用于从样品中的一种或多种类型的微生物的不同群体中提取核酸分子的通用方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2018年4月2日提交的美国申请序列号62/651,620的权益。该在先申请的公开被认为是本申请的公开的一部分并且通过引用并入到本申请的公开中。

技术领域

本发明总体上涉及基因组分析，并且更具体地涉及一种从生物样品中的不同微生物群体中提取和分析与食物相关联的核酸分子的方法。

背景技术

约100万亿微生物生活在人体中和人体上，远远超过人体的约10万亿个人体细胞。这些通常无害的病毒、细菌和真菌被称为共栖或共生生物。共栖和共生生物在许多方面帮助我们的身体保持健康。所有生活在体内和身体上的微生物——共栖的、共生的和致病的微生物——被统称为微生物组，并且它们的平衡和相关联的代谢组与个体的健康状况密切相关，并且反之亦然。

核酸测序的进展已经创造了快速并准确地鉴定和概述居住在肠道和皮下组织中的微生物组的机会。最佳菌群还以协同方式与宿主免疫系统相互作用，进一步传播其健康益处。也可以通过基于质谱的系统或使用基于基因组学的代谢组建模和通量平衡分析来概述个体的相关联的代谢组，并且相关联的代谢组用于制作健康的代谢组概况。所有这些方法都可以用来剖析微生物群落的复杂性。

发明内容

本发明涉及一种从生物、环境、膳食补充剂或其他生态微生物有机体异质群体样品中的不同微生物群体中提取核酸分子的方法，以及通过处理步骤和分析使用核酸或提取物以用于确定对个体的益生菌定制。本发明特有的处理步骤包括：RNA或DNA的清除、片段化、分离或消化；用于下游应用的文库或核酸制备，诸如PCR、qPCR、数字PCR或测序；用于生物信息学QC、过滤、比对或数据分离的预处理；用于微生物物种分类分配的宏基因组学或人类基因组生物信息学流程；和其他生物体比对、鉴定和变异解释。

本发明还描述了一种通用方法，该方法使用样品进行DNA提取和基于来自这些生物体所含的肉、植物、水果、蔬菜和/或微生物的数据库中食物DNA序列确定食物消耗。本文公开了从样品中的一种或多种类型的细胞或细胞成分的不同群体中提取遗传物质并且确定消耗的食物和营养分解以改善健康和预防疾病的方法。

因此，在一个方面中，本发明提供了一种用于制备用于分析的样品的方法。该方法包括：a)将样品与包含去污剂(例如SDS)和螯合剂(例如EDTA)的第一裂解溶液混合；b)向步骤a)的混合物中加入具有溶菌酶的第二裂解溶液；和c)向步骤b)的混合物中加入包含离液剂(例如尿素、乙酸锂、盐酸胍等)的第三裂解溶液。预处理步骤可以包括可以用于进一步优化核酸产量的物理裂解。机械裂解的示例包括声处理、珠混合和珠磨均质化。

在类似的方面中，该方法包括：a)将样品(诸如粪便样品)与液氮溶液混合；b)加入第一裂解溶液，该第一裂解溶液包含去污剂和螯合剂(例如SDS)，和螯合剂(例如EDTA)；和c)加入第二裂解溶液，该第二裂解溶液包括离液剂，例如尿素、乙酸锂、盐酸胍。预处理步骤可以包括可以用于进一步优化核酸产量的物理裂解。机械裂解的示例包括声处理、珠混合和珠磨均质化。

在另一个方面中，本发明提供了一种确定受试者的食物消耗的方法。该方法包括：a)从由受试者获得的粪便样品中提取遗传物质，所述遗传物质根据本公开的方法提取；和b)对从第一样品中提取的遗传物质进行宏基因组学分析，以确定受试者的食物消耗。在实施例中，该方法进一步包括基于对食物消耗的分析，用益生菌或食品来治疗受试者。

在另一个方面中，本发明提供了一种监测受试者的益生菌治疗的方法。该方法包括：a)从由受试者获得的第一样品中存在的任何微生物中提取遗传物质，所述遗传物质根据本公开的方法提取；b)对从第一样品中提取的遗传物质进行宏基因组学分析；c)用益生菌治疗受试者，并且然后以与从第一样品中提取遗传物质相同的方式，从由受试者获得的第二样品中存在的任何微生物中提取遗传物质；d)对从第二样品中提取的遗传物质进行宏基因组学分析；和e)将第一样品的宏基因组学分析的结果与第二样品的宏基因组学分析的结果进行比较。

在仍然另一个方面中，本发明提供了一种方法，包含在有或没有额外的化学或遗传测试的情况下根据在肠道中检测到的益生菌生物计算益生菌得分。

在又另一个方面中，本发明提供了一种方法，包含计算微生物组的得分，该得分用于评估微生物组是否处于生态失调、中性或稳定状态。

本发明进一步提供了一种计算系统，包含：存储器；和耦合到存储器的一个或多个处理器，该一个或多个处理器被配置成执行操作以执行本发明的方法。

本发明还提供了用于执行本发明的方法的自动化平台。

本发明提供了一种用于从生物、环境、膳食补充剂或其他生态微生物有机体异质群体样品的不同微生物菌群中提取核酸的一体化方法。

在实施例中，本发明可以用于通过分析益生菌和环境样品中微生物各自的核酸来确定微生物的组成和相对丰度。DNA被纯化并用于下游核酸分析(特别是宏基因组学分析，其中鉴定了多于一个种/亚种的基因组)。

前面的一般描述和下面的详细描述都仅仅是示例性和解释性的，并且旨在提供对如所要求保护的本发明的进一步解释。包括任何附图以提供对本发明的进一步理解，并且附图被并入到本说明书中并构成本说明书的一部分，示出了本发明的若干个实施例，并且与说明书一起用于解释本发明的原理。

附图说明

图1是说明人类的微生物组特征(高蛋白饮食，>50岁，补充剂使用者)的高流行性生物体的存在的示意图。

图2A是说明人类的微生物组特征(高碳水化合物饮食，18-50岁，素食饮食)的高流行性生物体(细菌)的存在的示意图。

图2B是说明人类的微生物组特征(高碳水化合物饮食，18-50岁，素食饮食)的高流行性生物体(病毒和噬菌体)的存在的示意图。

图2C是说明人类的微生物组特征(高碳水化合物饮食，18-50岁，素食饮食)的高流行性生物体(古细菌)的存在的示意图。

图2D是说明人类的微生物组特征(高碳水化合物饮食，18-50岁，素食饮食)的高流行性生物体(真菌和其他真核生物)的存在的示意图。

图3A是说明人类的微生物组特征(高碳水化合物饮食，18-50岁，非素食饮食)的高流行性生物体(细菌)的存在的示意图。

图3B是说明人类的微生物组特征(高碳水化合物饮食，18-50岁，非素食饮食)的高流行性生物体(病毒和噬菌体)的存在的示意图。

图3C是说明人类的微生物组特征(高碳水化合物饮食，18-50岁，非素食饮食)的高流行性生物体(古细菌)的存在的示意图。

图3D是说明人类的微生物组特征(高碳水化合物饮食，18-50岁，非素食饮食)的高流行性生物体(真菌和其他真核生物)的存在的示意图。

图4A是说明人类的微生物组特征(高乳蛋白饮食，0-2岁，素食非哺乳)的高流行性生物体(细菌)的存在的示意图。

图4B是说明人类的微生物组特征(高乳蛋白饮食，0-2岁，素食非哺乳)的高流行性生物体(病毒和噬菌体)的存在的示意图。

图4C是说明人类的微生物组特征(高乳蛋白饮食，0-2岁，素食非哺乳)的高流行性生物体(古细菌)的存在的示意图。

图4D是说明人类的微生物组特征(高乳蛋白饮食，0-2岁，素食非哺乳)的高流行性生物体(真菌和其他真核生物)的存在的示意图。

图5是说明较低的流行性生物体的存在和人类的微生物组特征的机会性病原体的鉴定的示意图。

图6是说明在人类的微生物组特征中检测到的典型益生菌的示意图。

图7是说明在人类的微生物组特征中检测到的典型益生菌的示意图。

图8是说明示出正常群体的个体相对丰度与数据库平均值的比较的示意性图表。

图9是阐述通过本发明的方法从膳食补充剂混合的培养物中鉴定的生物体的表。

图10是阐述在本发明的数据库中存储的各种微生物的独特种的分类的表。

图11说明在本发明的一个实施例中来自个体的示例性人口统计信息。

图12说明在本发明的一个实施例中检测到的与海鲜相关的示例性生物体。

图13说明在本发明的一个实施例中检测到的与哺乳动物肉相关的示例性生物体。

图14说明在本发明的一个实施例中检测到的与谷物相关的示例性生物体。

具体实施方式

本发明提供了一种用于从样品中的一种或多种类型的微生物的不同群体中提取核酸分子的通用方法。微生物的类型包括：革兰氏阳性细菌、革兰氏阳性细菌孢子、革兰氏阴性细菌、古细菌、原生动物、蠕虫、藻类、真菌、真菌孢子、病毒、类病毒、噬菌体和轮虫。在一些实施例中，不同的群体是多种相同类型的不同微生物，例如革兰氏阳性细菌。在一些实施例中，不同的群体是多种不同类型的微生物，例如细菌(革兰氏阳性细菌、革兰氏阳性细菌孢子和/或革兰氏阴性)、真菌、病毒和噬菌体。

因为不同类型的微生物具有不同的组成和机制以保护它们自己的遗传物质，所以通常很难从一种类型的微生物中提取遗传物质而不损害在同一生物样品中也提取另一种类型的微生物的遗传物质的能力。然而，本发明允许从样品中不同类型的微生物中提取遗传物质，而不牺牲通过在同一样品中提取另一种类型的微生物的遗传物质而可以从一种类型的微生物中获得的遗传物质的量。根据本发明，包含微生物的样品可以是生物样品、环境样品、人工产生的样品(例如，实验室测试或对照样品、益生菌组合物或补充物的样品等)，等等。生物样品的示例包括组织样品、血液样品、血浆样品、脑脊液样品、尿液样品、粪便样品、从消化道中获得的物质的样品、生物分泌物(例如，精液、阴道分泌物、母乳、眼泪、唾液等)，等等。固体样品可以被液化或与溶液混合，并且然后根据本发明可以提取存在于液化的样品、混合物或从混合物获得的溶液中的微生物的遗传物质。对提取的遗传物质可以进行进一步的处理和分析，诸如纯化、扩增和测序。

在一些实施例中，对提取的遗传物质进行宏基因组学分析，以例如鉴定提取遗传物质的样品中的一种或多种类型的微生物。在另外的实施例中，可以对从人类粪便样品中制备的提取的核酸物质进行全基因组鸟枪法测序。制备包括核酸清除反应，以去除有机溶剂、杂质、盐、酚和其他抑制过程的污染物。额外的制备包括从每个样品制备核酸文库，其中gDNA经历修饰和/或扩增，以制备样品用于测序平台上的测序，诸如通过合成、纳米孔、长阅读和/或CMOS电子测序方法的大规模平行测序。

如本文所公开的，通过使微生物以特定的顺序经历三种不同的组合物，本发明的方法允许从同一样品中存在的一种或多种不同类型的微生物中成功地提取遗传物质。根据本发明的方法包含首先裂解样品中存在的任何革兰氏阴性细菌，随后消化样品中存在的任何酵母和细菌的细胞壁的多糖组分，并且然后用离液剂破坏第二步后完整的任何细胞壁。

简而言之，在一个实施例中，第一步包含将样品与包含去污剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS))和螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))的第一裂解溶液混合，以裂解样品中存在的任何革兰氏阴性细菌。第一裂解溶液可以进一步包括一种或多种缓冲液(例如Tris)、一种或多种温和去污剂(例如Triton

在第一步之后，将样品与包含溶菌酶的第二裂解溶液混合，以消化混合物中存在的任何酵母和细菌细胞壁的多糖组分。因为溶菌酶可能抑制第一裂解溶液的活性，所以重要的是样品与第二裂解溶液的接触发生在用第一裂解溶液处理样品之后。

在用第二裂解溶液处理后，向混合物中加入包含离液剂(例如尿素、乙酸锂、盐酸胍等)的第三裂解溶液，以破坏未被第二裂解溶液消化的任何细胞壁。第三裂解溶液可以包括去污剂，诸如SDS。

在一些实施例中，第一裂解溶液和第三裂解溶液都包含工作浓度在1-10％w/v之间的SDS。在一些实施例中，在用第三裂解溶液处理后，混合物进一步用包含离液剂(例如，尿素、乙酸锂、盐酸胍等)和蛋白酶K的第四裂解溶液处理。在其中第三裂解溶液的离液剂是乙酸锂的一些实施例中，然后对混合物进行热冲击处理，并且然后可以用第四裂解溶液处理。

在某些方面中，以下公开描述了一种通用方法，该方法使用粪便样品进行DNA提取，并且基于来自肉类、植物、水果、蔬菜和/或这些生物体中包含的微生物的数据库的食物DNA序列来确定食物消耗。本文公开了从样品中的一种或多种类型的细胞或细胞成分的不同群体中提取遗传物质并且确定消耗的食物和营养分解以改善健康和预防疾病的方法。

在一些实施例中，从消化道等获得生物分泌物(例如，精液、阴道分泌物、母乳、眼泪、唾液、血液、尿液等)。固体样品可以被液化或与溶液混合，并且然后可以根据本发明或本领域中已知的其他标准核酸提取方案提取液化的样品、混合物或从混合物获得的溶液中的任何含有遗传物质的食物类的遗传物质，诸如基于植物的(幼苗、叶子、子叶、种子、胚乳、组织培养愈伤组织、根等)、基于动物的、基于真菌的或基于原生生物的食物。在一些实施例中，可以对提取的遗传物质进行进一步的处理和分析，诸如纯化、扩增和测序。在一些实施例中，对提取的遗传物质进行宏基因组学分析，以例如鉴定提取遗传物质的样品中的一种或多种类型的生物体。

在一些实施例中，宏基因组分析将利用的数据库已经被定制用于特定目的，即在适当的系统发育中，鉴定和分类分配具有生物体的相对丰度的核酸或被人类或其他动物摄入的生物体的成分。在一些实施例中，并且附加的数据表或数据库可以用作生物体的相对丰度的查找，以确定生物体的肠道样品的常量营养素含量作为其饮食的代表。在一些实施例中，这种常量营养素的分解可以包括脂肪、碳水化合物、蛋白质、维生素、矿物质和任何常量营养素的亚成分。

如本文中所公开的，本发明的方法允许通过对样品进行分离、纯化或用于捕获核酸的其他方法，从同一样品中存在的一种或多种不同类型的生物体、一种或多种生物体的细胞，或细胞基质或细胞器中成功提取遗传物质。根据本发明的方法包含裂解或破坏样品中的任何食物细胞(包括但不限于任何细胞壁和细胞膜)，消化样品中存在的任何真菌、植物、哺乳动物或原生生物细胞的任何细胞壁或细胞膜的多糖或木质素组分，并用离液剂破坏消化步骤后完整的任何细胞壁。

本发明包括通过液氮快速冷冻和立即机械破碎或研磨来物理破碎食物细胞的细胞壁或细胞膜以破坏细胞壁并在化学裂解之前保持有害的细胞酶失活的步骤。本发明包括将样品与包含去污剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS))和螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))的第一裂解溶液混合以裂解样品中存在的任何动物细胞的步骤。第一裂解溶液可以进一步包括一种或多种缓冲液(例如Tris)、一种或多种温和去污剂(例如Triton

在一些实施例中，本发明可以包括将样品与包含溶菌酶的第三裂解溶液混合以消化混合物中存在的任何真菌或细菌细胞壁的多糖组分的步骤。在一些实施例中，可以用包含离液剂(例如尿素、乙酸锂、盐酸胍等)和蛋白酶K的第四裂解溶液进一步处理混合物。在其中第四裂解溶液的离液剂是乙酸锂的一些实施例中，然后可以对混合物进行热冲击处理，并且然后可以用第四裂解溶液处理。在特定的示例性实施例中，第三溶液和/或第四溶液可以在任何点加入到混合物中，以破坏未被任何先前的裂解溶液消化的任何细胞壁。

在一些实施例中，如果样品具有或怀疑具有细菌和/或真菌孢子，则在与第一裂解溶液接触之前可以对样品进行诱导孢子的细胞壁萌发的预处理步骤。预处理步骤可以包含将样品与诸如温和的去污剂之类的化学物质(例如吐温80)混合，以诱导萌发或在诱导萌发的条件(例如温度)下培养样品。在其中用化学物质诱导萌发的一些实施例中，该化学物质优选地是不抑制、降低或改变第一裂解溶液、第二裂解溶液和第三裂解溶液的活性或有效性的化学物质。

在一些实施例中，根据本发明的方法可以进一步包括一个或多个机械处理步骤，该机械处理步骤通过机械方法(包括声处理、珠混合、珠磨均质化、加压、微流化等)引起物理裂解。在一些实施例中，在使样品经受第一裂解溶液之前，进行机械处理步骤。

在实施例中，根据本发明的方法能够从包括酵母(即，酵母属某些种)、革兰氏阴性细菌(例如不动杆菌属某些种)、革兰氏阳性细菌(例如双歧杆菌属某些种)、病毒(例如核盘菌属某些种)、孢子(芽孢杆菌属某些种)、蠕虫(绦虫棘球蚴属某些种)、原生动物门(肉足纲——变形虫，例如内变形虫)和噬菌体(例如乳酸菌噬菌体)的多种微生物中提取核酸分子。

在实施例中，根据本发明的方法能够从包括真菌(即，酵母属某些种)、动物细胞(普通牛)、植物(例如大麦)的多种生物体中提取核酸分子。

以下示例旨在说明而非限制本发明。

提取方法A

将范围为10mg至5000mg的样品加入到无菌的2毫升(mL)的微量离心管中。任选地，可以通过加入400微升(μL)的纯珠混合物并以8000rpm涡旋约30秒来进行珠打浆。然而，如果期望获得高分子量核酸，例如基因组DNA，则优选地避免珠打浆。

第一裂解溶液处理步骤

为了裂解样品中的任何革兰氏阴性细菌，通过向样品中加入约400μL的消化缓冲液(1％w/v的SDS、25mM的Tris HCl、2.5mM的EDTA、1％的Triton

第二裂解溶液处理步骤

为了裂解样品中的任何革兰氏阳性细菌，将包含葡糖苷水解酶(“溶菌酶”)的第二裂解溶液加入到从第一裂解溶液处理步骤获得的混合物中，以得到1mg/mL的最终的溶菌酶浓度和约8.0的pH。合适的葡糖苷水解酶可以从各种来源(包括蛋清、各种动物的眼泪，或粘液或唾液)获得。然后将混合物在37℃下孵育约1至24小时的时间段。

第三裂解溶液处理步骤

为了裂解样品中存在的任何真菌和/或酵母细胞，加入包含在蒸馏的无菌H

由于第二裂解溶液处理步骤和第三裂解溶液处理步骤足以裂解噬菌体和病毒的外壳，因此不需要额外的步骤来从样品中可能存在的噬菌体和病毒中提取遗传物质。

提取方法B

裂解前处理步骤

将100-200mg的样品加入到无菌的2毫升(mL)微量离心管中。加入500mL的液氮，并且允许样品冷冻30秒。然后使用颗粒杵或锯齿发生器探针，在继续下一步之前彻底研磨样品。

第一裂解溶液处理步骤

为了裂解样品中的任何动物、真菌和原生生物食物细胞膜，通过向样品中加入约400μL的消化缓冲液(1％w/v的SDS、25mM的Tris HCl、2.5mM的EDTA、1％的Triton

第二裂解溶液处理步骤

为了裂解样品中存在的任何真菌和/或酵母细胞，加入包含在蒸馏的无菌H

核酸纯化

在一个实施例中，从裂解的微生物中提取的遗传物质，即在经受第一裂解溶液处理步骤、第二裂解溶液处理步骤和第三裂解溶液处理步骤后存在于混合物中的核酸分子，然后通过将混合物分成两个微量离心管而纯化为DNA和RNA纯化。通过加入约20μL的RNA酶A并在室温下孵育5分钟，从一个管中提取DNA。使混合物通过生物聚合物组织匀浆器柱。如果先前进行了珠打浆，则优选地避免使混合物经受组织匀浆器柱。

然后将洗出液以1000g离心5分钟。上清液用约400μL的DNA裂解溶液(盐酸胍、Tris-EDTA和70％的EtOH)和约20μL的蛋白酶K处理，混合，并且然后在55℃下孵育10分钟。然后加入-22℃的EtOH，并且混合物通过倒置来混合。混合物可以经受本领域中已知的一种或多种额外的DNA提取和纯化方法。

通过使混合物通过生物聚合物组织匀浆器柱，从第二微量离心管中提取RNA。同样，如果先前进行了珠打浆，则优选地避免使混合物经受组织匀浆器柱。然后将洗出液以1000g离心5分钟。上清液用在25mM的MgCl

在一个实施例中，从裂解的微生物中提取的遗传物质，即在经受第一处理步骤、第二处理步骤和预裂解处理步骤后存在于混合物中的核酸分子，然后通过将混合物分成两个微量离心管而纯化为DNA和RNA纯化。通过加入约20？L的RNA酶并在室温下孵育5分钟从一个管中提取DNA。

然后将洗脱液以1000g离心5分钟。上清液用约400μL的DNA裂解溶液(盐酸胍、Tris-EDTA和70％的EtOH)和约20μL的蛋白酶K处理，混合，并且然后在55℃下孵育10分钟。然后加入-22℃的EtOH，并且混合物通过倒置来混合。混合物可以经受本领域中已知的一种或多种额外的DNA提取和纯化方法。

从第二微量离心管中提取RNA。然后将洗脱液以1000g离心5分钟。上清液用在25mM的MgCl

在其中需要RNA分子定量表达的一些实施例中，优选使用RNA稳定缓冲液和珠打浆以确保RNA核酸分子的释放和有限的降解。

在其中需要提取高分子量核酸分子的一些实施例中，避免了珠打浆和组织匀浆柱，并且进行苯酚-氯仿-乙醇提取，而不是基于硅胶柱的提取。在一些实施例中，可以进行基于磁珠的核酸纯化。为了去除核酸的选择性分子量并纯化样品，可以进行基于琼脂糖凝胶的纯化和富集。

宏基因组学分析

在一个实施例中，使用Illumina索引衔接子制备提取和纯化的遗传物质用于测序，并且检查大小和数量。对于任何少于50ng的DNA的输入，在1-20个循环之间进行低循环PCR，否则，对于50ng或更多的核酸，可以使用无PCR的文库制备方法。凝胶纯化使用QiagenGel Purification Kit

用于短插入方法的测序的从1000或更大的范围的读数可以用于该方法。大插入方法诸如Pac Bio

本发明能够在种中以最低的菌株级鉴定生物体。

在实施例中，本发明包括鉴定和/或分析在我们的数据库中含有的一种或多种细菌(图10)。一些选择的示例是克劳氏芽孢杆菌、动物双歧杆菌、乳酸片球菌、印度不动杆菌、唾液乳杆菌、不动杆菌、解淀粉芽孢杆菌、瑞士乳杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种、海氏肠球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、肠球菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、施氏假单胞菌、嗜酸乳杆菌、克雷伯菌和阴沟肠杆菌菌株。

在实施例中，本发明包括鉴定和/或分析在我们的数据库中含有的一种或多种酵母(图10)。一些选择的示例是酵母属、布拉氏酵母、库德里阿兹威酵母(Saccharomyceskudriavzevii)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)和酿酒酵母。

在实施例中，本发明包括鉴定和/或分析在我们的数据库中含有的一种或多种噬菌体或病毒(图10)。一些选择的示例是芽孢杆菌噬菌体phi29、肠杆菌噬菌体HK022、乳杆菌噬菌体A2、埃希氏菌噬菌体HK639、噬菌体cdtI、核盘菌分体病毒S区段2、伯克霍尔德菌噬菌体BcepMu、乳球菌前噬菌体bIL311、肠球菌噬菌体phiFL4A和链球菌噬菌体SM1。

未来数据库的改善将增加或改进可以通过此方法检测的生物体。

在一个实施例中，使用Illumina索引衔接子制备提取和纯化的遗传物质用于测序，并且检查大小和数量。可以进行低循环PCR或标准的无PCR方法。凝胶纯化使用QiagenGel Purification Kit

使用表1，我们确定个体已经消耗以下：

表1

监测常量营养素的摄入和膳食指导

在一些实施例中，本发明可以用于监测受试者的食物摄入营养、数量和质量。例如，在用益生菌治疗之前，可以获得从受试者的消化道获得的样品，并且如本文所公开的提取其中的食物生物体的遗传物质，并经受宏基因组学分析。将通过生物信息学工具利用由完整的、部分的或不完整的参考基因组、RNA的或核酸组分或片段组成的定制的食品特异性数据库以鉴定、量化和分类地分配来自测序的核酸信息。其输出在下面的表2中举例说明，并且含有在肠道中的生物体的物种或生物体的细胞的鉴定。

表2

然后，在用给定的益生菌治疗期间和/或之后，可以从受试者的消化道获得第二样品，并且提取第二样品中微生物的遗传物质并经受宏基因组学分析，其结果与第一样品的宏基因组学分析的结果进行比较。然后，基于比较结果，可以将食物生物体结果与微生物组生物体结果进行比较，以了解与食物相关联的微生物和整体食物质量评估。在一些实施例中，这可以向生物体的物种提供信息：个体正在通过其食物来源摄入以及通过选择或直接修饰对该物种的任何遗传修饰、突变或不规则性。

在一些实施例中，微生物组分析的第二样品将能够检测食物生物体常见的微生物，并且提供关于食物生物体的健康的信息。在一些实施例中，人类消耗的食物可以是普通食物来源的一部分，诸如鸡、牛、猪，或者甚至植物和原生生物，其中物种将被鉴定并与它们特有的微生物相匹配。在特定的示例性实施例中，可以在所分析的第二肠道微生物组样品中检测到可能具有鸡肉瘤病毒的鸡物种。在一些实施例中，摄入的食物生物体的健康可以通过负面地影响宿主生物体的健康的微生物的存在与否来确定。在特定的示例性实施例中，可以检测到可能影响宿主生物体的健康的疾病，诸如马疱疹病毒2，该疾病是马的呼吸道疾病。

在一些实施例中，本发明可以用于筛选给定的受试者的肠道微生物组，并且然后定制食物或饮食方案，该食物或饮食方案使他们能够针对营养平衡、改善的微生物肠道概况和营养的吸收方面提高其健康的质量。

监测益生菌治疗

在一些实施例中，本发明可以用于监测受试者的益生菌治疗。例如，在用益生菌治疗之前，可以获得从受试者的消化道获得的样品，并且如本文所公开的提取其中微生物的遗传物质并经受宏基因组学分析。然后，在用给定的益生菌治疗期间和/或之后，可以从受试者的消化道获得第二样品，并且如本文所公开的提取第二样品中微生物的遗传物质，并经受宏基因组学分析，其结果与第一样品的宏基因组学分析的结果进行比较。然后，基于比较结果，可以修改受试者的益生菌治疗，以在受试者的肠道中获得期望的微生物群体。例如，可以对受试者施用益生菌，该益生菌包含希望在受试者的肠道中增加其量的微生物。

在一些实施例中，可以混合或培养粪便样品，用于确定微生物粪便群落的代谢组学。然后，代谢组学概况可以用于确定将有益于个体的益生菌菌株。代谢组学概况的示例包括那些影响能量代谢、营养利用、胰岛素抗性、肥胖症、血脂异常、炎症、短链脂肪酸、有机酸、细胞因子、神经递质化学物质或表型的代谢组学概况，并且可以包括其他代谢组学标记物。

微生物组筛选和益生菌选择

本发明已经被成功地用于确定各种商业上可获得的益生菌的微生物含量。此外，本发明的方法用于确定各种益生菌的微生物含量和受试者肠道中的微生物组含量。在一个实施例中，基于受试者肠道中的微生物组含量及其任何期望的变化，可以选择一种或多种益生菌，该益生菌含有期望在受试者的微生物组健康中增加和/或维持的微生物。在一个实施例中，基于受试者肠道中的微生物组含量及其任何期望的变化，可以选择一种或多种益生菌，该益生菌含有期望在受试者的肠道平衡中增加和/或维持的微生物，该微生物与它们从其食物来源获得的常量营养素含量相关，如由来自个体的调查信息直接记录的或由本发明的肠道生物体核酸分析所记录的。

其中微生物组代表了他们的微生物群和其中含有的来自细菌、真菌、病毒、噬菌体和寄生虫的生物体的完整图像。例如，使用本文所述的方法，受试者的肠道微生物组被确定为含有25％的A和75％的B，益生菌1被确定为含有75％的A和25％的B，并且益生菌2被确定为含有25％的A和75％的B。如果受试者的肠道微生物组期望被维持，则可以选择益生菌2用于施用给受试者。然而，如果受试者的肠道中的A和B的量期望为50/50，则可以选择益生菌1和2两者施用给受试者。可替代地，可以选择益生菌1施用给受试者，直到受试者肠道中A和B的量达到50/50。在一些实施例中，可以定制益生菌制剂，例如，含有相同量、变化量或不同量的A和B或其他益生菌菌株，用于施用给受试者。利用个体的肠道中存在的微生物的相对丰度的计算模型将有助于确定微生物的类型、剂量和混合物以包括在益生菌中。例如，如果确定与一般群体或以前的微生物组分析相比，生物体A减少或缺失，则我们将提供益生菌或益生元，该益生菌或益生元将增加生物体A的浓度。这种益生元或益生菌可能是确切的生物体A或将支持生物体A生长的另一种生物体。给定的剂量将考虑个体中生物体的相对丰度、益生元/益生菌的性能特征，诸如生长速率、相容性、受体或受体密度、基因或表达模式或代谢产物。

定制的益生菌的量可能不相等，但是基于从单个肠道/粪便样品中检测到的相对丰度来配制。这些制剂适于将微生物组调节到健康状态。微生物组的健康状态通过使用现有的合计私有和公共数据库(诸如metaHIT

因此，在一些实施例中，本发明可以用于筛选给定的受试者的肠道微生物组，并且然后基于受试者的肠道微生物组为给定的受试者定制益生菌方案。

生态失调的治疗

在一些实施例中，本发明可以用于在已经导致受试者的微生物群从平衡的微生物组向导致或可能导致负面副作用、障碍和/或疾病的微生物组转变的事件后，使受试者的肠道菌群和/或动物群恢复到体内平衡。健康状况可以包括但不限于各种病症，从痤疮和过敏，到胃肠道疾病、肥胖和癌症。这样的生态失调的一个示例是肥胖症的发作的情况。受试者肠道中的若干种微生物的菌株已被证明与受试者遭受的肥胖或体重管理问题有关。参见，例如，Ley,等人(2005)PNAS USA 102:11070-11075。例如，在肥胖的动物和人类受试者中，拟杆菌门(Bacterides)与厚壁菌门(Firmicutes phyla)微生物的比率在代谢性能中起着重要作用。参见，例如，Turnbaugh,等人(2012)PLOS ONE 7:e41079。已知与肥胖和体重管理问题相关联的一些肠道微生物包括单形拟杆菌、嗜果胶拟杆菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、史密斯甲烷短杆菌和动物双歧杆菌。

因此，在一些实施例中，使用本文所述的方法确定受试者的肠道中第一给定微生物与第二给定微生物的比率，并且然后如果该比率是不希望的或异常的，则受试者施用治疗以将该比率改变为期望的比率。在一些实施例中，使用本文所述的方法来确定受试者的肠道中第一给定微生物相对于受试者的肠道中所有微生物总量的量，并且然后如果第一给定微生物的相对量是不期望的或异常的，则受试者施用治疗以将该量改变为期望的量。对它们肠道微生物组的重新测试可以用来确定它们是否很好地遵守常量营养素和食物指导。这样的治疗包括给受试者施用：含有一种或多种微生物的益生菌(该微生物的量期望在受试者的肠道中增加)，抗微生物剂，例如抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂等(以杀死或减慢期望在受试者的肠道中减少其量的一种或多种微生物的生长)，支持健康肠道微生物组的生长或维持的饮食和/或膳食补充剂，例如益生元、镁、鱼油、L-谷氨酰胺、维生素D等，等等。例如，Million,等人((2005)Int.J.Obes.36:817-825)指出肥胖受试者的肠道微生物群在罗伊氏乳杆菌中富集，而在动物双歧杆菌和史密斯甲烷短杆菌中耗尽。因此，在使用本文所述的方法确定受试者的肠道中罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌和史密斯甲烷短杆菌的量并且发现该量是典型的或指示与肥胖相关联的肠道微生物群之后，可以向受试者施用含有动物双歧杆菌和史密斯甲烷短杆菌和相对少量甚至没有罗伊氏乳杆菌的益生菌。在实施例中，肥胖受试者的肠道微生物群将受益于含有类黄酮、多酚和短链脂肪酸的食物。

您的微生物组的评分

微生物组特征的评分总体上使用如表3所示的类似的决策树、算法、人工智能、脚本或逻辑树。该系统将能够提供得分，该得分帮助用户了解他们的肠道微生物组的健康程度，以及他们是否需要对发现的一些或许多挑战采取行动。挑战可以包括但不限于：已知致病生物体的鉴定、机会性病原体的计数和鉴定、已知在给定的机会时引起致病影响的潜伏生物体、除其组成外缺乏对良好微生物环境的支持或缺乏关键菌株、在前10名中发现的独特生物体和/或患病率大于0.1％的生物体的总体多样性和计数。

多样性截止值从样品分析的集合中确定，并且截止值在x相对丰度下确定。例如，如果x＝0.1％，那么352种独特的生物体构成了平均健康概况。然后在此数字周围应用标准偏差，并且在曲线分析下使用高斯分布和百分位数，我们可以从我们的数据库平均值中得出与平均多样性数字的接近程度。你的多样性数字越低并且离平均值越远，则微生物组得分就越低。数字越高并且你的多样性越大，则微生物组得分就越高。这种类型的评分类别以及益生菌得分将确定数字和视觉计量的得分，用于习俗了解他们的微生物组的健康程度。图形可视化的示例包括如下。其中低等于低微生物组质量，并且高等于高微生物组质量和得分。低->100分之30，中->100分之65，高＝100分之65或更高。

评分和益生菌配方算法的示例包括在下表3中。表3可以被表示为决策树、算法、人工智能、脚本或逻辑树。这样的决策树、算法、人工智能、脚本或逻辑树的功能是输出如与检测到的益生菌相关的个体微生物组的健康的得分，并且为益生菌的使用提供配方和剂量建议。

在下面的表4中阐述了微生物可能被分组的潜在类别的示例性列表。

表3

用于益生菌评分和配方的示例性决策表。

包括益生菌菌株数据库、宏基因组学分析数据库和文献管理数据库的利用

表4

从中创建组的潜在类别

除非另有说明，否则本申请中使用的所有科学和技术术语具有本领域中常用的含义。

如本文中所使用的，术语“受试者”包括人类和非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、马、羊、狗、牛、猪、鸡和其他兽医对象和测试动物。

除非另外特别指出，否则单数的使用可以包括复数。如在说明书和所附的权利要求书中所使用的，单数形式的“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”可以包括复数指代物，除非上下文另外明确指出。除非另有说明，否则“或”的使用可以表示“和/或”。如本文中所使用的，“和/或”是指“和”或者“或”。例如，“A和/或B”表示“A、B或A和B两者”，并且“A、B、C和/或D”表示“A、B、C、D或其组合”，并且所述“其组合”表示A、B、C和D的任何子集，例如，单个成员的子集(例如，A或B或C或D)，两个成员的子集(例如，A和B；A和C；等)，或三个成员的子集(例如，A、B和C；或A、B和D；等)，或所有四个成员(例如A、B、C和D)。

如本文中所使用的，术语“样品”和“生物样品”是指适合于由本发明提供的方法的任何样品。细胞的样品可以是任何样品，包括例如通过非侵入性或侵入性技术诸如受试者的活检获得的肠道或粪便样品。在一个实施例中，术语“样品”是指任何来源于受试者的粪便物质或肠道组织的制剂。例如，使用本文所述的非侵入性方法获得的细胞的样品可以用于分离用于本发明的方法的核酸分子或蛋白质。

在实施例中，分析可以是任何核酸，包括DNA、RNA、cDNA、miRNA、mtDNA、单链或双链的。此类核酸可以具有任何长度，短至约5bp的寡核苷酸，长至兆碱基或者甚至更长。如本文中所使用的，术语“核酸分子”是指DNA、RNA、单链、双链或三链的及其任何化学修饰。实际上，核酸的任何修饰都是被预期的。“核酸分子”可以具有几乎任何长度，从10、20、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、150,000、200,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、5,000,000或者甚至更多个碱基长度，直到全长染色体DNA分子。对于分析基因的表达的方法，从样品中分离的核酸通常是RNA。

基于鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)成碱基对和腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿苷(U)成碱基对的能力，当单链核酸分子可以与另一个单链核酸分子的全部或部分成碱基对(杂交)以形成双螺旋(双链核酸分子)时，它与另一个核酸分子“互补”。例如，核苷酸序列5’-TATAC-3’与核苷酸序列5’-GTATA-3’互补。

如本文中所使用的“杂交”是指核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程。杂交反应可以是敏感的和选择性的，因此即使在其中其以低浓度存在的样品中也可以鉴定特定的感兴趣序列。在体外情况下，合适的严格条件可以由例如预杂交和杂交溶液中的盐或甲酰胺的浓度或由杂交温度来定义，并且在本领域中是众所周知的。特别地，可以通过降低盐的浓度、增加甲酰胺的浓度或提高杂交温度来增加严格性。例如，在高严格性条件下的杂交可以在约37℃至42℃的约50％甲酰胺中进行。杂交可以在约30℃至35℃的约35％至25％甲酰胺中的降低的严格性条件下进行。特别地，杂交可以在42℃的高严格性条件下在50％的甲酰胺、5X SSPE、0.3％的SDS和200mg/ml的剪切和变性的鲑鱼精子DNA中进行。杂交可以在如上所述的降低的严格性条件下，但是在35％甲酰胺中在35℃的降低的温度下进行。对应于特定严格性水平的温度范围可以通过计算感兴趣的核酸的嘌呤与嘧啶的比率并相应地调节温度来进一步缩小。上述范围和条件的变化在本领域中是众所周知的。

如本文中所使用的，术语“微生物组”是指居住在受试者的肠道中的微生物，包括细菌、病毒和真菌、古细菌、原生动物、变形虫或蠕虫。

如本文中所使用的，术语微生物的(microbial)、微生物(microbe)或微生物(microorganism)是指任何微生物(microscopic organism)，包括原核生物或真核生物、孢子、细菌、archeaebacterium、真菌、病毒或原生生物、单细胞或多细胞的。

本发明部分地根据功能组分和各种处理步骤来描述。此类功能组分和处理步骤可以通过被配置为执行指定功能并实现各种结果的任意数量的组分、操作和技术来实现。例如，本发明可以使用各种生物样本、生物标记物、元素、材料、计算机、数据源、存储系统和介质、信息收集技术和过程、数据处理标准、统计分析、回归分析等，它们可以执行各种功能。此外，尽管本发明是在医学诊断环境中描述的，但是本发明可以结合任何数量的应用、环境和数据分析来实施；本文描述的系统仅仅是本发明的示例性应用。

根据本发明的各个方面的用于数据分析的方法可以以任何合适的方式实现，例如使用在计算机系统上运行的计算机程序。根据本发明的各个方面，示例性的分析系统可以结合计算机系统(例如包含处理器和随机存取存储器的传统计算机系统，诸如可远程访问的应用服务器、网络服务器、个人计算机或工作站)来实现。计算机系统还适当地包括附加的存储装置或信息存储系统，诸如大容量存储系统和用户接口，例如常规的监视器、键盘和跟踪装置。然而，计算机系统可以包含任何合适的计算机系统和相关设备，并且可以以任何合适的方式配置。在一个实施例中，计算机系统包含独立系统。在另一个实施例中，计算机系统是包括服务器和数据库的计算机的网络的一部分。

接收、处理和分析遗传信息所需的软件可以在单个装置中实现，或者在多个装置中实现。该软件可以通过网络访问，使得信息的存储和处理相对于用户远程进行。根据本发明的各个方面的分析系统及其各种元件提供了便于微生物组分析的功能和操作，诸如数据收集、处理、分析、报告和/或诊断。本分析系统维护与微生物组和样品相关的信息，并且便于分析和/或诊断。例如，在本实施例中，计算机系统执行计算机程序，该计算机程序可以接收、存储、搜索、分析和报告与微生物组相关的信息。计算机程序可以包含执行各种功能或操作的多个模块，诸如用于处理原始数据和生成补充数据的处理模块，以及用于分析原始数据和补充数据以生成模型和/或预测的分析模块。

分析系统还可以提供各种附加模块和/或单独的功能。例如，分析系统还可以包括报告功能，例如以提供与处理和分析功能相关的信息。分析系统还可以提供各种管理和管理功能，诸如控制访问和执行其他管理功能。

在理解或完成本发明的公开所必需的程度上，本文提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用明确地并入本文，如同每个都单独地如此并入一样。

虽然已经参照上述示例描述了本发明，但是应当理解，修改和变化包含在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅受所附权利要求的限制。