藜麦山引2号和藜麦新引2号的SSR分子标记及其应用

技术领域

本发明涉分子标记技术领域，具体涉及藜麦山引2号和藜麦新引2号的SSR分子标记及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

藜麦(Chenopodium quinoa Willd.)，是一年生的苋科藜属双子叶草本植物，至今已有7500多年的种植历史。藜麦原产地为南美洲安第斯山脉，多位于玻利维亚、智利和秘鲁一带的高海拔地区。

藜麦种质资源无论在形态还是遗传上都具有丰富的多样性，而且藜麦基因组是异源四倍体，其遗传背景信息复杂。目前关于藜麦的基础研究薄弱，种质资源在遗传上不清晰，遗传育种进展缓慢。利用SSR分子标记技术具有的优势优点，利用现代生物技术，开发新的分子标记，可为下一步利用SSR分子标记进行藜麦遗传多样性分析、种质资源鉴定以及基因进行定位和分子标记育种提供有力技术保障。

目前在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记有以下几种：限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)，数量多、结果稳定、重复性好，但步骤复杂、成本高、使用放射性同位素造成环境污染；随机扩增多态性DNA(RandomlyAmplified Polymorphic DNA，RAPD)，操作简单引物设计无需序列信息，但重复性不高、显性遗传无法区分纯杂合；扩增片段长度多态性(Amplified Fragment LengthPolymorphism，AFLP)，数量多，多态性高，但对模板DNA质量要求高；单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)，分布广泛，数量多，呈二态性和等位基因性；表达序列标签(Expressed Sequence Tags，EST)，体现基因表达水平，不包含调控序列、内含子信息。

SSR分子标记分布于整个基因组中，两端序列高度保守，因而可以将两端保守的DNA片段进行克隆、测序，通过人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个分子标记的位点扩增出来，检测物种的遗传多样性。目前，植物基因组中SSR分子标记的开发研究十分活跃，在小麦、玉米、水稻、油菜、大豆、西红柿、甜菜等农作物上都有所应用。现在结合转录组测序开发SSR分子标记已经在萝卜、辣椒、菠菜、南瓜、大白菜、洋葱、茄子、花椰菜、葡萄等果蔬中得到广泛应用。

发明内容

与现有技术中的分子标记相比，SSR分子标记具有易操作、重复性好、共显性、多态性高和特异性强等优点，可直接检测DNA分子结构变异、反映研究材料分子水平的本质差异，因而广泛应用在构建DNA指纹图谱、基因定位、遗传多样性分析、种质资源鉴定和植物育种等研究领域。

本发明的目的是提供一种藜麦山引2号和藜麦新引2号的SSR分子标记及其应用。

具体的，在本发明的第一方面，提供一组藜麦山引2号和藜麦新引2号SSR分子标记，其特征在于：包括有如下9个位点所对应的正向和反向引物：

在本发明的第二方面，提供第一方面所述藜麦山引2号和藜麦新引2号SSR分子标记在以下方面的应用：

藜麦山引2号和藜麦新引2号的多态性鉴定；

藜麦山引2号和藜麦新引2号的种质遗传多样性分析；

藜麦山引2号和藜麦新引2号的杂交鉴定；

藜麦山引2号和藜麦新引2号的种质资源的鉴定。

本发明的具体实施方式具有以下有益效果：

本发明基于公共数据库开发的藜麦山引2号和藜麦新引2号的SSR分子标记，易操作、重复性好、共显性、多态性高和特异性强；

本发明根据已发表的藜麦基因组序列，分析藜麦基因组中的SSR序列，找出位于基因序列中间的SSR序列，然后分析其两端序列，设计合适引物，对山引2号和新引2号藜麦品种的基因组进行PCR，找出在这两个藜麦品种间具有多态性的SSR分子标记12个，其中9个分子标记引物多态性良好；

本发明开发的SSR引物在藜麦山引2号和新引2号基因组中的扩增产物有明显的条带大小或条带数目的差异，可用于这两个藜麦品种的鉴定等方面。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为分子标记QSSR89、QSSR97、QSSR105对藜麦山引2号和新引2号的多态性鉴定PAGE胶结果；

其中，泳道1，2：QSSR89；泳道3，4：QSSR97；泳道5，6：QSSR105 泳道1，3，5：藜麦山引2号；泳道2，4，6：藜麦新引2号

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

术语解释：

分子标记(molecular marker)：概念有广义和狭义之分，广义的分子标记是指可遗传、检测的蛋白质或DNA序列。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，能直接反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。

SSR：简单序列重复(Simple Sequence Repeats，SSR)，是一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，由几个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。常见的重复序列有(TG)n，(CA)n，(TTA)n或(AAT)n等，重复单元串联数目的不同，呈现出长度的多态性。每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。由于SSR重复单元的不同以及重复次数变化范围很大，所以SSR标记能揭示更高的多态性。

1、藜麦基因组序列的获取。从网站

2、藜麦SSR位点的鉴定。用SSR鉴定软件MISA(MIcro Satellite，https://webblast.ipkgatersleben.de/misa/)查找SSR位点(由几个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列)，然后分析每个SSR位点的位置，查找所有位于基因序列中间的SSR位点。

3、SSR引物设计。分别下载SSR的侧翼序列，然后用Primer Premier 5.0软件在SSR序列两端的序列保守区设计引物；设计好的引物在基因组序列上分析可能结合位点。

4、藜麦山引2号和新引2号SSR的验证及多态性分析。

以藜麦山引2号和新引2号的新鲜叶片为材料，用CTAB法提取其基因组DNA；利用设计合成的引物对藜麦山引2号和新引2号的基因组进行PCR扩增，PCR结果用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经银染后对PAGE胶图拍照，分析这两个藜麦品种的PCR产物的异同，分析找出在这两个品种间PCR结果有差异的SSR分子标记。

藜麦山引二号和新引二号是山东师范大学生命科学学院生物实验室保藏的。

附图1显示了QSSR89、QSSR97、QSSR105对藜麦山引2号和新引2号的多态性鉴定结果。

经过分析得出，在藜麦山引2号和新引2号之间有多态性的SSR引物共有9对，如表1所示。

表1验证的SSR引物序列及其扩增条带种类

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

<120> 藜麦山引2号和藜麦新引2号的SSR分子标记及其应用

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<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtccttgata tgccaggctt ta 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtccgtgaat ctaaattgtg gtg 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgaaaggtta cttatgaatt gattg 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttagtgctt tggagctgtg c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tactagccct tgggtggttg 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

catcgtctaa aaccaaattc atg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tatactaaac tcctgagctt gct 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcttcccttc aacatggatt 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggaaaattta ataaaatacc gc 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aattttggtt aagggttctt g 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttaacctcag gatttcactc aa 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tacacctttg ctaaaacacc at 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccacttataa tggcattggc t 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aataaggtca attggcgtaa ga 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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ccagatttcg atctcattaa cc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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atttggctaa cataatggca c 21

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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aaacaatctc aacaaggcaa ca 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

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