表达CD19-CAR的NK细胞消除CD19阳性淋巴系统恶性肿瘤

本申请要求2018年10月31日提交的序列号为62/753,719的我们共同未决的美国临时申请的优先权。

名为104077.0008PCT Seq_ST25、大小为38KB的序列表的ASCII文本文件创建于2019年7月15日，通过EFS-Web与本申请一起以电子方式提交，将其内容通过引用以其整体并入。

技术领域

本发明的领域是与癌症治疗有关的工程改造的细胞。

背景技术

背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地提到的任何出版物是现有技术。

本文中的所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指明通过引用并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。

自然杀伤(NK)细胞是构成先天免疫系统的主要组分的细胞毒性淋巴细胞。自然杀伤(NK)细胞通常代表循环淋巴细胞的约10％-15％，其结合并杀灭对抗原不具有特异性并且没有既往免疫致敏的靶细胞(包括病毒感染的细胞和许多恶性细胞)。Herberman等人,Science[科学]214:24(1981)。靶细胞的杀灭是通过诱导细胞裂解发生的。用于自体NK细胞移植的NK细胞是从受试者血液的外周血淋巴细胞(“PBL”)部分分离的，在细胞培养物中扩增以获得足够数量的细胞，然后重新输注到受试者体内。此类自体NK细胞在体内治疗中显示出一些有效性。然而，此种疗法仅限于自体情况，并且由于并非所有NK细胞都具有细胞溶解性这一事实而进一步复杂化。

发明内容

在一些实施例中，本披露提供了一种表达CD19 CAR和Fc受体的

在一些实施例中，

在一些实施例中，当效应子与靶标的比率为10时，该

在一些实施例中，本披露提供了一种试剂盒，该试剂盒包含含有本文披露的

在一些实施例中，本披露提供了一种用于产生

在一些实施例中，本披露提供了一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者向该受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包含多种如说明书和权利要求书中公开的

在一些实施例中，该癌症是白血病或淋巴瘤。

在一些实施例中，该癌症是以下中的一种或多种：B细胞恶性肿瘤、HSCT后的B细胞恶性肿瘤、CLL、B-ALL、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、UCBT后的B谱系淋巴系统恶性肿瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B-非霍奇金氏淋巴瘤(B-Non-Hodgkin's Lymphoma，B-NHL)、HSCT后ALL；淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤或淋巴母细胞性白血病。在一些实施例中，该B细胞恶性肿瘤是套细胞淋巴瘤。在一些实施例中，静脉内施用多个

前面的一般描述和下面的详细描述是示例性和说明性的，并且旨在提供对本披露的进一步说明。对于本领域技术人员而言，其他目的、优点和新颖特征将是显而易见的。

附图说明

在结合附图考虑的同时参考以下披露后，将更容易理解本披露的目的、特征和优点。

图1是第一代、第二代和第三代CAR的结构域的示意图。

图2显示了三顺反子质粒的组分，这些组分包含CAR编码序列、P2A序列、CD16编码序列和erIL-2编码序列。

图3A和3B显示了流式细胞术分析的结果，这些结果显示CD16和CD19-CAR在CD19t-haNK

图4A显示了CD19 t-haNK

图5A显示了CD19 t-haNK

图6A显示了当与赫赛汀(Herceptin)(抗Her2抗体)组合时，CD19 t-haNK

图7显示了所选的CD19 t-haNK

图8显示了在培养条件下从所选的CD19 t-haNK

图9显示了静脉内Raji荷瘤动物的存活曲线。通过对数秩(Mantel-Cox)检验进行统计分析。****，P<0.0001。

图10显示了静脉内Raji肿瘤模型中的动物体重变化。数据是平均值±SEM。SEM计算为标准差除以N的平方根。

图11显示了皮下Raji模型的肿瘤生长曲线。数据是平均值±SEM。使用双因素方差分析，随后通过Tukey检验进行的多重比较来进行统计分析；***，P<0.001；****，P<0.0001。

图12显示CD19 t-haNK

图13显示了皮下Raji肿瘤模型中的动物体重变化。数据为平均值±SEM。

具体实施方式

本披露提供了表达CD19 CAR和Fc受体的

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。

在本说明书和随后的权利要求书中，将参考许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义：

本文中所用术语仅用于描述具体实施例的目的，而不意图具有限制性。除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式“一种”、“一个”和“该”也旨在包括复数形式。因此，例如，提及“一种自然杀伤细胞”包括多种自然杀伤细胞。

所有数字指称，例如pH、温度、时间、浓度、量和分子量，包括范围，都是近似值，这些值在适当的情况下以0.1或1.0的增量变化，即(+)或(-)。应当理解，尽管并非总是明确地陈述，但是所有数字指称前均可以有术语“约”。

如本文所用，“+”当用于指示特定细胞标志物的存在时，是指该细胞标志物在荧光活化的细胞分选中相对于同种型对照可检测地存在；或在定量或半定量RT-PCR中可检测到高于背景值。

如本文所用，“-”当用于指示特定细胞标志物的存在时，是指该细胞标志物在荧光活化的细胞分选中相对于同种型对照不可检测地存在；或在定量或半定量RT-PCR中不可检测到高于背景值。

如本领域技术人员将理解，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文披露的所有范围也涵盖任何和所有可能的亚范围及其亚范围的组合。任何列出的范围均可以被容易地识别为充分描述并且能够将相同范围分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为一个非限制性实例，可以容易地将本文讨论的每个范围分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。还如本领域技术人员所理解，所有语言，诸如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”等均包括所述数字，并且指可以随后分解成上述亚范围的范围。最后，如本领域技术人员所理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。

如本文所用，当提及

还应理解，尽管并非总是明确指出，本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等同物是本领域已知的。

出于本发明的目的并且除非另外指示，否则术语

如本文所用，术语

如本文所用，术语“aNK细胞”是指来源于Gong等人(Leukemia[白血病],四月；8(4):652-8(1994))中所述的高效独特细胞系的未修饰的自然杀伤细胞，其权利由南克维斯特公司拥有(下文中的“aNK细胞”)。

如本文所用，术语“haNK细胞”是指来源于Gong等人(Leukemia[白血病],四月；8(4):652-8(1994))中所述的高效独特细胞系的自然杀伤细胞，其权利由南克维斯特公司拥有，经修饰以在细胞表面上表达CD16(下文中的“CD16+

如本文所用，术语“taNK

如本文所用，术语“t-haNK

如本文所用，术语“多顺反子构建体”是指将被转录成单个mRNA分子的重组DNA构建体，并且该单个mRNA分子编码两个或更多个转基因。如果多顺反子构建体编码两个转基因，则将其称为双顺反子构建体，并且如果其编码三个基因，则将其称为三顺反子构建体，并且如果其编码四个基因，则将其称为四顺反子构建体，等等。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指与细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合结构域。CAR可以在T细胞或NK细胞中表达以增加细胞毒性。通常，细胞外抗原结合结构域是对目的细胞上发现的抗原具有特异性的scFv。基于scFv结构域的特异性，表达CAR的

如本文所用的术语“肿瘤特异性抗原”是指存在于癌细胞或赘生性细胞上但不能在来源于与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞上检测到的抗原。如本文所用，肿瘤特异性抗原还指肿瘤相关抗原，即与来源于与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞相比，在癌细胞上以更高水平表达的抗原。

如本文所用，术语“靶”在提及肿瘤的靶向时是指

术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或其可以与完整抗体竞争地特异性结合靶抗原的片段，并且包括嵌合的、人源化的、完全人的和双特异性的抗体。完整抗体通常包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在一些情况下可包括更少的链，诸如天然存在于骆驼科动物中的抗体，其可仅包含重链。抗体可以仅来源于单一来源，或者可以是“嵌合的”，使得抗体的不同部分来源于两种不同的抗体。抗原结合蛋白、抗体或结合片段可以在杂交瘤中通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。除非另有说明，否则术语“抗体”除了包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白。此外，除非明确排除，抗体包括：单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物(有时在本文中称为“抗体缀合物”)、及分别地其片段。在一些实施例中，所述术语还包括肽体。

术语“受试者”是指非人动物(包括哺乳动物，诸如猫、狗、牛、马、猪、绵羊和山羊)和人。术语受试者还指需要治疗本文所述疾病的患者。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或不发生，并且所述描述包括其中事件或情况发生的例子以及其中事件或情况不发生的例子。

术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”应意指排除对组合具有任何重要意义的其他要素。例如，基本上由本文所定义的成分组成的组合物将不排除不会实质上影响权利要求书的一个或多个基本和新颖特征的其他成分。“由……组成”是指排除多于痕量的其他成分和实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例都在本披露的范围内。

如本文所用，术语“细胞毒性”和“细胞溶解性”当用于描述效应细胞诸如NK细胞的活性时，旨在是同义的。通常，细胞毒性活性涉及通过多种生物学、生化或生物物理机制中的任一种杀灭靶细胞。细胞溶解更具体地是指效应子裂解靶细胞的质膜从而破坏其物理完整性的活性。这导致靶细胞的杀灭。在不希望被理论束缚的情况下，据信NK细胞的细胞毒性作用是由于细胞溶解。

针对细胞/细胞群的术语“杀灭”旨在包括将导致该细胞/细胞群死亡的任何类型的操纵。

术语“细胞因子(cytokine)”或“细胞因子(cytokines)”是指影响免疫系统细胞的生物分子的一般类别。示例性细胞因子包括但不限于FLT3配体、干扰素和白介素(IL)，特别是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。

术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且指可用于本文所述方法的任何动物或其细胞，无论是体外还是原位。在某些非限制性实施例中，患者、受试者或个体是人。

术语“治疗”涵盖受试者诸如人的本文所述的疾病或障碍的治疗，并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；(ii)减轻疾病或障碍，即使障碍消退；(iii)减缓障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或障碍的一种或多种症状的进展。术语向受试者“施用”单克隆抗体或自然杀伤细胞包括引入或递送抗体或细胞以执行预期功能的任何途径。施用可以通过适用于递送细胞或单克隆抗体的任何途径进行。因此，递送途径可以包括静脉内、肌内、腹膜内或皮下递送。在一些实施例中，例如通过注射到肿瘤中直接向肿瘤施用修饰的

术语“表达”是指基因产物的产生。

如本文所用，术语“细胞毒性”当用于描述效应细胞诸如NK细胞的活性时，涉及通过多种生物学、生物化学或生物物理机制中的任一种杀灭靶细胞。

术语“减少”和“降低”在本文中全部用于指与参考水平相比减少至少10％，例如减少至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或减少最多并且包括减少100％(即，与参考样品相比零水平)，或者与参考水平相比在10％-100％之间的任何减少。

术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的癌症、赘生物或恶性肿瘤中的所有类型，包括白血病、癌和肉瘤。示例性癌症包括脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和髓母细胞瘤。其他实例包括霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌、膀胱癌、恶变前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌和外分泌胰腺赘生物以及前列腺癌。

术语“治疗有效量”或“有效量”是指相对于未治疗的患者，改善疾病症状所要的量。用于实践本披露以治疗性地处理疾病的一种或多种活性化合物的有效量随施用方式、受试者的年龄、体重以及总体健康状况而变化。最终地，主治医生或兽医会决定适当的量以及给药方案。这样的量被称为“有效”量。

为了方便读者，可以在说明书中使用标题或副标题，其不意图影响本披露的范围。另外，本说明书中使用的一些术语在下面更具体地定义。

本文描述了用于转染细胞以产生本文描述的经修饰的细胞的载体。在一个实施例中，本文描述的载体是瞬时表达载体。使用这类载体引入的外源转基因没有整合到细胞的核基因组中；因此，在没有载体复制的情况下，外源转基因将随着时间而降解或稀释。

在一个实施例中，本文描述的载体允许细胞的稳定转染。在一个实施例中，载体允许将一个或多个转基因并入细胞的基因组中。在一个实施例中，载体具有正选择标志物。正选择标志物包括任何基因，所述任何基因允许细胞在杀灭不表达所述基因的细胞的条件下生长。非限制性实例包括抗生素抗性，例如遗传霉素(来自Tn5的Neo基因)。

在一个实施例中，载体是质粒载体。在一个实施例中，载体是病毒载体。如本领域技术人员将理解的，可以使用任何合适的载体。合适的载体是本领域众所周知的。

在一些实施例中，用编码目的蛋白质(例如，CAR)的mRNA转染细胞。mRNA的转染导致蛋白质的瞬时表达。在一个实施例中，在即将施用细胞之前将mRNA转染到

CD19是属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白。其具有单个跨膜结构域、一个细胞质C末端和一个细胞外N末端。CD19是正常和赘生性B细胞以及滤泡树突状细胞的生物标志物，并且通过调节B细胞受体依赖性和独立信号传导关键性参与建立固有B细胞信号传导阈值。

CD19在大多数急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和B细胞淋巴瘤中表达。大多数B细胞恶性肿瘤以正常至高水平表达CD19(ALL为80％，B细胞淋巴瘤为88％并且B细胞白血病为100％)。尽管CD19是B细胞标志物，但其在骨髓恶性肿瘤病例中也已观察到，包括2％的AML病例。Wang等人,Exp.Hematol.Oncol.[实验血液学与肿瘤学],2012年11月29日；1:36。表1显示了与CD19相关的恶性肿瘤的非限制性实例。

表1：CD19和相关的恶性肿瘤

区分肿瘤细胞和来源于同一组织的正常细胞的表型变化通常与特定基因产物表达方面的一种或多种变化有关，包括正常细胞表面组分的丢失或其他细胞表面组分的获得(在相应的正常非癌组织中无法检测到的抗原)。在赘生性细胞或肿瘤细胞中表达但在正常细胞中不表达的抗原或在赘生性细胞中表达的水平大大高于正常细胞中发现的水平的抗原被称为“肿瘤特异性抗原”或“肿瘤相关抗原”。肿瘤特异性抗原已被用作癌症免疫疗法的靶标。一种这样的疗法利用在包括T细胞和NK细胞在内的免疫细胞表面上表达的嵌合抗原受体(CAR)来改善针对癌细胞的细胞毒性。CAR包含连接至至少一个细胞内信号传导结构域的单链可变片段(scFv)。scFv识别并结合靶细胞(例如癌细胞)上的抗原，并触发效应细胞活化。信号传导结构域含有基于免疫受体酪氨酸的活化结构域(ITAM)，ITAM对通过受体的细胞内信号传导非常重要。

本披露提供了已经被工程改造以在细胞表面上表达至少一种嵌合抗原受体(CAR)的

尽管先前的出版物，诸如Haynes等人,2001,J.Immunology[免疫学杂志]166:182-187和Cartellieri等人,2010,J.Biomed and Biotech[生物医学与生物技术杂志],第2010卷,文章ID 956304已经披露CD3ζCAR在根除肿瘤方面可能比FcεRIγCAR有效，但在这种情况下，本发明人惊奇且出乎意料地发现，本文披露的细胞、组合物和方法并非如此。实际上，本发明人发现当本文所披露的

任选地，CAR对CD19具有特异性。在一些实施例中，CD19是人CD19。在一些实施例中，CD19 CAR包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的scFv片段。在一些实施例中，CD19 CAR包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施例中，CD19 t-haNK

在一些实施例中，CD19 CAR多肽包含与SEQ ID NO:10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施例中，可以将表位标签肽，诸如FLAG、myc、聚组氨酸或V5添加至多肽的氨基末端结构域，以通过使用抗表位标签肽单克隆或多克隆抗体来辅助细胞表面检测。

在实例中，使用本领域已知的方法，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来制备变体多肽。可以对克隆的DNA进行位点直接诱变(Carter,1986；Zoller和Smith,1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(Wells等人,1985)或其他已知技术以产生CD16变体(Ausubel,2002；Sambrook和Russell,2001)。

在一些实施例中，将编码CD19 CAR的多核苷酸突变以在不改变CAR的功能的情况下改变编码CAR的氨基酸序列。例如，可以在SEQ ID NO:9或11中进行引起在“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代的多核苷酸取代。

SEQ ID NO:10或12中的保守取代(其中一种类别的氨基酸被相同类别的另一种氨基酸替代)，只要该取代不实质性地改变多肽的活性，即属于所披露的变体的范围内。保守取代是本领域技术人员众所周知的。非保守取代(其影响(1)多肽主链的结构，诸如β-折叠或α-螺旋构象，(2)电荷，(3)疏水性，或(4)靶位点侧链的体积)可以修饰多肽的功能或免疫学特性。非保守取代需要将其中一个类别的成员交换为另一个类别。可以将取代引入保守取代位点或更优选引入非保守位点。

在实例中，使用本领域已知的方法，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来制备变体多肽。可以对克隆的DNA进行位点直接诱变(Carter,1986；Zoller和Smith,1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(Wells等人,1985)或其他已知技术以产生变体(Ausubel,2002；Sambrook和Russell,2001)。

任选地，CD19 t-haNK

在一些实施例中，修饰

表2.说明性Fc受体

在一些实施例中，修饰

在一些实施例中，Fc受体是CD16。出于本披露的目的，参照SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:1(其相对于SEQ ID NO:1在一个位置上不同)指定CD16的特定氨基酸残基。因此，当将CD16多肽与SEQ ID NO:2最大地对准时，CD16多肽“位置158”处的氨基酸残基是对应于SEQID NO:2(或SEQ ID NO:1)的位置158处的氨基酸残基。在一些实施例中，修饰

在一些实施例中，编码CD16多肽的多核苷酸与编码全长(包括信号肽)的天然存在的CD16(其在全长CD16的位置176(对应于成熟CD16蛋白的位置158)处具有苯丙氨酸)的多核苷酸序列具有至少约70％的多核苷酸序列同一性。在一些实施例中，编码CD16多肽的多核苷酸与编码全长(包括信号肽)的天然存在的CD16(其在位置176(对应于成熟蛋白的位置158)处具有缬氨酸)的多核苷酸序列具有至少约70％的多核苷酸序列同一性。在一些实施例中，编码CD16的多核苷酸与SEQ ID NO:13具有至少70％、80％、90％或95％同一性，并且包含在编码全长(包括信号肽)CD16多肽的位置176的多核苷酸位置处编码缬氨酸的密码子。在一些实施例中，编码CD16的多核苷酸包含SEQ ID NO:13，但是具有编码全长CD16的位置176处的缬氨酸的密码子。

在一些实施例中，CD16多核苷酸编码与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70％、80％、90％或95％同一性的多肽。在一些实施例中，多核苷酸编码与SEQ ID NO:2具有至少70％、80％、90％或95％同一性的多肽，并且如参照SEQ ID NO:2所测定，在位置158处包含缬氨酸。在一些实施例中，多核苷酸编码SEQ ID NO:2。在一些实施例中，CD16多核苷酸编码具有或不具有信号序列的CD16的细胞外结构域、或全长CD16的任何其他片段、或包含与另一种蛋白质的氨基酸序列融合的至少部分CD16序列的嵌合受体。在其他实施例中，可以将表位标签肽，诸如FLAG、myc、聚组氨酸或V5添加至成熟多肽的氨基末端结构域，以通过使用抗表位标签肽单克隆或多克隆抗体来辅助细胞表面检测。

在一些实施例中，同源CD16多核苷酸的长度可以是约150至约700、约750或约800个多核苷酸，尽管具有超过700至800个多核苷酸的CD16变体在本披露的范围内。

同源多核苷酸序列包括编码对CD16变体进行编码的多肽序列的那些序列。同源多核苷酸序列还包括与SEQ ID NO:1有关的天然存在的等位基因变异。用编码具有SEQID.NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、其天然存在的变体或与SEQ ID.NO:1或SEQ ID NO:2至少70％相同或至少80％、90％或95％相同的序列的任何多核苷酸转染

在其他实例中，具有改变CD16氨基酸序列的多态性的cDNA序列用于修饰

可以使用本领域已知的方法，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来制备变体多肽。可以对克隆的DNA进行位点直接诱变(Carter,1986；Zoller和Smith,1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(Wells等人,1985)或其他已知技术以产生CD16变体(Ausubel,2002；Sambrook和Russell,2001)。

在一些实施例中，将编码CD16的多核苷酸突变以在不改变CD16的功能的情况下改变编码CD16的氨基酸序列。例如，可以在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中进行引起在“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代的多核苷酸取代。

SEQ ID.NO:1或SEQ ID NO:2中的保守取代(其中一种类别的氨基酸被相同类别的另一种氨基酸替代)，只要该取代不实质性地改变多肽的活性，即属于所披露的CD16变体的范围内。保守取代是本领域技术人员众所周知的。非保守取代(其影响(1)多肽主链的结构，诸如β-折叠或α-螺旋构象，(2)电荷，(3)疏水性，或(4)靶位点侧链的体积)可以修饰CD16多肽的功能或免疫学特性。非保守取代需要将其中一个类别的成员交换为另一个类别。可以将取代引入保守取代位点或更优选引入非保守位点。

在一些实施例中，CD16多肽变体的长度为至少200个氨基酸，并且与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70％的氨基酸序列同一性，或至少80％或至少90％的同一性。在一些实施例中，CD16多肽变体的长度为至少225个氨基酸，并且与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70％的氨基酸序列同一性，或至少80％或至少90％的同一性。在一些实施例中，如参照SEQ ID NO:2所测定，CD16多肽变体在位置158处具有缬氨酸。

在一些实施例中，编码CD16多肽的核酸可以编码CD16融合蛋白。CD16融合多肽包括与非CD16多肽融合的任何CD16部分或整个CD16。使用重组方法方便地产生融合多肽。例如，将编码CD16多肽例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多核苷酸与非CD16编码多核苷酸(诸如编码异源蛋白质的信号肽的多核苷酸序列)框内融合。在一些实施例中，可以产生融合多肽，其中异源多肽序列与CD16的C末端融合或位于CD16的内部。典型地，多达约30％的CD16细胞质结构域可以被替换。这样的修饰可以增强表达或增强细胞毒性(例如，ADCC应答性)。在其他实例中，嵌合蛋白(诸如来自其他淋巴细胞活化受体的结构域，包括但不限于Ig-a，Ig-B，CD3-e，CD3-d，DAP-12和DAP-10)取代了一部分CD16细胞质结构域。

融合基因可以通过常规技术合成，包括自动DNA合成仪和使用锚定引物的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续基因片段之间产生互补的突出端，所述两个连续基因片段随后可以进行退火并再扩增以生成嵌合基因序列(Ausubel，2002)。许多载体是可商购的，其有助于将CD16框内亚克隆到融合部分。

在一个实施例中，修饰

在一个实施例中，将IL-2克隆并用将IL-2引导至内质网(erIL-2)的信号序列(SEQID NO:7)表达。这允许IL-2以足以自分泌活化的水平表达，但不会在细胞外释放IL-2。参见Konstantinidis等人“Targeting IL-2to the endoplasmic reticulum confinesautocrine growth stimulation to

术语“自杀基因”是指允许对表达自杀基因的细胞进行负选择的转基因。自杀基因被用作安全系统，允许表达该基因的细胞通过引入选择剂而被杀灭。在重组基因引起导致不受控制的细胞生长的突变或者细胞本身能够进行这种生长情况下，这是理想的。已经鉴定出许多自杀基因系统，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌gpt基因和大肠杆菌Deo基因。典型地，自杀基因编码的蛋白质对细胞没有不良影响，但是在存在特定化合物的情况下会杀灭细胞。因此，自杀基因典型地是系统的一部分。

在一个实施例中，自杀基因在

在另一个实施例中，自杀基因是胞嘧啶脱氨酶，其在5-氟胞嘧啶存在下对细胞有毒。Garcia-Sanchez等人,“Cytosine deaminase adenoviral vector and 5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells 1million-fold when theycontaminate hematopoietic cells:apotential purging method for autologoustransplantation[当乳腺癌细胞污染造血细胞时，胞嘧啶脱氨酶腺病毒载体和5-氟胞嘧啶选择性地将乳腺癌细胞降低100万倍：这是自体移植的潜在清除方法].”Blood.[血液]1998年7月15日；92(2):672-82。

在另一个实施例中，自杀基因是细胞色素P450，其在异环磷酰胺或环磷酰胺存在下有毒。参见例如，Touati等人“A suicide gene therapy combining the improvementofcyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development of an anti-tumorimmune response[组合了环磷酰胺肿瘤细胞毒性的改进与抗肿瘤免疫反应的发展的自杀基因疗法].”Curr Gene Ther.[当前基因疗法]2014；14(3):236-46。

在另一个实施例中，自杀基因是iCasp9。Di Stasi,(2011)“Inducible apoptosisas a safety switch for adoptive cell therapy[诱导型凋亡作为过继细胞治疗的安全开关].”N Engl J Med[新英格兰医学杂志]365:1673-1683。还参见Morgan,“Live and LetDie:A New Suicide Gene Therapy Moves to the Clinic[生存和死亡：一种新型自杀基因疗法转向临床]”Molecular Therapy[分子疗法](2012)；20:11-13。iCasp9在小分子AP1903存在下诱导凋亡。AP1903是生物学惰性的小分子，在临床研究中已显示出良好的耐受性，并已用于过继细胞疗法背景中。

在一些实施例中，将用于转化aNK细胞的构建体的序列密码子优化以最大化人系统中CD19 CAR、CD16和/或erIL-2的表达效率。密码子优化典型地通过用表达系统基因中更常用或最常用的密码子替换天然序列中的至少一个、超过一个或大量密码子进行核酸序列修饰来进行。密码子优化可以用于翻译的评价，或产生与使用非优化序列产生的转录本相比，具有所需特性诸如更长的半衰期的重组RNA转录本。密码子优化的方法是容易获得的，例如，GeneArt

可以通过本领域技术人员已知的任何机制将转基因工程改造进入表达载体。在将多个转基因插入细胞中的情况下，可以将转基因工程改造进入相同的表达载体或不同的表达载体中。

在一些实施例中，用编码待表达的转基因蛋白的mRNA转染细胞。

可以使用本领域已知的任何转染方法(包括但不限于感染、电穿孔、脂质转染、核转染或“基因枪”)将转基因和mRNA引入

本披露提供了一种表达CD19 CAR和FcR的修饰的

在一些实施例中，修饰的

在一些实施例中，FcR是CD16。在一些实施例中，CD16是高亲和力CD16，其包含SEQID NO:2或由SEQ ID NO:2组成。在一些实施例中，IL-2是erIL-2，其包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成。

在一些实施例中，CD19 CAR编码序列与CD16编码序列由编码自切割肽的序列分隔，以产生由相同mRNA编码的CD19 CAR和CD16的等摩尔表达水平。自切割肽及其编码序列是众所周知的，例如，如Wang等人,Scientific Reports 5[科学报道5]，文章编号16273(2015)中所披露，其相关披露内容通过引用并入本文中。自切割肽的非限制性实例包括猪破伤风病毒-12A(P2A)、扁刺蛾病毒(thosea asigna virus)2A(T2A)、马鼻炎A病毒2A(E2A)、细胞质多角体病毒(BmCPV 2A)和家蚕(B.mori)的软化病病毒(BmIFV 2A)。在一些实施例中，自切割肽是由SEQ ID NO:8编码的P2A肽：ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct。

在一些实施例中，CD16编码序列和erIL-2编码序列由内部核糖体进入序列(IRES)分隔，该内部核糖体进入序列允许由从核酸序列转录的mRNA的内部区域起始翻译。

在一些实施例中，

为了产生表达CAR和CD16(例如，高亲和力CD16)和erIL-2的修饰的

IL-2的表达可以通过修饰的

任选地，可以使用本领域众所周知的方法，例如通过ELISA，在各个时间点测量转化的

在一些实施例中，测量培养上清液中的IL-2水平，以确定释放到细胞培养基中的IL-2的水平。在一些实施例中，测量细胞沉淀中的IL-2水平以评定IL-2的总细胞内水平。在一些实施例中，测量上清液中的IL-2量和细胞沉淀中的IL-2量两者，以确定由转化的

任选地，可以通过流式细胞术测量转化的

任选地，可以使用基于流的细胞毒性测定评定用三顺反子质粒转化的

任选地，还可以使用本领域众所周知的方法测试用三顺反子质粒转化的

替代性地，还可以使用钙黄绿素释放测定评定产生的

每个测定中使用的效应子与靶标的比率可以变化，任选地，效应子:靶标比率可以是20:1、15:1、10:1、8:1或5:1；优选地，效应子:靶标比率是10:1。靶细胞可以是表达抗原分子的任何细胞，该抗原分子可以被

任选地，评定的

任选地，进行转化的

本披露还提供了一种治疗处于疾病任何阶段的受试者的任何类型的癌症的方法。合适的癌症的非限制性实例包括癌、黑色素瘤或肉瘤。在一些实施例中，本发明用于治疗造血来源的癌症，诸如白血病或淋巴瘤。在一些实施例中，癌症是实体瘤。

在一些实施例中，治疗受试者的任何类型的癌症的方法包括向患者施用治疗有效量的上述

还提供了用本文所述的修饰的

修饰的

在其他实施例中，可以以约1000个细胞/注射/m

在其他实施例中，

在其他实施例中，总剂量可以按m

在其他实施例中，

在一些实施例中，以包含

包含

用于体内或体外使用的这些组合物可以通过用于细胞的灭菌技术来灭菌。这些组合物可以含有接近生理条件所需的可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些配制品和/或其他药剂中的细胞浓度可以变化，并且将根据所选择的特定施用模式和受试者的需要，主要根据流体体积、粘度、体重等进行选择。

在一个实施例中，将

在一些实施例中，

在一个实施例中，其他癌症药剂是抗体。在一个实施例中，将

在一些实施例中，将本披露的

表3.说明性的治疗性单克隆抗体

FDA批准的治疗性单克隆抗体的实例

FDA批准的治疗性单克隆抗体的实例

此类

在一些实施例中，静脉内施用

因此，本披露提供了一种治疗有需要的患者的癌症或病毒感染的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的本文所披露的

还披露了使用包含本文所述的多种

在某些实施例中，试剂盒可以含有其他化合物，诸如治疗活性化合物或欲在施用

在各种实施例中，试剂盒的使用说明书将包括在治疗癌症或感染性疾病中使用试剂盒组分的指导。说明书可以进一步含有关于如何处理

在某些实施例中，试剂盒进一步包含一个或多个填充有本文所述的一种或多种组合物，例如包含本文所述的

披露了如下材料、组合物和组分，其可以用于披露的方法和组合物的产物，可以与这些产物结合使用，可以用于制备这些产物，或披露了这些产物。本文披露了这些和其他材料，并且应理解，当披露这些材料的组合、亚群、相互作用、基团等时，尽管这些化合物的各个单独和总体组合以及变换的具体提及可能未明确披露，但每个都在本文中进行了特别设想和描述。例如，除非特别相反地指示，否则如果披露并讨论了一种方法，并且讨论了可对多个分子进行的多个修饰(包括该方法)，则特别地设想该方法的每种和每个组合和变换以及可能的修饰。同样地，也特别设想和披露其任何亚群或组合。此概念适用于本披露的所有方面，包括但不限于使用所披露组合物的方法中的步骤。因此，如果可以进行多个其他的步骤，则应理解，这些其他的步骤中的每一个均可以用所披露方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来进行，并且特别设想并且应该认为披露每个此种组合或组合的亚群。

实例

以下实例仅用于说明目的，并且不应解释为具有限制性。本领域技术人员可以使用多种替代技术和程序，这些替代技术和程序将类似地允许人们成功地进行以下实例。

将CD19 CAR克隆到三顺反子质粒pNEUKv l FcR_IL-2载体中，该载体也含有CD16和erIL-2转基因。将这些三顺反子质粒电穿孔到aNK细胞中。通过IL-2缺乏培养基选择表达CD19 CAR的

将多克隆CD19 t-haNK

将多克隆和克隆CD19 t-haNK

将aNK细胞在补充有5％热灭活的人AB血清(来自CMV阴性的测试供体)和500IU/ml重组人IL-2的生长培养基中培养。

将haNK细胞在补充有5％热灭活的人AB血清(来自CMV阴性的测试供体)且不含IL-2的生长培养基中培养。

将K562细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清和抗生素/抗真菌剂混合物的RPMI-1640中培养。每2-5天或每当培养基出现黄色时就将K562细胞传代。

将SUP-B15和SUP-B15

通过离心收集细胞，在FACS缓冲液(5％FBS在1X D-PBS中的溶液)中洗涤两次，并再悬浮于1ml FACS缓冲液中。为进行表面蛋白的直接荧光团偶联的抗体染色，将细胞与适当的偶联抗体(或同种型对照)在4℃下在黑暗中一起孵育20分钟，然后用FACS缓冲液洗涤两次。为了检测CAR蛋白，将细胞与生物素化的抗F(ab')

从再悬浮于补充有5％热灭活的人AB血清的生长培养基中的初始浓度1x10

倍增时间(小时)＝

[持续时间(小时)x log(2)]/[log(最终细胞密度)-log(初始细胞密度)]

通过将细胞培养物上下移液使悬浮生长的细胞系再悬浮。通过自动计数(锥虫蓝排除法)确定细胞活力。用CFSE染料标记靶细胞，并在补充有10％热灭活的FBS和抗生素/抗真菌剂的RPMI-1640中将靶细胞和效应细胞稀释至所需的细胞浓度。将效应细胞和靶细胞以不同的效应子与靶标(E:T为20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.62:1、0.31:1和0.15:1)比率在96孔板中混合，并在5％CO2氛围和37℃下的孵育箱中共孵育4h。然后添加PI以对死细胞进行荧光标记，并在MACSquant流式细胞术装置上分析该测定。

通过将细胞培养物上下移液使悬浮生长的细胞系再悬浮。通过自动计数(锥虫蓝排除法)确定细胞活力。用PKH67-GL染料标记靶细胞，并在补充有10％热灭活的FBS和抗生素/抗真菌剂的RPMI-1640中将靶细胞和效应细胞稀释至所需的细胞浓度。在室温下将靶细胞与单克隆抗体曲妥珠单抗、利妥昔单抗或无抗体一起预孵育30min。然后将抗体标记的靶细胞(和无抗体对照)和效应细胞以不同的效应子与靶标比率(E:T为20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.62:1、0.31:1和0.15:1)在96孔板中混合，并在5％CO

将用于分析的细胞在D-PBS中洗涤1次，以去除残留的培养基，再悬浮于新鲜的生长培养基中，并一式三份地分别以10

通过流式细胞术测量CD19 t-haNK

在一个独立的实验中，通过流式细胞术关于CD19CAR(通过生物素化的F(ab')

表4.确定CD19 t-haNK

通过抗体染色和流式细胞术确定了所选的CD19 t-haNK

表5.确定CD19 t-haNK

CD19 t-haNK

在一个独立的实验中，所选的CD19 t-haNK

图5A显示CD19 t-haNK

在一个独立的实验中，将所选的CD19 t-haNK

图6A显示，当与抗Her2/neu抗体赫赛汀组合时，CD19 t-haNK

在另一个实验中，将所选的CD19 t-haNK

在不改变培养基的情况下，通过7天的细胞生长测定确定所选CD19 t-haNK

将CD19 t-haNK

CD19 t-haNK

先前已经显示，表达针对CD19的嵌合抗原受体(CAR)的靶向aNK细胞在Raji荷瘤NSG小鼠中表现出功效，这很可能是由于CAR表达细胞中的靶标特异性细胞毒性(参见，例如，Oelsner等人,Cytotherapy[细胞疗法],2017)。在此研究中，在Raji异种移植模型的两个不同变体中评价了CD19 t-haNK

CD19 t-haNK

测试动物：使用的测试动物是在研究开始(隔离后)时9-10周龄并且在研究开始时体重在20-27克之间的雌性NOD.Cg-Prkdc

Raji癌细胞系：Raji细胞最初购自ATCC(目录号CCL-86

Raji静脉内模型：用27号针通过侧尾静脉向20只动物静脉内注射0.2mL Raji细胞悬浮液(1x10

Raji皮下模型：用25号针在两个侧腹向12只动物皮下植入0.1mL Raji细胞悬浮液(2.5x10

静脉内Raji模型：在癌细胞接种后的24小时内(其被定义为第1天)，根据体重将20只动物伪随机分为2组，每组10只，以实现组间类似的平均体重。在第2、5、8、10、12和17天，通过离心收获在指数期生长的CD19 t-haNK

在注射肿瘤细胞之前将动物称重，并且每周称重两次。每天观察动物的死亡率/发病率(G0至G4)和毒性的临床征象(T1至T12；参见表6)。将瘫痪或濒死的动物安乐死。通过吸入CO

皮下Raji模型：皮下植入肿瘤后，每周至少两次检查动物的肿瘤形成情况。当肿瘤变得明显时，每周用数字手持卡尺测量肿瘤体积(TV)一次至两次，并使用此式计算：TV＝长度x宽度

每天观察动物的死亡率/发病率(G0至G4)和毒性的临床征象(T1至T12)。将瘫痪或濒死的动物安乐死。一旦濒死的动物表现出发病就将其安乐死，而对存活的动物进行预定安乐死以收集组织。具体地，在第13天，在测试物施用的最后一次剂量后6小时，将存活动物的一半(最多3只小鼠/组)安乐死。在第15天，在最后一次给药后48小时，将其余动物安乐死。安乐死通过在动物在最终心脏内出血后处于深度麻醉状态时进行颈脱位来进行。在此部分研究中未对血液/血清样品进行分析，因此不包括在此报告中。

终止后，进行尸检，并收集具有明显肉眼可见病变的器官，固定在10％福尔马林中，并送至合同病理实验室(第七波实验室(Seventh Wave Laboratories))进行肿瘤/转移性疾病负荷的组织学评价。

表6：研究设计(简略)

IR，照射(1000cGy)；非IR，非照射；IV，静脉内；SC，皮下；Tx，治疗。

使用以下等式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝长度x宽度

肿瘤生长抑制(TGI)计算如下进行：TGI＝(T

通过2因素ANOVA，随后通过Tukey检验进行多重比较来分析肿瘤生长曲线。通过对数秩(Mantel-Cox)检验分析存活曲线。通过未配对的2尾t检验分析各天肝脏转移性疾病负荷的差异。P<0.05被认为是统计学上显著的。所有统计分析均使用GraphPad Prism 7版进行。

静脉内肿瘤模型中的主要读数是动物存活期。当发现动物死亡或因疾病相关的发病和/或瘫痪而被安乐死时，计数死亡事件。如图9所示，与媒介物对照相比，CD19 t-haNK

皮下肿瘤模型中的主要读数是肿瘤生长。如图11所示，与媒介物对照组相比，CD19t-haNK

此外，由于Raji是一种侵袭性淋巴瘤模型，因此，即使在皮下接种时，癌细胞也能够扩散并产生多个转移位点，从而最终导致动物发病和/或死亡。在媒介物组中，在第11天和第13天之间共有3只动物(50％)濒死，因此被安乐死。相反，在CD19 t-haNK

另外，在尸检期间在CD19 t-haNK

表7：皮下Raji模型中动物的死亡/死亡记录

预定：预定的安乐死以进行组织收集。

表8：肝脏肿瘤细胞的受累百分比

为了评定CD19 t-haNK

对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外，更多修改是可能的。因此，本发明主题仅受限于所附权利要求的范围。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包含”(“comprises”和“comprising”)应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。当说明书权利要求涉及选自由A、B、C……和N组成的组中的至少一种时，该文字应解释为只需要该组中的一个要素，而不是A加N、或B加N等。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种NK-92细胞，其表达CD19 CAR和Fc受体，其中该NK-92细胞包含多顺反子DNA构建体，并且其中该多顺反子构建体编码该CD19 CAR和该Fc受体，并且其中该多顺反子构建体还包含编码IL-2或其变体或IL-15或其变体的序列。

2.取消。

3.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该Fc受体是CD16。

4.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该Fc受体包含SEQ ID NO:2。

5.取消。

6.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该IL-2变体是erIL-2或其中该IL-15变体是erIL-15。

7.如权利要求6所述的NK-92细胞，其中该CD19 CAR、该Fc受体、该erIL-15或erIL-2中的一种或多种的编码序列经密码子优化以在人系统中表达。

8.如权利要求1-7中任一项所述的NK-92细胞，其中NK-92细胞能够杀灭CD19表达细胞。

9.如权利要求8所述的NK-92细胞，其中该CD19表达细胞是肿瘤细胞。

10.如权利要求9所述的NK-92细胞，其中该肿瘤细胞是SUP-B15细胞。

11.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该CD19 CAR包含scFv抗体片段。

12.如权利要求11所述的NK-92细胞，其中该scFv抗体片段具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

13.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该多顺反子构建体包含SEQ ID NO:9的序列，其中该序列编码该scFv抗体片段。

14.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该NK-92细胞包含编码自切割肽的序列，其中该序列位于该CD19 CAR与CD16之间，并且其中该序列允许等摩尔表达该CD19 CAR和该FcR。

15.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该NK-92细胞在编码CD16的序列与编码IL-2或其变体的序列或者编码IL-15或其变体的序列之间包含内部核糖体进入序列(IRES)。

16.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中当效应子与靶标的比率为10时，该NK-92细胞对CD19表达细胞的直接细胞毒性为70％-100％。

17.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中当效应子与靶标的比率为10时，该NK-92细胞的ADCC活性为30％-90％。

18.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该CD19 CAR包含与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的序列。

19.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该CD19 CAR包含细胞质信号传导结构域。

20.如权利要求19所述的NK-92细胞，其中该细胞质信号传导结构域是Fcε受体γ(FcεRIγ)。

21.一种试剂盒，其包含含有如权利要求1所述的NK-92细胞的药物组合物。

22.一种用于产生NK-92细胞的方法，该方法包括：

提供多顺反子载体，其中该多顺反子载体编码CD19 CAR和CD16以及IL-2或IL-15，以及

将该载体引入NK-92细胞中以产生该NK-92细胞。

23.取消。

24.如权利要求22所述的方法，其中该载体包含编码自切割肽的序列，其中该序列位于CAR与CD16之间，并且其中该序列允许等摩尔表达CAR和CD16。

25.如权利要求22所述的方法，其中该载体在CD16编码序列与IL-2或IL-15编码序列之间包含内部核糖体进入序列(IRES)。

26.一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者向该受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包含多种如权利要求1所述的NK-92细胞。

27.如权利要求26所述的方法，其中向该受试者施用约1x10

28.如权利要求26所述的方法，其中该癌症是白血病或淋巴瘤。

29.如权利要求26所述的方法，其中该癌症是以下中的一种或多种：B细胞恶性肿瘤、HSCT后的B细胞恶性肿瘤、CLL、B-ALL、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、UCBT后的B谱系淋巴系统恶性肿瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B-非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)、HSCT后ALL；淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤或淋巴母细胞性白血病。

30.如权利要求29所述的方法，其中该B细胞恶性肿瘤是套细胞淋巴瘤。

31.如权利要求26所述的方法，其中静脉内施用多个所述NK-92细胞。

32.如权利要求26所述的方法，其中肿瘤内施用多个所述NK-92细胞。

33.一种向个体施用NK细胞的方法，该方法包括施用包含表达CD19 CAR的NK细胞的第一组合物和包含原代NK细胞的第二组合物。