一种基于COI基因序列的多鳞四指马鲅和四指马鲅的分子鉴别方法

技术领域

本项发明属于遗传学领域，涉及一种基于COI基因序列的多鳞四指马鲅和四指马鲅的分子鉴别方法。

背景技术

多鳞四指马鲅(Eleutheronema rhadinum)和四指马鲅(E.tetradactylum)隶属于鲻形目马鲅科四指马鲅属，俗称午鱼、马友，其脂肪含量高，肉质细嫩，蛋白质丰富，具有较高的食用价值和经济价值，是名贵的高端海水鱼类。在我国，四指马鲅的人工繁育和养殖刚刚有所进展，商品鱼主要还是来源于捕捞。但是，随着需求的日益增加，多鳞四指马鲅和四指马鲅的自然资源日趋衰竭，开展资源的保护工作迫在眉睫。

马鲅科的鱼类外形相似、鉴别特征不显著、容易混淆，形态分类学上主要是依据胸鳍下方的游离丝状鳍条数进行区别，如三指马鲅、四指马鲅、六指马鲅等。而多鳞四指马鲅和四指马鲅同属于四指马鲅属，胸鳍下方均具4根游离丝状鳍条，除胸鳍颜色、侧线鳞数目和犁骨齿板不同外，其他形态学特征几乎相同，多鳞四指马鲅常被误认为是同四指马鲅的幼鱼。两种鱼类不仅形态上非常相似，生境也相似，经常混栖于相同水域，体型很小的仔稚鱼就更难辨认，给资源的保护和管理带来了一定难度。因此，急需一种快捷方便、准确可靠的多鳞四指马鲅和四指马鲅鉴别方法。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供一种基于COI基因序列的多鳞四指马鲅和四指马鲅的分子鉴别方法，通过设计引物对进行鉴定。

作为本发明的一个方面，本发明提供一种基于COI基因序列的多鳞四指马鲅和四指马鲅的分子鉴别方法，其包含以下步骤，(1)分别提取待鉴定的多鳞四指马鲅和四指马鲅基因组DNA；(2)以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增多鳞四指马鲅和四指马鲅的细胞色素氧化酶亚基I基因，PCR扩增使用的上游引物如序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3，下游引物如序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4；(3)扩增产物纯化后，直接测序，进行多鳞四指马鲅和四指马鲅扩增产物序列比对，序列的第356-357位点碱基为AA的是多鳞四指马鲅，序列的第356-357位点碱基为GG的则是四指马鲅。

优选的，所述的PCR反应体系为50μL：50ng/μL的模板DNA 1μL，PCR缓冲液5μL，dNTP混合液4μL，每种dNTP 0.1mmol/L，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2μL 2IU的Taq酶；双蒸水36μL；所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl

作为本发明的另一个方面，本发明提供一种基于COI基因序列的多鳞四指马鲅和四指马鲅分子鉴别的引物对，其包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.3，所述下游引物的序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4。

作为本发明的另一个方面，本发明提供一种上述引物对在制备多鳞四指马鲅和四指马鲅分子鉴别试剂中的应用。

作为本发明的另一个方面，本发明提供一种基于COI基因序列的多鳞四指马鲅和四指马鲅分子鉴别试剂，其包含上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3，所述下游引物的序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4。

优选的，所述分子鉴别试剂还包括PCR缓冲液和dNTP混合液，所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl

有益效果：

本发明针对多鳞四指马鲅和四指马鲅细胞色素氧化酶亚基I(COI)基因的序列差异，首次以多鳞四指马鲅和四指马鲅细胞色素氧化酶亚基I基因序列作为依据，从而定性鉴别多鳞四指马鲅和四指马鲅。该方法可以快速、简便、准确、有效地鉴别多鳞四指马鲅和四指马鲅，结果稳定性好，重复率高，无需依赖鱼类分类学的专业知识，不仅可鉴别多鳞四指马鲅和四指马鲅成品鱼，还可以鉴别它们的仔稚鱼和鱼卵，将在渔业资源调查和多样性研究等方面发挥重要作用。

附图说明

图1为本发明中多鳞四指马鲅和四指马鲅COI基因的序列比对结果，相同的碱基用连接号标识，差异的碱基用星号标识。多鳞四指马鲅和四指马鲅第356-357位点存在差异，碱基为AA的是多鳞四指马鲅，碱基为GG的是四指马鲅。连续碱基标记稳定性强，降低了鉴别错误的概率。而比对出的其他差异碱基在两种马鲅间不是稳定存在，部分个体间存在位点碱基一致情况，鉴定准确率较低。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例1

1、引物设计

设计特异性PCR扩增引物对，引物对1序列为：上游引物SEQ ID NO.1：5'-TAGCCGCTGGAATTACCATG-3'，下游引物SEQ ID NO.2：5'-CTAGGGAGCCTACAGAGGAG-3'。引物对2序列为：上游引物SEQ ID NO.3：5'-TCGTTACCGCACATGCTTTC-3'，下游引物SEQ ID NO.4：5'-CACGGGTGTCCACATCTATT-3'。

2、样本采集

取待鉴定的多鳞四指马鲅和四指马鲅个体各30尾。多鳞四指马鲅购于启东水产市场，四指马鲅购于厦门水产市场。多鳞四指马鲅体长17.6-21.9cm，体重0.15-0.31kg，四指马鲅体长20.8-28.5cm，体重0.20-0.36kg。

3、基因组DNA提取

利用基因组提取试剂盒提取多鳞四指马鲅和四指马鲅的基因组DNA。取每尾鱼的肌肉组织约20mg，用滤纸吸干表面水分，装入1.5mL离心管，加入180μL的GL缓冲液、20μL的蛋白酶K和10μL的核糖核酸酶A，在56℃的水浴锅中温浴直到外套膜肌肉组织完全裂解，裂解时间为2至3小时左右。向裂解液中加入200μL的GB缓冲液和200μL的无水乙醇，并用移液枪充分吸打混匀。将核酸纯化柱安置于集液管上，溶液移至核酸纯化柱中，离心机12,000rpm，离心时间为2min，离心结束后弃掉核酸纯化柱中的滤液。将500μL的WA缓冲液加入核酸纯化柱中，离心机12000rpm下离心，时间为1min，离心结束后弃掉核酸纯化柱中的滤液。将700μL的WB缓冲液沿核酸纯化柱管壁四周加入，离心机12000rpm，离心时间为1min，离心结束后弃掉滤液，然后重复本步骤1次。将核酸纯化柱重新安置于集液管上，离心机12000rpm，离心时间为2min。将核酸纯化柱安置于新的1.5mL的离心管上，在滤膜的中央加入150μL的灭菌水，在室温下静置5min左右，离心机12000rpm，离心时间为2min，洗脱DNA。DNA完整性采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测其OD值并稀释至50ng/μL，-20℃保存备用。

4、PCR扩增与检测

已提取的DNA为模板，用上述引物1(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)和引物对2(SEQID NO.3和SEQ ID NO.4)进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL：1μL模板DNA(50ng/μL)；PCR缓冲液5μL(10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl

PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳中检测分离，120V电压下电泳30min之后，经凝胶成像分析系统确定PCR扩增产物的大小及纯度。

5、测序比对

检测后的PCR扩增产物直接送至生物公司纯化测序，引物1(SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2)获得730bp左右的序列，比对后可以发现COI基因序列第356-357位点存在差异，多鳞四指马鲅的碱基为AA，四指马鲅的碱基为GG。引物2(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)获得740bp左右的序列，比对后在该COI基因序列片段中未获得多鳞四指马鲅和四指马鲅间稳定的差异性碱基，因此该对引物不能用于对这两种鱼类进行特异性鉴别。

实施例2

1、待检鱼样本采集

从浙江舟山水产市场购买待鉴定四指马鲅38尾，进行盲样鉴定。待鉴定样本体长19.8-32.4cm，体重0.18-0.52kg。

2、样本总DNA提取

利用基因组提取试剂盒提取待检鱼样本总DNA。总DNA提取方法同实施例1。

3、PCR扩增与检测

运用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2对待检测与总DNA进行PCR扩增，方法同实施例1。PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳中检测分离，120V电压下电泳30min之后，经凝胶成像分析系统确定PCR扩增产物的大小及纯度。

4、测序比对

检测后的PCR扩增产物直接送至生物公司纯化测序，获得730bp左右的序列。比对后发现COI基因序列第356-357位点存在稳定差异，其中11尾个体第356-357位点为AA，鉴定为多鳞四指马鲅；28尾个体第356-357位点为GG，鉴定为四指马鲅。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 江苏省淡水水产研究所

<120> 一种基于COI基因序列的多鳞四指马鲅和四指马鲅的分子鉴别方法

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<212> DNA/RNA

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