一种快速提取检测植物组织中牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸的方法

技术领域

本发明属于生化分析技术领域，具体涉及一种快速提取检测植物组织中牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的方法。

背景技术

GGPP是甲羟戊酸途径中产生的一类具有重要生物活性的类异戊二烯中间体，在细胞生长、分化、信号转导、抗炎、调节免疫、抗氧化等方面具有举足轻重的作用。在植物体内，GGPP是类胡萝卜素、赤霉素、维生素、叶绿素的前体，也是构建长链类异戊二烯的底物。作为生物样品的中间产物，GGPP多以离子形式存在，并在低浓度时稳定性较差，因此，迫切需要建立简便快速的样品提取和高灵敏度的检测分析方法。现有技术主要分为以下几类：1、将荧光多肽标记GGPP衍生化后通过高效液相色谱检测，方法适用于动物细胞或组织；2、同时采用四种不同的流动相(A：水/甲醇，95:5，v/v，5mM醋酸铵，8mM二甲胺；B：异丙醇/甲醇/水，65：30：5，v/v/v，5mM醋酸铵，8mM二甲胺；C：水/甲醇，95:5，v/v，5mM甲酸铵，0.1％甲酸；D：异丙醇/甲醇/水，65：30：5，v/v/v，5mM甲酸铵，0.1％甲酸)分离GGPP并质谱检测，该方法适用于血液样品；3、将GGPP去磷酸化成为醇，通过同位素标记并高效液相色谱检测，该方法适用于动物组织；4、将GGPP衍生化为醇，经气相色谱质谱联用仪检测，该方法应用于植物组织。

上述实验方法仅有一种对植物组织进行了验证，但样品处理步骤繁琐，容易造成目标物损失，且实验周期耗时长，无法实现高通量大规模检测。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种能够快速提取检测植物组织中的GGPP方法。本方法样品处理操作简单，检测速度快。

本发明所提供的快速提取检测植物组织中GGPP的方法，包括下述步骤：

1)用三元混合溶剂体系对植物组织进行提取，得到提取混合物；

2)对提取混合物进行离心处理，取上清液；

3)对上清液进行色谱分离并对分离得到的化合物进行质谱检测。

上述方法步骤1)中，所述三元混合溶剂体系为环己醇、甲醇、氨水的三元混合体系，其中，氨水的质量浓度可为28.0-30.0％；环己醇与甲醇、氨水的体积比依次可为7-14：8：3-6，具体可为7:4:3。

所述三元混合溶剂体系的混合顺序依次为甲醇、环己醇和氨水。

所述植物组织可为：任何植物的根、茎、叶、花、果实、种子，具体可为丹参毛状根。

所述提取中，三元混合溶剂体系与植物组织的配比可为400-450μL：17.5-22.5mg，具体可为427μL：19.65mg。

所述提取可为快速浸提。

所述提取的时间可为1-3min，具体可为1min。

在对植物组织进行提取前，还包括对植物组织进行预处理的操作。所述预处理的操作为：将植物组织干燥成干燥样品，再将干燥样品粉碎，得到植物组织干粉。

其中，所述干燥具体可为：先对植物组织进行速冻，再将速冻后的样品真空冷冻。

上述方法步骤2)中，所述离心通过高速离心机实现。

所述离心的条件为：12000-12700rpm/min离心10-30分钟。

上述方法步骤3)中，所述色谱分离采用2.1mm×100mm的Agilent ZORBAX Eclipseplus C18(RRHD)1.8μm反相柱，pH耐受范围为2.0-9.0。

所述色谱分离中采用二元流动相：A，1mM甲酸铵水溶液；B，乙腈/异丙醇，9:1，v/v。

所述流动相的流速可为0.2-0.4mL/min，具体可为0.3mL/min，柱温控制在25-40℃，具体可为35℃，进样量可为1-20μL，具体可为10μL。

所述色谱分离采用梯度洗脱。

其中，B％为运行过程中流动相B所占(A+B)体积总和的比例。

所述质谱检测采用Agilent高分辨质谱Q-TOF 6540进行检测，fragmentor电压可为120-135V，具体可为130V。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明采用的三元混合快速提取溶剂体系制备方法简单、易上手且采购成本低。2、本发明采用的三元混合快速提取溶剂体系在提取目标化合物GGPP时用时短，1分钟即可，最大程度地减少了样品的降解和损失。3、本发明采用的化合物分离及检测系统分离用时短、检测灵敏度低，10分钟即可给出化合物的分离色谱图及高分辨质量数，最大程度地保留了化合物本身的物理化学性质，减少了样品的降解和损失。

附图说明

图1为本发明快速提取检测植物组织中GGPP的流程示意图；

图2为本发明三元混合提取溶剂体系稀释标品GGPP为0.01mg/mL的质谱检测选择离子流色谱图EIC；

图3为本发明快速提取检测丹参毛状根中GGPP的选择离子流色谱图EIC；

图4为本发明快速检测GGPP标品的二级质谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。

如图1所示，本发明以植物组织——丹参毛状根为例(丹参毛状根培养参照文献[Li Bin,et al.Scientific Reports,2017,7:43320-43328.]第43325页Materials andMethods部分第三段)，首先用镊子将毛状根从培养基中取出，盛于2.0ml的Eppendorf管中，然后置于液氮中速冻，再将速冻后的样品置于真空冷冻干燥机中干燥24h。

在每个盛有毛状根干燥样品的管中加入一粒用无水乙醇清洗过的钢球(直径5mm)，然后用球磨仪(振动频率为30Hz)打磨30s使之成为干粉，备用。

配制三元混合提取溶剂体系：将甲醇、环己醇、氨水(浓度28.0-30.0％)按4:7:3的体积比依次加入2.0mL Eppendorf管中，充分混合。

取三元混合溶剂427μL，加入含样品干粉19.65mg的Eppendorf管中，充分混匀1分钟。

将上述混合悬浊液放入高速离心机中，12700rpm/min离心20分钟，取上清液，放入样品管。

色谱分离采用2.1mm×100mm的Agilent ZORBAX Eclipse plus C18(RRHD)1.8μm反相柱，pH耐受范围为2.0-9.0，流动相采用二元流动相：A，1mM甲酸铵水溶液；B，乙腈/异丙醇，9:1，v/v。流动相流速为0.3mL/min，柱温控制在35℃，进样量10μL。

化合物采用Agilent高分辨质谱Q-TOF 6540进行检测，fragmentor电压为130V。

表1为色谱分离使用流动相比例及时间分配。

表1色谱分离使用流动相比例及时间分配

注：B为有机流动相乙腈/异丙醇，9:1，v/v，A为1mM甲酸铵水溶液，B％为运行过程中流动相B所占(A+B)体积总和的比例。流动相流速为0.3mL/min，柱温35℃，进样量10μL。

如图3所示，结合质谱检测在7.12min出的峰对应的化合物为目标化合物。

本发明通过将甲醇、环己醇、氨水(浓度28.0-30.0％)依次按4:7:3的体积比混合为三元提取溶剂体系，对丹参毛状根干燥粉末进行1分钟快速浸提，高速离心后直接上样进行色谱分离并质谱检测，最大程度地减少因操作步骤繁琐带来的样品损失、降低了待测目标物GGPP的降解、提高了检测灵敏度(可达0.1ng/μL)，测得丹参毛状根中GGPP含量为13.53±0.43μg/g干粉，文献[Cui GH,et al.Plant Physiology,2015,169:1607-1618.]测得的GGPP含量为0.5±0.01μg/g干粉，由于其采用的是衍生化方法，样品有一定损失。

本发明采用市售GGPP标准品对快速提取检测植物组织中GGPP的方法进行了评价，实验结果表明，采用本发明的快速提取检测方法得到的质谱图(如图2所示)色谱峰尖锐，色谱柱理论塔板数达到12272.6，其二级质谱图如图4所示。本发明的快速提取检测方法用时短、样品制备简便、提取快速，方法易上手、可操作性强，最大程度地减少了待测物的损失和自降解，为测试类似结构的化合物提供了一个新的解决途径。

上述实施例仅用于说明本发明，其中用到的反相色谱柱、色谱分离条件、质谱检测器及其参数等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。