步骤(4)中将肺组织剪碎至0.5-1.0MM3，组织块越小，胰酶消化越完全，接种后细胞爬出的效率越高；步骤(6)中将消化后的组织悬液均匀铺在孔板中，培养基少量为宜。培养基量多，细小组织块悬浮不易贴壁，大大降低原代细胞得率；
本发明的方法，建立了一种胎鼠肺来源内皮祖细胞的提取、分离、培养的方法。该方法具有以下6个方面的优势：
(1)简单易行，可操作性强；
(2)细胞的扩增效率高，组织贴壁24-48H后可见细胞爬出，一般生长8-12天可行原代消化。因胎鼠个体而异，细胞连续传至P5-P7代时形态表现均一，后经免疫表型、生长特点、多向分化等方面确证了本法分离培养获得的细胞为内皮祖细胞；
(3)细胞的增殖能力强，传至5代后仍然具有内皮祖细胞活性，维持增殖和分化能力，因此优选使用纯化后的细胞P2-P5代，可见实验中可供使用的细胞数量比较充足的；
(4)与目前广泛应用的骨髓、外周血、脐带血来源的内皮祖细胞提取、分离培养技术相比，胎鼠肺来源的内皮祖细胞的优点在于：分离方法易行，扩增效率高、增殖能力异常强、传代时间长，细胞量大；尤其在CCK8检测细胞增殖方面，胎鼠源内皮祖细胞的增殖活性明显高于骨髓源、外周血、脐带血来源的内皮祖细胞。
(5)为内皮祖细胞移植提供理想的新的细胞来源。
综上所述，本发明的一种胎鼠肺来源内皮祖细胞的提取、分离培养方法具有较大的应用前景和价值。
附图说明
图1分离培养得到的内皮祖细胞形态；
图2分离培养出的内皮祖细胞强表达CD34、CD133、CD31、VEGFR-2；
图3分离培养得到的内皮祖细胞的吞噬功能实验结果；
图4体外成管实验检测鉴定EPCS成管能力的结果，形成管腔样结构；
图5实施例2分离培养得到的肺、心、肝源内皮祖细胞1D形态。
具体实施方式
以下实例所使用的主要材料和来源分别如下：
清洁级SD大鼠(雌、雄)来自重庆医科大学实验动物中心，0.25％胰蛋白酶(AMRESCO公司)，自配磷酸盐缓冲液PBS，DMEM培养基购自HYCLONE公司，胎牛血清FBS购自GIBCO公司，细胞培养皿(直径10CM)、细胞培养6孔板购自CORNING公司；CD34、CD133、CD31、VEGF-R2、IGG-FITC及IGG-PE对照的流式抗体购自BD公司，碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒购自上海太阳生物公司，油红O同购自SIGMA公司。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。实例中未注明具体条件者，按照常规条件条件进行。
实施例1胎鼠肺来源内皮祖细胞的提取、分离、培养
实施步骤如下：
(1)于重庆医科大学实验动物中心购买健康的成年清洁级SD大鼠(雌/雄)，在大鼠发情期时，将2只雌鼠和1只雄鼠在同一鼠箱中过夜，翌日清晨检查雌鼠阴道口，肉眼见精液栓者表示受孕，并开始计算孕龄(第0天)。若检查阴性，则继续合笼直至检查阳性。
(2)将孕龄达15-19天的孕鼠，予10％水合氯醛麻醉，麻醉后立即放入75％消毒酒精中浸泡15分钟，移入细胞间，将孕鼠腹部朝上，四肢固定。
(3)用无菌眼科剪和镊子将孕鼠腹部表皮和粘膜层逐层剪开，充分暴露出受孕子宫，用眼科剪和镊子将串珠样子宫取出，放入含有500U-1000U高强度青霉素和链霉素双抗的预冷PBS中浸泡，然后移入超净台。
(4)用无菌眼科剪剪开子宫，除去羊水，剔净羊膜层，分离出连接胎鼠肚脐与胎盘的脐带组织，将每一只胎鼠(含胎盘，个数10-16不等)分离出来，将胎鼠放入含有500U-1000U高强度青霉素和链霉素双抗的预冷PBS的平皿中，洗涤2次。
(5)用眼科剪和镊子小心取出胎鼠的肺脏，放入含有500U-1000U高强度青霉素和链霉素双抗的预冷PBS的平皿中，并将其逐个剪碎至0.5-1.0MM3的细小组织块。
(6)用0.25％胰酶消化步骤(4)中的组织，采用分步消化法，每步均置于37℃细胞培养箱中孵育10MIN，直至组织完全消化。
(7)终止消化后，用含10％FBS的DMEM培养基，培养16H。
(8)16H后取出非贴壁的细胞，1000RPM,5MIN，离心，取其沉淀。
(9)向步骤(8)中的沉淀用含生长因子和血清(2％FBS)的EBM-2培养基悬起，以106/ML细胞浓度接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
(10)以后每3天换一次培养液，当原代细胞生长融合达80-90％时，用0.25％的胰酶消化传代培养，持续传代直至细胞呈现均一形态，完成培养。并做以下的鉴定或验证。
验证例1
本发明分离培养得到的内皮祖细胞形态学观察：
(1)采用实施例1方法分离的胎鼠肺来源内皮祖细胞：原代(P0代)细胞于组织贴壁24-48H后爬出，继续培养3-4天，倒置显微镜下观察可见细胞形态不均一，有长梭形、多角形，亦有圆形(见图1)；
(2)按照实施例1所述的传代方法，兼受胎鼠个体差异的影响，细胞传至P2-P2代时于倒置显微镜下观察，可见细胞呈现相对均一的长梭形。连续传至5代以上，细胞形态无明显改变(见图1)。
(3)胎鼠肺来源内皮祖细胞的形态学结果表明：本发明分离培养出的细胞具备内皮祖细胞的长梭形形态特点和贴壁生长、反复传代的特性。
验证例2
本发明分离培养得到的内皮祖细胞的免疫表型分析：
(1)选择实施例1方法分离传代获得的胎鼠肺来源内皮祖细胞(如P2代)，0.25％的胰酶消化后计数，按1×105/管分装为6管，PBS洗涤1次，再用50ΜL PBS重悬细胞沉淀；
(2)在每管中分别加入1ΜL相应的流式抗体：CD34、CD133、CD31、VEGFR-2、FITC-IGG、PE-IGG，4℃避光孵育30分钟；
(3)PBS洗涤1次，于流式细胞仪检测并分析。
(4)胎鼠肺来源内皮祖细胞的免疫表型分析结果表明：本发明分离培养出的细胞强表达CD34、CD133、CD31、VEGFR-2，符合内皮祖细胞的表面标记特点(见图2)。
验证例3
本发明分离培养得到的内皮祖细胞的吞噬功能分析：
(1)选择实施例1方法分离传代获得的胎鼠肺来源内皮祖细胞(如P2代)，0.25％的胰酶消化后计数，接种于载玻片上进行细胞爬片。
(2)予DIL-ACLDL及FITC-UEA-1孵育12H。
(3)激光共聚焦显微镜下观察荧光情况。
(4)胎鼠心脏血管内皮祖细胞吞噬功能分析结果表明：进行DIL-ACLDL、FITC-UEA-1的双荧光染色，在激光共聚焦显微镜下观察细胞，既能激发红色荧光又能激发绿色荧光，合成图为黄色荧光的即被认为是EPCS。红色荧光是AC-LDL阳性细胞，绿色为UEA-1阳性细胞，双阳性细胞为EPCS(如图3)。
验证例4
本发明分离培养得到的内皮祖细胞的管腔形成能力分析：
(1)选择实施例1方法分离传代获得的胎鼠肺来源内皮祖细胞(如P2代)，0.25％的胰酶消化后计数。
(2)予MATRIGL基质胶普板后接种细胞。
(3)胎鼠肺来源内皮祖细胞管腔形成能力分析结果表明：可见培养14天后的细胞可形成管腔样结构，符合内皮祖细胞的内皮特点(如图4)。
验证例5
本发明分离培养得到的内皮祖细胞的增殖能力分析：
(1)选择实施例1方法分离传代获得的胎鼠肺来源内皮祖细胞(如P2代)，0.25％的胰酶消化后用定量培养基重悬细胞沉淀，细胞计数并调整浓度为1×104/ML；
(2)取细胞悬液接种于96孔板内，每孔100ΜL，置于37℃恒温、5％CO2饱和湿度细胞培养箱中培养；
(3)每天取3孔细胞，每孔用定量的0.25％胰酶消化后分别行细胞计数，未消化的细胞每3天全量换液1次；
(4)连续计数3天，并绘制生长曲线图；
以上所述实例仅表达了本发明的几种较佳实施方法，其描述较为具体和详细，但本发明的保护范围并不以上述实施方法为限。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干的变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
实施例2胎鼠肺、心脏和肝源内皮祖细胞的提取分离培养比较
提取分离培养方法如下：
(1)取SD孕鼠，麻醉后立即用75％乙醇浸泡，移入细胞间，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。
(2)剖开腹部，小心取出子宫和胎鼠，移入超净台内，将胎鼠去除胎盘、羊水、羊膜等，将胎鼠置于有含双抗的预冷PBS的平皿中。
(3)PBS洗2次。小心取出胎鼠的心脏、肺脏、肝脏等脏器。
(4)将各脏器分类剪碎，各自用0.25％胰酶消化各组织碎片，采用分步消化法，直至组织完全。
(5)终止消化后，心脏、肺组织、肝脏来源的细胞均用含10％FBS的DMEM培养基培养16H。
(6)各自取出非贴壁的细胞，1000RPM，5MIN，离心。
(7)用含生长因子和血清(2％FBS)的EBM-2培养基以106/ML细胞浓度接种于6孔板中，置37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，分别得到心脏、肺组织、肝脏来源的内皮祖细胞。
培养获得的心脏、肺组织、肝脏来源的内皮祖细胞(EPCS)按验证例1的方法进行内皮祖细胞形态学观察。结果发现肝的最差,几乎不贴壁。从形态来看，肺源内皮祖细胞比较好，心脏的贴壁多,但是存在部分杂细胞，而心源的细胞形态和EPCs不太像，太长了一点，见图5，表明肺源内皮祖细胞最佳。
机译： 外周血来源的内皮祖细胞的分离培养方法
机译： 培养和保持纯净或富集的哺乳动物神经干细胞和/或神经祖细胞的培养方法，这些细胞容易分化为体外低聚体内皮细胞
机译： 脐带血间充质干/祖细胞的分离培养及其培养方法及脐带血间充质干/祖细胞的分化方法
