一种基于抗缪勒氏管激素AMH时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明属于免疫检测分析技术和纳米生物技术领域，具体涉及一种抗缪勒氏管激素(AMH)时间分辨荧光免疫分析试剂盒及检测方法。

背景技术

AMH检测的临床意义：1.卵巢储备功能评价：女性出生时，血清中AMH浓度水平很低，青春期后AMH浓度达到高峰，并在整个生育年龄维持在高水平，之后随着年龄及各种因素逐渐消耗，AMH浓度会随之降低，直到绝经后将无法测出。可见，AMH值会随着卵巢功能的变化呈起伏变化。AMH指数越高，说明卵子的库存量越大，生育能力自然就较强。AMH降低时，代表卵巢正在老化，表示女性生育力的衰退。通过检测AMH可更早更准确反映年龄相关卵巢储备功能的下降。2.多囊卵巢综合征(PCOS)：PCOS是人群中发生率最高的生殖内分泌紊乱疾病，但目前诊断方法并不准确。传统的超声下窦卵泡计算困难，受主观因素影响较大。临床研究发现，PCOS患者血清AMH水平高于正常水平2～3倍，血清AMH可以用来诊断PCOS并评估其疗效，其灵敏度67％，特异度92％。因此，AMH浓度是卵巢窦卵泡数目的精确反映，血清AMH水平取代超声下小窦状卵泡计数可作为PCOS诊断标准之一。3.卵巢功能早衰(POF)：POF患者血清AMH水平明显低于正常同龄女性，与绝经期妇女水平相当。而且由于AMH不仅由小窦卵泡产生，即使彩色超声检测不到的小卵泡同样可以分泌，且为非周期依赖性的，不参与下丘脑-垂体-性腺轴的负反馈调节，因此AMH有望成为早期预测POF发病的良好的临床指标。4.辅助生殖技术：AMH水平能够预测卵巢反应性，识别有卵巢过度刺激综合征风险的女性，可根据AMH数值来判断使用促排卵药物的用量。研究发现接受IVF/ICSI治疗的患者血清及卵泡液中AMH水平越高则受精率越高，AMH可能成为预测受精率的指标。除此之外，AMH预测OHSS优于年龄和BMI，发生OHSS患者的基础AMH较正常人高6倍，提示AMH可能提前预测OHSS。5.卵巢颗粒细胞瘤：因由于AMH仅由颗粒细胞表达，其表达水平由卵巢初级卵泡和窦前卵泡的颗粒细胞决定，这说明AMH可以作为卵巢颗粒细胞瘤的一个标记物。据报道76％～93％的卵巢颗粒细胞瘤中AMH表达均为阳性，且AMH与卵巢颗粒细胞瘤的肿瘤大小及分化程度具有独立相关性，并且对卵巢颗粒细胞瘤的复发有一定预测价值。6.预测绝经发生的年龄：AMH水平与绝经年龄密切相关，血清AMH水平在绝经前5年逐渐降低，故目前认为血清AMH可以预测绝经年龄。7.性别发育异常：可协助诊断患儿是否存在性腺发育异常、性早熟、隐睾等发育障碍疾病。如果血清AMH水平很低或检测不出，则高度提示无睾丸组织。研究显示，在隐睾症患者中，有50％患者血清AMH水平正常，且隐睾症患者血清AMH水平明显低于单睾丸患者。8.相关疾病辅助诊治：血清AMH水平也与一系列自身免疫性疾病相关，因为该类患者的卵巢功能往往也受到损伤。如自身免疫性甲状腺疾病、系统性红斑狼疮和克罗恩病等。除此之外，AMH的检测可用于预测和评估放疗、化疗，以及卵巢手术等治疗对患者卵巢功能的影响，指导治疗方案的选择。

检测时间：1.AMH水平不受周期内与周期之间的变化影响。2.AMH可在周期内任何时间抽血检查。3.AMH不受激素避孕药的影响，便于临床使用。4.AMH可更早更准确反映年龄相关卵巢储备功能的下降。

时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)进行AMH的检测。TRFIA是一种以镧系元素螯合物为标记物的新兴技术，具有零本底、线性范围宽、稳定性好等特点，灵敏度可达到10

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本专利通过将TRFIA与磁微粒技术相结合，将所有试剂集成在一个试剂条上，建立AMH-TRFIA方法，该检测可由全自动设备操作，准确度高，单人份检测，使用方便，将此技术应用于评估卵巢储备、多囊卵巢综合征、卵巢功能早衰等，为卵巢功能早衰的诊断和治疗提供一个非常便捷的新手段。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种基于抗缪勒氏管激素AMH时间分辨荧光免疫分析试剂盒，所述试剂盒内包括至少一个试剂架，每个所述的试剂架上包括至少五个试剂条，所述试剂盒内还包括至少二瓶AMH的冻干校准品；所述试剂条上包括磁珠孔、反应缓冲液孔、铕标冻干孔、检测孔、清洗液孔、增强液孔和若干个预留孔；所述磁珠孔内填充包被AMH抗体的磁微粒溶液，所述反应缓冲液孔内填充反应缓冲液，所述铕标冻干孔内填充铕标记的AMH抗体溶液，所述检测孔内填充待检样品，所述清洗液孔内填充清洗液，所述增强液孔内填充增强液。

进一步地，所述试剂盒内包括5～20个试剂架，每个所述的试剂架上设有5个试剂条；所述试剂盒内还包括2瓶AMH的冻干校准品。

进一步地，所述包被AMH抗体的磁微粒溶液经直径为50～5000纳米的活化的磁微粒与AMH抗体连接、洗涤、封闭制备得到；所述铕标记的AMH抗体溶液以Eu

进一步地，所述反应缓冲液为pH7.8的50mmol/L Tris-HCl含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN

一种基于抗缪勒氏管激素AMH时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下内容：

AMH校准品溶液的制备：取高浓度的AMH抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN

包被AMH抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为50～5000nm的四氧化三铁微球用质量浓度为0.5～2％的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为5.0的MES缓冲液清洗1～3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为5.0的MES缓冲液和50μg的AMH抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用pH为7.2的5％BSA和0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液清洗1～3次，用pH为7.2的5％BSA和0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液于25℃下封闭30分钟，用含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％的NaN

铕标记的AMH抗体溶液的制备：取AMH抗体1mg，经PD-10转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na

增强液的制备：体积浓度为3.6‰的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的Triton X-100的混合溶液。

反应缓冲液为pH7.8的50mmol/L Tris-HCl含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/LDTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN

清洗液为含0.48g/L的Tris，12.49g/L的NaCl，1.11g/L的Tween-20，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液。

一种基于抗缪勒氏管激素AMH时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，所述检测方法主要包括以下步骤：

1)分别取AMH的冻干校准品溶液和待测样品，与包被AMH抗体的磁微粒溶液、反应缓冲液稀释的铕标记的AMH抗体溶液混合，进行孵育，孵育后进行磁性分离，然后用清洗液进行清洗，再加入增强液；

2)采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定加增强液后的溶液中铕的荧光值，获得所述AMH的冻干校准品溶液和待测样品的荧光值，根据AMH校准品溶液中各AMH的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将待测样品的荧光值代入对应的AMH标准曲线中，便可得到所述待测样品中AMH的含量。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：

(1)本发明提供一种检测AMH的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，包括反应缓冲液、清洗液、增强液、包被AMH抗体的磁微粒溶液、铕标记的AMH抗体溶液都集成在一个试剂条上，全自动操作，简便易行。24min内即可检测得到血清中AMH的含量，检测结果准确可靠，除了拥有TRFIA技术的灵敏度高、储存时间长、无放射性污染、测量范围宽等诸多优点外，还可通过免疫磁微粒的富集作用以及磁微粒在液体中充分扩散使得结合表面积扩大的特性，大大缩短反应时间，提高检测灵敏度，同时磁微粒与抗体通过化学基团定向连接，大大减少了抗原的用量以及显著提高检测的精密度，同时实现自动化，克服了传统微孔板式酶联免疫法(ELISA)技术需要样本积累到一定数量才能检测，实现了样本的即时检测，效率高；

该试剂盒是以纳米磁微粒为载体的高效时间分辨荧光技术：磁微粒与AMH抗体的自由氨基连接，形成包被有AMH抗体的免疫磁微粒，该免疫磁微粒依靠其超大的比表面积可在短时间内结合大量AMH，加入Eu标记的AMH抗体进行示踪，通过磁分离，用增强液将Eu从复合物上解离下来后，与增强液中的螯合剂螯合形成一种胶态分子团，分子团在紫外光的激发下能发出很强的发射波长的荧光，信号增强了百万倍，可灵敏的检测血清中AMH的含量。

附图说明

图1为本发明提供的免疫分析试剂盒的检测原理示意图。

图2为本发明提供的免疫分析试剂盒中AMH标准品的双对数标准曲线图。

图3为本发明提供的集成5人份试剂条的试剂架的结构示意图。

图4为本发明提供的试剂条的结构示意图。

其中，1、试剂条；2、试剂架；3、预留孔；4、预留孔；5、磁珠孔；6、预留孔；7、反应缓冲液孔；8、铕标冻干孔；9、检测孔；10、预留孔；11-13、清洗液孔；14、增强液孔；15、预留孔。

具体实施方式

下面通过具体实施案例来进一步说明本发明。但这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

如图3和4所示，一种基于抗缪勒氏管激素AMH时间分辨荧光免疫分析试剂盒，所述试剂盒内包括5～20个试剂架，每个所述的试剂架上设有5个试剂条；所述试剂盒内还包括2瓶AMH的冻干校准品。所述试剂条上包括磁珠孔、反应缓冲液孔、铕标冻干孔、检测孔、清洗液孔、增强液孔和若干个预留孔；所述磁珠孔内填充包被AMH抗体的磁微粒溶液，所述反应缓冲液孔内填充反应缓冲液，所述铕标冻干孔内填充铕标记的AMH抗体溶液，所述检测孔内填充待检样品，所述清洗液孔内填充清洗液，所述增强液孔内填充增强液。

所述包被AMH抗体的磁微粒溶液经直径为50～5000纳米的活化的磁微粒与AMH抗体连接、洗涤、封闭制备得到；所述铕标记的AMH抗体溶液以Eu

所述反应缓冲液为pH7.8的50mmol/L Tris-HCl含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN

一种基于抗缪勒氏管激素AMH时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下内容：

AMH校准品溶液的制备：取高浓度的AMH抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN

包被AMH抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为50～5000nm的四氧化三铁微球用质量浓度为0.5～2％的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为5.0的MES缓冲液清洗1～3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为5.0的MES缓冲液和50μg的AMH抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用pH为7.2的5％BSA和0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液清洗1～3次，用pH为7.2的5％BSA和0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液于25℃下封闭30分钟，用含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％的NaN

铕标记的AMH抗体溶液的制备：取AMH抗体1mg，经PD-10转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na

增强液的制备：体积浓度为3.6‰的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的Triton X-100的混合溶液。

反应缓冲液为pH7.8的50mmol/L Tris-HCl含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/LDTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN

清洗液为含0.48g/L的Tris，12.49g/L的NaCl，1.11g/L的Tween-20，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液。

一种基于抗缪勒氏管激素AMH时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，所述检测方法主要包括以下步骤：

1)校准品溶液定标后，将待测血清取100ul，与所述包被AMH抗体的50ul磁微粒溶液、反应缓冲液稀释的铕标记的AMH抗体溶液混合，反应12分钟，进行磁性分离，清洗液清洗3次，然后加入所述增强液；

2)全自动时间分辨荧光免疫分析仪分别测定加增强液后的溶液中铕的荧光值，然后根据标准曲线，将待测样品的对应荧光值代入对应的标准曲线中，计算得到待测样品中AMH的含量。

检测过程中的反应原理如图1，将AMH抗体包被在磁珠上，铕标记AMH抗体，如果样本中存在AMH，则形成磁珠-AMH抗体-AMH-铕标记AMH抗体复合物，分离后加入解离增强液解离铕离子，采用时间分辨荧光仪检测荧光值，荧光值的强弱与样本中AMH含量成正比，根据AMH的标准品荧光值绘制标准曲线，计算样本中AMH的含量。

检测结果如下：抗缪勒氏管激素AMH的双对数标准曲线见图2，血清样本测试结果见表1，该检测方法具有较好的灵敏度，且实现了荧光检测的自动化。

表1血清样本测试结果

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。