AtFKBP15基因在调控拟南芥侧根生长中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种AtFKBP15基因在调控拟南芥侧根生长中的应用。

背景技术

从土壤中吸收水分和营养以及锚定是植物根系的两大基本功能。正常的根系形态建成对于执行这两项基本功能是必不可少的。植物的根系是由主要是由胚胎中的胚根发育而来，在幼苗发育过程中，胚根具有强大的分生能力，胚根根尖的分生组织分化生长使胚根形成主根，远离根尖的部分会脱分化再次获得分生能力，分化生长形成侧根，侧根上又可以再次产生侧根，如此下去最终在很小的土壤范围内形成含有包括主根和多级侧根在内的根系统。

植物对水分无机盐的吸收能力也在很大程度上取决于侧根发育状况。水稻是典型的嗜硅作物，对硅需求量较大，硅可以增强叶片坚韧性，可以明显提高水稻抗性。无侧根突变体RM109中，水稻对硅的吸收速度明显下降，相对应的，硅在水稻表皮的沉积也明显变少。随着维管束的出现以及对阳光的需求使部分植物地上部分长得非常大，巨大的地上部分需要强大的根系支撑，占根系大部分的侧根对于支撑地上部分具有十分重要的作用。我国新疆达坂地区是著名的风谷，常年大风天气。为了稳固植株，此地区的植物根系发达，侧根分布特别。以霸王为例，成年霸王植株根系分布明显不对称，迎风面侧根的生长状态(侧根数目、侧根直径、侧根长度和根幅)明显优于背风面。说明为了抵抗大风，霸王侧根的生长发生了明显的适应性调整。拟南芥突变体axr4-2具有较少的侧根，植株也普遍小于野生型。在抗拉力测试中，突变体axr4-2的抗拉力能力明显小于野生型，并且具有相同抗拉力的突变体axr4-2和野生型中，突变体axr4-2的抗拉力最强的单根要强于野生型中的。

免疫亲和素家组蛋白普遍存在于植物中，具有顺反异构酶活性，能够催化脯氨酸残基参与的肽键的顺反异构化。植物细胞免疫亲和素作为分子伴侣诱导富含脯氨酸残基的蛋白质的折叠、翻译后修饰及蛋白质细胞定位，从而调控植物生长发育。已有研究表明，有多个免疫亲和素蛋白对植物的侧根有调控作用。拟南芥CYP71的突变体表现出顶端分生组织活性减弱，侧生器官发生缓慢且畸形。番茄中编码CYP的DGT基因突变之后出现生长素相应相关的多效性表型，如向重力性反应迟缓、侧根缺失、降低顶端优势和减少结实率等。水稻CYP2的突变体表现出侧根缺失和划分发育受阻等表型，进一步的结果显示CYP2和SGT1一起通过调控IAA蛋白的降解参与水稻生长素信号调节水稻侧根发生和花粉发育过程。

上述结果表明，植物免疫亲和素家族在植物生长发育(特别是根系发育)方面起着重要的调节作用，其相关的作用机制和信号转导途径可能受到植物激素的调控。为了进一步研究免疫亲和素在调控植物生长发育方面的作用，需要对相关信号转导途径的调控网路进行功能基因的发掘和验证工作。

基于以上研究背景，我们通过突变体筛选调控拟南芥侧根生长发育重要功能蛋白，为拟南芥侧根生长发育基因功能研究提供新的思路。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种AtFKBP15基因在调控拟南芥侧根生长中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种AtFKBP15基因在调控拟南芥侧根生长中的应用，所述AtFKBP15基因包括AtFKBP15-1、AtFKBP15-2。

优选地，所述应用包括：采用基因工程方法，将AtFKBP15基因敲除或突变，抑制其表达。

优选地，所述AtFKBP15-1、AtFKBP15-2编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

优选地，所述AtFKBP15-1、AtFKBP15-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示。

优选地，所述突变包括：在AtFKBP15-1、AtFKBP15-2编码蛋白质的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸；或在AtFKBP15-1、AtFKBP15-2的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸。

优选地，所述应用包括：采用基因工程方法，将在AtFKBP15-1的启动子区插入T-DNA；在AtFKBP15-2的第四外显子区插入T-DNA。

本发明还提供了一种调控拟南芥侧根生长的方法，采用基因工程方法，将前述的AtFKBP15基因基因敲除或突变，抑制其表达，即可；

所述AtFKBP15基因包括AtFKBP15-1、AtFKBP15-2。

优选地，所述AtFKBP15-1、AtFKBP15-2编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

所述AtFKBP15-1、AtFKBP15-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

优选地，采用基因工程方法，将在AtFKBP15-1的启动子区插入T-DNA；在AtFKBP15-2的第四外显子区插入T-DNA。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明首次发现AtFKBP15-1、AtFKBP15-2基因具有调控拟南芥侧根发育的功能，由于侧根的发育对于植物生长发育及作物的稳产高产是必不可少的，因此在分子育种中存在较大的应用潜力。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是AtFKBP15-1、AtFKBP15-2的突变体单株PCR鉴定电泳和T-DNA插入位置；

其中，A：分别使用引物对SALK_035550P1，SALK_035550P2和SALK_035550P1，LBb1.3对所购买拟南芥突变体植株AtFKBP15-1进行PCR检测的电泳结果，其中泳道2，3，4代表植株编号，WT1，WT2代表野生型拟南芥，M代表DL2000 DNA Marker；B：分别使用引物对SALK_113542P1，SALK_113542P2和SALK_113542P1，LBb1.3对所购买拟南芥突变体植株AtFKBP15-2进行PCR检测的电泳结果，其中泳道1，2，7，8代表植株编号，WT1，WT2代表野生型拟南芥，M代表DL2000 DNA Marker；C：AtFKBP15-1的突变体T-DNA插入位置；D：AtFKBP15-2的突变体T-DNA插入位置；

图2是双突变体atfkbp15-1/atfkbp15-2的单株PCR鉴定；

其中，A：分别使用引物对SALK_035550P1，SALK_035550P2和SALK_035550P1，LBb1.3对杂交所得F2植株进行PCR检测电泳结果；其中泳道1，9，45，50，71代表F2植株编号，WT1，WT2代表野生型拟南芥，M代表DL2000 DNA Marker；B：分别使用引物对SALK_113542P1，SALK_113542P2和SALK_113542P1，LBb1.3对杂交所得F2植株进行PCR检测电泳结果；其中泳道1，9，45，50，71代表F2植株编号，WT1，WT2代表野生型拟南芥，M代表DL2000 DNA Marker；

图3是单突变体atfkbp15-1中AtFKBP15-1的表达量；

图4是单突变体atfkbp15-1，atfkbp15-2和双突变体atfkbp15-1/atfkbp15-2表型；

其中，A：单突变体atfkbp15-1，atfkbp15-2和双突变体atfkbp15-1atfkbp15-2表型；B：单突变体atfkbp15-1，atfkbp15-2和双突变体atfkbp15-1/atfkbp15-2的侧根统计。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。

下述实施例中的定量检测，实验重复三次，结果取平均值。

实施例1、突变体的鉴定

订购拟南芥AtFKBP15-1和AtFKBP15-2的突变体SALK_035550和SALK_113542(http://www.arabidopsis.org.uk/)。播种后单株提取叶片DNA并PCR鉴定突变体的T-DNA插入位点是否纯合。

鉴定引物如下：

SALK_035550P1(SEQ ID No:5)：ATACATAACAGGTTGAAGCATAGTG

SALK_035550P2(SEQ ID No:6)：AAATAGCGTTTTGTCTCACCTTA

SALK_113542P1(SEQ ID No:7)：TTGATTGTGCTGTGTTCTGTTTT

SALK_113542P2(SEQ ID No:8)：GTACTGTGTAATTTGCTTTGGCTA

LBb1.3(SEQ ID No:9)：ATTTTGCCGATTTCGGAAC

PCR扩增体系共20μl，其中模板DNA 1μl，Taq酶0.5μl，10×PCR buffer 2μl，dNTPs0.5μl，上下游引物各1μl(10μM)，加ddH₂O补齐至20μl。温度程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。反应结束之后，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，获得P1和P2引物组合扩增结果为阴性，P1和LBb1.3引物组合扩增结果为阳性的株系，为T-DNA插入纯合株系。

如图1所示，突变体SALK_035550中获得3株纯合突变体atfkbp15-1，突变体SALK_113542中获得4株纯合突变体atfkbp15-2，后续表型鉴定均使用这些纯合株系。将P1和LBb1.3引物组合扩增产物送测序，根据测序结果确定T-DNA在基因组上的具体插入位置，如图1C和图1D所示，突变体atfkbp15-1中纯合单株的T-DNA插入在AtFKBP15-1启动子区，突变体atfkbp15-2中纯合单株的T-DNA插入在AtFKBP15-2第四外显子。所述AtFKBP15-1编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述AtFKBP15-2编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所得突变体中atfkbp15-1、atfkbp15-2的核苷酸序列参见

http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress？JOB＝TEXT&TYPE＝DATA&QUERY＝SALK_035550.40.10.x和

http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress？JOB＝TEXT&TYPE＝DATA&QUERY＝SALKseq_113542.0中的记载。

实施例2、单突变体杂交获得双突变体

为了获得双突变体植株atfkbp15-1/atfkbp15-2，需要将鉴定得到的纯合atfkbp15-1和atfkbp15-2单突变体杂交，经繁殖鉴定，得到双突变体。具体步骤如下：

第一天下午，选取生长旺盛刚开花的拟南芥植株，用尖头镊子剥开母本植株未开花的花苞，除去萼片、花瓣、雄蕊，留下雌蕊，仔细观察，确保柱头干净。

第二天上午，取刚绽放的父本花朵，用其雄蕊反复涂抹母本的雌蕊柱头，使柱头表面沾上黄色花粉。

两天后，如果雌蕊明显伸长变粗，代表杂交成功。果荚变黄成熟后，小心收集F1代种子。

得到F1代种子之后，继续繁殖得到F2代种子，播种后单株提取叶片DNA并PCR鉴定两个T-DNA插入位点是否纯合(具体方法参考实施例1)，选择两个T-DNA插入位都是纯合的单株。

如图2所示，共获得5株纯合双突变atfkbp15-1/atfkbp15-2，后续表型鉴定均使用这些株系。

实施例3.鉴定单突变体atfkbp15-1中AtFKBP15-1的表达量

由于单突变体atfkbp15-1中纯合单株的T-DNA插入在AtFKBP15-1启动子区，所以有必要采用定量PCR方法分析单突变体atfkbp15-1中AtFKBP15-1的表达量。

抽提单突变体atfkbp15-1的RNA：

采用天根生化科技(北京)有限公司的植物总RNA提取试剂盒提取RNA，具体操作步骤见试剂盒说明书。

cDNA的合成和荧光定量PCR分析：

将RNA反转录为cDNA：采用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit withgDNA Eraser反转录试剂盒将RNA反转成cDNA，具体操作步骤见试剂盒说明书。

荧光定量PCR分析：根据AtFKBP15-1基因的编码序列(coding sequence，CDS)设计特异性引物用于荧光定量PCR，序列如下：

FKBP15-1RT F(SEQ ID No:10)：GGATGGGACCAGGGTTTATTG

FKBP15-1RT R(SEQ ID No:11)：CAAGCTTGGATGGGATTTTCA

采用UBQ基因作为内参，根据UBQ基因序列设计特异性引物，序列如下：

RT-UBQ10-1(SEQ ID No:12)：CTCAGGCTCCGTGGTGGTATG

RT-UBQ10-2(SEQ ID No:13)：GTGATAGTTTTCCCAGTCAACGTC

采用TaKaRa公司的Premix Ex TaqTM II试剂盒进行荧光定量PCR，具体操作步骤见试剂盒说明书。使用EXCEL软件进行数据分析，分析采用方法为2^(-ΔΔCt)。

结果表明，如3图所示，相比野生型(Col-0)，单突变体atfkbp15-1中AtFKBP15-1的表达量明显下降，表达量只有野生型中的24％，说明单突变体atfkbp15-1中AtFKBP15-1的表达量被明显抑制了。

实施例4.单突变体atfkbp15-1，atfkbp15-2和双突变体atfkbp15-1/atfkbp15-2表型分析

使用10％次氯酸钠将野生型拟南芥和单突变体atfkbp15-1，atfkbp15-2和双突变体atfkbp15-1/atfkbp15-2的种子表面灭菌后，铺在1/2MS固体培养基上，竖直摆放在人工气候室中培养，恒温22℃，光照周期为长日照(16h光+8h暗)。光照强度约为120mol m^-2s^-1。

培养5天后，拟南芥幼苗侧根尚未长出，此时选取生长状态一致的拟南芥幼苗，以1cm间隔将其转移到新的1/2MS固体培养基上，竖直摆放在人工气候室中培养，恒温22℃，光照周期为长日照(16h光+8h暗)。光照强度约为120mol m^-2s^-1。

培养7天后，统计侧根数。

如图4所示，相比野生型，单突变体atfkbp15-1，atfkbp15-2的侧根数量没有明显变化，但是双突变体atfkbp15-1/atfkbp15-2的侧根数量明显多于野生型，并且具有统计学意义(P≤0.01)。说明ATFKBP15-1和ATFKBP15-2能共同调控拟南芥侧根生长，且将ATFKBP15-1和ATFKBP15-2同时突变后可显著促进侧根的生长，增加侧根数量。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> AtFKBP15基因在调控拟南芥侧根生长中的应用

<130> DAG37595

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 462

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatgagct ctgcatccgc catgaaagct gttggatttt tgcttctgct taccattcta 60

acattagctt atgcgaagaa gtcaggtgat gtgacagagt tgcagattgg tgttaagtac 120

aagcctcaga aatgtgatct ccaggctcac aaaggggata agatcaaggt tcactatcgg 180

ggaaagttaa ctgatggaac tgtctttgat tcaagttttg agagaggtga ccctattgag 240

tttgagcttg gaactggtca agtcatccca ggatgggacc agggtttatt gggagctcgt 300

gtaggtgaga agagaaagtt gaaaatccca tccaagcttg gttatggtga taacggctca 360

ccaccaaaaa tcccgggtgg ggcgacactg atattcgaca ccgagcttgt tgctgtgaac 420

ggagaaccat ccagcgaagc gaaatcaaag aatgagcttt ga 462

<210> 2

<211> 492

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcgagca agatgagtct ccgttactct ctctttttga tcttcttctc tctcatttca 60

ctccaaggtt ttgccaagaa gaccggagat gtgtcggaat tgcagatcgg tgtcaagttt 120

aagccaaaaa catgtgaagt tcaggctcac aaaggtgata cgatcaaggt gcactatagg 180

gggaaactta ctgatggaac tgtattcgat tcgagttttg aaaggggtga tccgtttgag 240

tttaaattag gaagtggtca ggttatcaaa ggttgggatc aaggtttgct aggagcgtgt 300

gtaggtgaga agaggaagtt aaagatacct gctaaacttg gatatggaga acaaggctct 360

ccacctacta tccccggtgg tgcaacactg atctttgaca cagagcttat tgcggtaaat 420

gaaaaaccag ctggtggtga agaatacgga ggggataaag atgatgaggg atatggaaat 480

gacgagctat ga 492

<210> 3

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Met Ser Ser Ala Ser Ala Met Lys Ala Val Gly Phe Leu Leu Leu

1 5 1015

Leu Thr Ile Leu Thr Leu Ala Tyr Ala Lys Lys Ser Gly Asp Val Thr

202530

Glu Leu Gln Ile Gly Val Lys Tyr Lys Pro Gln Lys Cys Asp Leu Gln

354045

Ala His Lys Gly Asp Lys Ile Lys Val His Tyr Arg Gly Lys Leu Thr

505560

Asp Gly Thr Val Phe Asp Ser Ser Phe Glu Arg Gly Asp Pro Ile Glu

65707580

Phe Glu Leu Gly Thr Gly Gln Val Ile Pro Gly Trp Asp Gln Gly Leu

859095

Leu Gly Ala Arg Val Gly Glu Lys Arg Lys Leu Lys Ile Pro Ser Lys

100 105 110

Leu Gly Tyr Gly Asp Asn Gly Ser Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Ala

115 120 125

Thr Leu Ile Phe Asp Thr Glu Leu Val Ala Val Asn Gly Glu Pro Ser

130 135 140

Ser Glu Ala Lys Ser Lys Asn Glu Leu

145 150

<210> 4

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Ser Lys Met Ser Leu Arg Tyr Ser Leu Phe Leu Ile Phe Phe

1 5 1015

Ser Leu Ile Ser Leu Gln Gly Phe Ala Lys Lys Thr Gly Asp Val Ser

202530

Glu Leu Gln Ile Gly Val Lys Phe Lys Pro Lys Thr Cys Glu Val Gln

354045

Ala His Lys Gly Asp Thr Ile Lys Val His Tyr Arg Gly Lys Leu Thr

505560

Asp Gly Thr Val Phe Asp Ser Ser Phe Glu Arg Gly Asp Pro Phe Glu

65707580

Phe Lys Leu Gly Ser Gly Gln Val Ile Lys Gly Trp Asp Gln Gly Leu

859095

Leu Gly Ala Cys Val Gly Glu Lys Arg Lys Leu Lys Ile Pro Ala Lys

100 105 110

Leu Gly Tyr Gly Glu Gln Gly Ser Pro Pro Thr Ile Pro Gly Gly Ala

115 120 125

Thr Leu Ile Phe Asp Thr Glu Leu Ile Ala Val Asn Glu Lys Pro Ala

130 135 140

Gly Gly Glu Glu Tyr Gly Gly Asp Lys Asp Asp Glu Gly Tyr Gly Asn

145 150 155 160

Asp Glu Leu

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atacataaca ggttgaagca tagtg 25

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaatagcgtt ttgtctcacc tta 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgattgtgc tgtgttctgt ttt 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtactgtgta atttgctttg gcta 24

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

attttgccga tttcggaac 19

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggatgggacc agggtttatt g 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caagcttgga tgggattttc a 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctcaggctcc gtggtggtat g 21

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtgatagttt tcccagtcaa cgtc 24