一株诱导大豆抗大豆胞囊线虫病的微杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一株诱导大豆抗大豆胞囊线虫病的微杆菌及其应用。

背景技术

大豆胞囊线虫病是由大豆胞囊线虫（Heterodera>）引起的病害，是一种世界性的大豆病害，对世界各国大豆种植区的产量都造成严重威胁，每年造成的损失超过10亿美元。该病分布广，危害重，胞囊存活时间较长，是一种极难防治的土传病害。我国大豆生产主要分布在东北和黄淮海两个产区，大豆受到胞囊线虫的为害后轻者减产20%-30%，重者可达70%-80%，甚至颗粒无收。

大豆胞囊线虫的防治主要有培育抗病品种，改良农业措施，化学防治，生物防治。培育抗病品种周期较长，改良种植方式可以减轻损失却也无法彻底控制大豆胞囊线虫，化学防治虽然有效，却因为其污染严重，破坏了生态平衡，无法长时间实施，微生物防治主要利用微生物对线虫的毒杀以及诱导植物产生抗病性，对植物和环境的影响较小，是未来大豆胞囊线虫防治的发展方向。

Microbacterium>是一种细菌界、厚壁菌门、放线细菌纲、放线细菌亚纲、放线菌目、微球菌亚目、微杆菌科中的一种革兰氏阳性菌。微杆菌是土壤的优势菌群之一，广泛分布于不同环境中，Microbacteriumarabinogalactanolyticum，Microbacterium keratanolyticum，Microbacterium luteolum，Microbacteriumschleiferi，Microbacterium terrae，Microbacteriumtrichothecenolyticum存在于土壤中，Microbacterium barkeri，Microbacteriumlaevaniformans多存在于污水中，Microbacterium arborescens存在于湖水中，Microbacteriumlacticum和Microbacteriumliquefaciens可在牛奶和奶酪中发现，Microbacterium>则是最早发现于海水和海泥中。微杆菌一般用于环境污染物分解，药物改性，生物脱硫等，关于微杆菌对植物病害防治作用的报道较少。Microbacterium>sp.对水稻百叶枯病有抑制作用；Microbacterium>对香蕉根腐线虫二龄幼虫具有极高的毒力；Microbacterium>对甜菜立枯病、蛇眼病、根腐病和褐斑病都具有较好的防治效果；但尚未有报道说明Microbacterium>在大豆胞囊线虫防治上的作用。

发明内容

为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提出一株诱导大豆抗大豆胞囊线虫病的微杆菌及其应用，对大豆胞囊线虫二龄幼虫的触杀和对大豆诱导抗胞囊线虫的效果上都表现出来突出的优势，具有良好的商业开发前景。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一株诱导大豆抗大豆胞囊线虫病的微杆菌及其应用，其技术要点为：诱导大豆抗大豆胞囊线虫病的微杆菌为Microbacterium>，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2015年11月03日，保藏编号：CGMCC No. 11566，分类命名：Microbacterium>。

所述的微杆菌Microbacterium>经培养皿培养后，通过常规液体发酵培养可获得诱导大豆产生抗胞囊线虫的发酵液，具体方法包括以下步骤：

（1）培养皿培养：

培养基配方为LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂粉5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0左右；

（2）液体发酵培养：

LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0左右，28-30℃培养24-48 h；

将步骤（1）得到的菌种接种至液体培养基中，28-30℃，转速175-200 rpm，48 h后可获得获得诱导大豆产生抗胞囊线虫的发酵液，菌量调至10⁸-10⁹CFU；

形成的发酵液或发酵制品可以直接或间接处理大豆种子，被处理的大豆种子可以减轻由于大豆胞囊线虫病害造成的危害，诱导大豆产生对胞囊线虫抗性。

进一步的，所述发酵液用作种子处理剂，具体方法为：大豆种子用0.5%次氯酸钠消毒5 min，无菌水冲洗5-10次；将发酵液与种子为1:70质量比进行种子包衣处理（即70克种子加入1克发酵液），阴凉处风干，可以诱导苗期大豆产生对胞囊线虫抗性。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种具有杀线活性的微杆菌，可以制成生物防治菌剂，用于杀死胞囊线虫二龄幼虫，并且可以诱导大豆产生抗性，同时经过种子处理的大豆可以对大豆胞囊线虫产生明显的抗病性，效果显著，不会破坏土壤环境，在防治大豆胞囊线虫危害上具有良好的应用前景。

具体实施方式

为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。

实施例1微杆菌Microbacterium>（菌株Sneb159）的培养

微杆菌Microbacterium>（菌株Sneb159）的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2015年 11月03日，保藏编号：CGMCC No. 11566。

微杆菌Microbacterium>Sneb159进行发酵培养，然后对发酵培养后的代谢产物进行大豆诱导活性试验，确定其对大豆的诱导作用。

（1）培养皿培养：

培养基配方为LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂粉5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0左右；

（2）液体发酵培养：

将上述菌种，挑取单菌落接种到250 mL三角瓶（每瓶装100 mL培养基）中的液体培养基中，培养基配方为：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，加蒸馏水至1000 mL，pH7.0左右。发酵温度为28-30℃，摇床转速为175 rpm-200 rpm，发酵时间为48 h，，菌量调至10⁸-10⁹CFU，得到发酵液。形成的发酵液或发酵制品可以直接或间接处理大豆种子，被处理的大豆种子可以减轻由于大豆胞囊线虫病害造成的危害。

实施例2微杆菌Microbacterium>Sneb159发酵产品杀胞囊线虫活性试验

（1）制备试验用制剂

按照实施1方法获得发酵产物，将发酵产物10,000 rpm，离心10 min，取上清液，通过0.22 μm无菌滤膜，除去菌体，收集过滤液得到处理后发酵液，备用。

（2）供试大豆胞囊线虫

大豆胞囊线虫采自沈阳农业大学北方线虫研究生后山试验基地。采用改良淘洗-过筛法从采集的土样中分离胞囊，在体式显微镜下挑选新鲜，饱满，成熟的胞囊。胞囊首先用0.5%次氯酸钠溶液消毒3 min，再用无菌水冲洗5次以上，彻底清除次氯酸钠为止，放在孵化池中加入浓度为3 mM硫酸锌溶液，25℃恒温箱培养，每日更换培养液收集二龄幼虫。

（3）室内杀胞囊线虫活性试验

将500 μL处理发酵液加入到1.5 mL离心管中，每个加入30-40条J2线虫悬浮液（10 μL），以清水为对照，每个处理重复三次，独立试验重复三次，分别在24 h和48 h观察线虫的死亡情况，计算死亡率，通过毛针刺激法判断死亡情况。试验结果如表1所示：

表1微杆菌对大豆胞囊线虫的杀虫活性

由表1可知，本发明在室内杀线虫活性试验中，Sneb159处理后的发酵液在24 h 和48 h死亡率分别达到89.2%和94.1%，而无菌水处理的对照组中死亡率分别为9.4%和13.4%，Sneb159对大豆胞囊线虫24 h和48 h的死亡率与对照组相比都是差异显著。

实施例3微杆菌Microbacterium>Sneb159防治大豆胞囊线虫室内盆栽效果试验

（1）试验制剂

按实施例1的方法制备Sneb159的发酵液备用。

（2）试验用大豆品种

辽豆15，种子销售市场购买。

（3）种子处理方法

大豆种子用0.5%次氯酸钠消毒5 min，无菌水冲洗5-10次。将制备好的发酵液与种子为1:70质量比（即70克种子加入1克发酵液）对种子包衣处理，阴凉处风干，备用。

（4）试验方法

采用盆栽处理，砂在干热灭菌锅中165℃，灭菌2 h，装入12x12 cm塑料钵中。将Sneb159包衣处理后的大豆种子播种到盛有无菌砂的塑料钵中，每盆一颗种子，待长出两片真叶后接种线虫，每盆接种1500条大豆胞囊线虫。以无菌水包衣的种子作为对照组。接种后第30天调查，轻柔地将豆苗整根挖出，保持根系完整性，调查根系上胞囊数，淘洗过筛法计数土中胞囊数，酸性品红染色调查根中线虫数量。

（5）试验结果

使用Sneb159种子处理后的大豆植株上的胞囊数量显著降低，根中线虫数显著低于对照，结果表明Sneb159对大豆胞囊线虫具有良好的防治效果。

表2 Sneb159种子处理对大豆胞囊线虫的防治效果

注：表中数据为平均数±标准误，同列数据后不同字母表示在P＜0.05水平差异显著（Duncan新复极差法）。