一种用于检测黄曲霉毒素AFB1的检测探针及黄曲霉毒素的检测方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，更具体地，涉及一种用于检测黄曲霉毒素AFB1的检测探针及黄曲霉毒素的检测方法。

背景技术

真菌毒素是由真菌产生的毒性次级代谢产物，对人和动物具有致癌、致畸致突变、中毒性肾损害、肝细胞毒性、免疫抑制和生殖紊乱等作用，给人和动物的生命健康带来巨大的隐患。其中黄曲霉毒素AFB1是由黄曲霉和寄生曲霉侵染粮食或食品而产生的具有毒性的次生代谢产物的总称，极易污染花生、玉米、油料种子、食用植物油及饲料，并会残留再被污染的组织中，其化学性质极其稳定、毒性最强，已被世界卫生组织列为已知的最强致癌化学物质。由于其具有痕量、剧毒、种类繁多、污染情形复杂等特点，造成人为控制的难度系数增加，同时也给实际检测带来很大难度，所以建立高效、快速的检测方法对于研究AFB1的污染状况，有效降低其危害具有重要意义。

传统的AFB1检测方法有薄层色谱法(TLC)、仪器分析法(高效液相色谱法-HPLC、液质联用法-GC/MS等)、免酶联免疫化学分析法(ELISA、IAC等)、电化学检测方法和表面增强拉面法等。然而这些方法在实际应用中存在各种不足之处，如：TLC法在检测过程中需要使用有毒试剂、操作步骤复杂、灵敏度不高、重现性差等，远远不能满足当前社会对AFB1的检测需求；HPLC法虽然简化了分析过程，克服了热不稳定性，但样品前处理复杂、检测时间长，限制其实际应用；GC/MS法可以对AFB1进行定量和定性分析，但是设备复杂、操作繁琐，对操作者的专业操作水平高；免酶联免疫化学分析法在实际操作中，由于固相载体的包被在各个体之间很难达到一致，因此在进行定量测定中，每批样品检测均须用同一批次不同浓度的标准样品在同一的操作条件下制作标准曲线，不能交叉使用不同批次的酶联免疫试剂盒，导致检测成本高，同时因为酶具有不稳定性，所以用此方法易出现假阳、阴性结果、检测灵敏度不高并且需要制备特异性抗体，步骤繁琐（包被、孵育及洗脱等），检测时间长。近年来，荧光分析法因其检测灵敏度高、选择性强、使用便捷等特性而被广泛关注。但传统的荧光分析法检测AFB1需要对探针进行双标记，既需要荧光基团，又需要猝灭基团或辅助基团，增加检测成本、降低检测的可靠性。

因此，研究一种检测成本低、可靠性高、检测时间短的检测方法具有重要的研究意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中AFB1检测方法检测成本高、可靠性低、检测时间长的缺陷和不足，提供一种用于检测黄曲霉毒素的检测探针。本发明提供的检测探针为免标记探针，探针设计简单、应用成本低、操作简单，检测限低至0.08 μg/L，特异性强，可广泛应用于理想缓冲溶液体系和实际样本。

本发明的另一目的在于提供上述检测探针在检测黄曲霉毒素AFB1中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种黄曲霉毒素AFB1的检测方法。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测黄曲霉毒素AFB1的检测探针，所述探针包括具有如SEQ ID NO：1所示序列的核酸适配体和如式（Ⅰ）所示的聚集诱导发光分子AIE；

。

具体地，该核酸适配体的序列为：

5’-GTT CGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-3’。

本发明提供的探针基于四苯乙烯盐(TPE-Z)的聚集诱导发光特性，将AFB1的核酸适配体与TPE-Z通过静电作用力结合，形成稳定的复合物。在无AFB1存在时，TPE-Z处于分散状态，荧光猝灭；在有AFB1存在时，AFB1的核酸适配体与AFB1结合，形成双链结构，此时TPE-Z处于聚集状态，荧光恢复。通过监测荧光信号变化，判断样品中AFB1的含量。

本发明提供的检测探针为免标记探针，探针设计简单、应用成本低、操作简单，检测限低至0.08 μg/L，特异性强，可广泛应用于理想缓冲溶液体系和实际样本（葡萄酒、咖啡、牛奶）。

上述检测探针在检测黄曲霉毒素AFB1中的应用也在本发明的保护范围内。

优选地，所述应用为检测探针在葡萄酒、咖啡、牛奶样品中检测黄曲霉毒素AFB1。

一种黄曲霉毒素的检测方法，包括如下步骤：

S1：向待测液中添加权利要求1中所述核酸适配体、AIE和缓冲溶液得反应液；所述反应液中核酸适配体的浓度不小于5.0×10^-7>

S2：所述反应液于25~37℃反应后，根据荧光检测时的荧光强度即可测得黄曲霉毒素AFB1的含量。

本发明提供的方法可实现黄曲霉毒素AFB1的快速检测（检测时间约为60min），可靠性高，成本低。

优选地，所述反应液中核酸适配体的浓度为5.0×10^-7>-5>mol/L。

优选地，所述缓冲溶液为磷酸(PBS)缓冲溶液。

优选地，所述缓冲溶液的pH为7.47±0.5。

更为优选地，所述PBS溶液的pH为 7.47，包括2.5 mM MgCl₂和0.5>2。

优选地，S1中待测液和所述检测探针在混合前还包括所述检测探针于90~95 ℃下加热3~5 min的步骤。

优选地，S1中反应的温度为30 ℃。

优选地，S1步骤前还包括所述核酸适配体于90~95 ℃下，加热3~5 min，冷却的步骤。

更为优选地，所述加热的温度为95 ℃，时间为4min。

优选地，所述荧光检测的激发波长为350 nm ，发射波长扫描范围400~ 650nm。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的检测探针为免标记探针，探针设计简单、应用成本低、操作简单，检测限低至0.08 μg/L，特异性强，可广泛应用于理想缓冲溶液体系和实际样本（葡萄酒、咖啡、牛奶）。

附图说明

图1是实施例1提供的探针检测黄曲霉毒素AFB1的原理图；

图2是黄曲霉毒素AFB1对溶液荧光强度的影响图；

图3是不同反应时间的荧光强强度与零时刻荧光强度比值图；

图4是不同温度的黄曲霉毒素AFB1荧光强度检测结果；

图5是不同浓度的黄曲霉毒素AFB1荧光强度检测结果；

图6是实施例1提供的探针检测葡萄酒溶液中黄曲霉毒素AFB1荧光强度图；

图7是实施例1提供的探针检测咖啡溶液中黄曲霉毒素AFB1荧光强度图；

图8是实施例1提供的探针检测婴幼儿奶粉中黄曲霉毒素AFB1荧光强度图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料，试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种用于检测黄曲霉毒素AFB1的检测探针，包括具有如下序列：GTT CGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA C的核酸适配体（黄曲霉毒素AFB1的核酸适配体）和聚集诱导发光分子AIE。

对本实施例提供的检测探针用于检测黄曲霉毒素的检测条件探索如下：

（1）探索黄曲霉毒素AFB1的影响

以商业购买的黄曲霉毒素AFB1为待测物，配制1g/L溶液。取2个1.5 mL离心管，向第1个离心管中，加入四苯乙烯盐（TPE-Z）、黄曲霉毒素AFB1的核酸适配体(AFB1 aptamer)和PBS缓冲溶液；向第2个离心管中，加入四苯乙烯盐（TPE-Z）、黄曲霉毒素AFB1的核酸适配体(AFB1 aptamer)、8 μg/L的黄曲霉毒素AFB1和PBS缓冲溶液。在室温下（25~35 ℃）反应90分钟后立即测量荧光值。2个离心管中的反应总体积均为200 μL，四苯乙烯盐（TPE-Z）的终浓度均为2.5×10^{-5>mol/L、黄曲霉毒素AFB1的核酸适配体的终浓度均为5.0×10-7>mol/L。其荧光光谱测量条件为：电压是600>}

图1是实施例1提供的方法检测黄曲霉毒素AFB1的原理图。

图2是实施例1中黄曲霉毒素AFB1对溶液荧光强度的影响图。从图中可以看出，在引入黄曲霉毒素AFB1后，其荧光强度大幅增强，说明本方法可用于定量检测黄曲霉毒素AFB1。

（2）探索反应时间的影响

取9个离心管，分别加入四苯乙烯盐，四根管都分别加入黄曲霉毒素AFB1的核酸适配体、8 μg/L的黄曲霉毒素AFB1和PBS缓冲溶液。在在室温下（25~35 ℃）下，在转速为500 rpm/min下反应0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、45 min、60 min后，测其荧光。9个离心管中的反应总体积均为200 μL，四苯乙烯盐（TPE-Z）的终浓度均为2.5×10^-5>-7>

图3是实施例1中反应时间对黄曲霉毒素AFB1检测的影响图。从图中可以看出，随着反应时间的增加，溶液的荧光强度逐渐增加，当反应时间为60 min时，溶液的荧光强度最大并趋于稳定。说明本方法用于定量检测黄曲霉毒素AFB1时，60 min为最佳反应时间。

（3）探索反应温度的影响

取4个离心管，加入四苯乙烯盐，黄曲霉毒素AFB1的核酸适配体、1.6×10^{-6>mol/L的黄曲霉毒素AFB1和PBS缓冲溶液。分别放在4 ℃、16 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃的避光处，反应60 min后，检测其荧光。4个离心管中的反应总体积均为200 μL，四苯乙烯盐（TPE-Z）的终浓度均为2.5×10-5>-7>mol/L。其荧光光谱测量条件为：电压是600>}

图4是实施例1中反应温度对黄曲霉毒素AFB1检测的影响图。从图中可以看出，随着反应温度的增加，溶液的荧光强度逐渐增加，当反应温度为30 ℃时，溶液的荧光强度最大。说明本方法用于定量检测黄曲霉毒素AFB1时，30 ℃为最佳反应温度。

从上述测试可以看出，本方法应用于黄曲霉毒素AFB1检测时，最佳检测条件为：反应温度30 ℃、反应时间60 min、电压是600 v，激发波长为350 nm，发射扫描范围为：400 ~ 65 0 nm。

（5）探索本方法对AFB1检测的灵敏度

取6个1.5mL离心管，向其中加入等浓度黄曲霉毒素AFB1的核酸适配体和四苯乙烯盐，再加入不同浓度梯度的黄曲霉毒素AFB1溶液和PBS缓冲溶液（黄曲霉毒素AFB1的浓度由低到高分别为：0 μg/L、0.08 μg/L、0.4 μg/L、0.8 μg/L、4 μg/L、8 μg/L），四苯乙烯盐的终浓度均为2.5×10^{-5>mol/L、黄曲霉毒素AFB1的核酸适配体的终浓度均为5.0×10-7>mol/L）。反应条件和测试条件与步骤一中反应条件和测试条件相同。}

图5是不同浓度的黄曲霉毒素AFB1荧光强度检测结果。从图中可以看出，随着黄曲霉毒素AFB1浓度的增加，四苯乙烯盐的荧光强度逐步增强。该方法检测黄曲霉毒素AFB1的检测限为0.08 μg/L。

实施例2

利用实施例1提供的探针可检测葡萄酒中黄曲霉毒素AFB1，并按实施例1得到的最佳检测条件进行测试。具体如下。

步骤一：取超市购买的葡萄酒5 mL，4 ℃静置1星期。取上层清液离心(10000 rpm/min)，离心5分钟后，取上层清液，并用13 μm的滤头过滤。

步骤二：取5份步骤一中葡萄酒，分别添加5 μL（0 μg/L、2.5 μg/L、5μg/L）的黄曲霉毒素AFB1，再加入PBS缓冲溶液。反应条件和测试条件与实施例1步骤一中反应条件和测试条件相同。

图6为向葡萄酒溶液中加入不同浓度的黄曲霉毒素AFB1荧光强度检测结果。

实施例3

利用实施例1提供的探针可检测咖啡中黄曲霉毒素AFB1。具体如下。

步骤一：取超市购买的咖啡，取100 mg溶于100 mL超纯水中，4 ℃静置1星期。取上层清液离心(10000 rpm/min)，离心5分钟后，取上层清液，并用13 μm的滤头过滤。

步骤二：取5份步骤一中咖啡溶液，分别添加5 μL （0 μg/L、2.5 μg/L、5μg/L）的黄曲霉毒素AFB1，再加入PBS缓冲溶液。反应条件和测试条件与实施例1步骤一中反应条件和测试条件相同。

图7为向咖啡溶液中加入不同浓度的黄曲霉毒素AFB1荧光强度检测结果。

实施例4

利用实施例1提供的探针可检测奶粉中黄曲霉毒素AFB1。具体如下。

步骤一：取超市购买的婴幼儿奶粉，取100 mg溶于100 mL超纯水中，4 ℃静置1星期。取上层清液离心(10000 rpm/min)，离心5分钟后，取上层清液，并用13 μm的滤头过滤。

步骤二：取5份步骤一中牛奶溶液，分别添加5 μL （0 μg/L、2.5 μg/L、5 μg/L）的黄曲霉毒素AFB1，再加入PBS缓冲溶液。反应条件和测试条件与实施例1步骤一中反应条件和测试条件相同。

图8为向婴幼儿奶粉中加入不同浓度的黄曲霉毒素AFB1荧光强度检测结果。

序列表

<110>岭南师范学院

<120>一种用于检测黄曲霉毒素AFB1的检测探针及黄曲霉毒素的检测方法

<160>1

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>50

<212>DNA

<213>1(1)

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