从条件性重编程细胞获得动物模型的方法以及该动物模型用于筛选抗肿瘤药物的用途

技术领域

本发明涉及一种用于将从患者的肿瘤活检样本中获得的原代肿瘤细胞在体内和体外条件下培养的组合物、一种将所获得的原代肿瘤细胞在该组合物中培养的方法、一种使用该动物模型获得用于筛选抗肿瘤药效的动物模型的方法。

背景技术

条件性重编程(CR)是一种可用于快速有效地从正常细胞和患病细胞(包括肿瘤细胞)建立来源于患者的细胞培养物的细胞培养技术。CR的最大优势在于其可以从患者组织样本中快速有效地扩增细胞培养物。这使得研究者可以足够快地筛选肿瘤对抗癌药物或免疫疗法的敏感性，从而提供临床使用信息。

在动物模型中测试抗肿瘤药物的功效是重要的，因为此类动物模型对于抗肿瘤药物筛选是重要的。此类动物模型将模拟患者的体内环境，反映出患者的响应，因此更加有效。为了建立动物模型，本领域技术人员通常需要获得数量足够多的肿瘤细胞。然而，从患者获得的肿瘤样本可能包含非常少量或者甚至微量的肿瘤细胞，这取决于获得它们的方式。例如，从穿刺活检获得的肿瘤样本可能包含非常少量的肿瘤细胞，因此，本领域技术人员难以使用它们来建立用于筛选抗肿瘤药物的所需动物模型。

通过条件性重编程而进行的肿瘤细胞永生化是针对基于细胞的诊断、药敏实验和体外生物样本库而产生培养肿瘤细胞的非常重要的工具。但是，如何有效且成功地培养从患者获得的原代肿瘤细胞(特别是从例如穿刺活检获得少量或者甚至微量的细胞样本)依然是一项挑战。

发明内容

为了解决上述问题，对于来自多种肿瘤类型的原代肿瘤细胞，本发明人针对永生化成功地进行了条件性重编程，并使用经过条件性重编程的肿瘤细胞来建立用于测试抗肿瘤药物的动物模型。原代肿瘤细胞从手术组织、活检或穿刺活检样本中获得。本发明中获得的条件性重编程的原代肿瘤细胞显示出典型的克隆样生长，且在低温冻存后保持良好。一些情况下，细胞可多次传代，变成有用的细胞系。与原代肿瘤细胞一样，条件性重编程的肿瘤细胞对于在体外测试药物敏感性是可靠的。本发明人已经成功地将条件性重编程的肿瘤细胞(CRC)植入到用于测试药效的动物模型中，并使用该动物模型来筛选抗肿瘤药物。本发明还公开了条件性重编程的肿瘤细胞在药效试验中的用途。

本发明的一个方面提供了一种获得用于筛选抗肿瘤药物的动物模型的方法，其包括：

(1)在组合物中培养从患者的肿瘤活检样本获得的原代肿瘤细胞，该组合物包含：

a)0.01-1.0mg/L氢化可的松；

b)1.0-10.0mg/L菊粉；

c)1.0-20.0μg/L霍乱毒素；

d)2.0-50.0mg/L腺嘌呤；

e)1.0-30.0μg/L EGF；

f)1.0-30.0μmol/L Y-27632；

g)青霉素/链霉素(Pen/Strep)；

h)2-20％FBS；

i)F12培养基；

j)高糖DMEM，以及可选地

k)非必需氨基酸溶液；

l)GlutaMAX补充剂；

(2)将步骤(1)中获得的原代肿瘤细胞植入到动物中。在实施方案中，本发明方法的步骤(1)中的组合物包含：

a)0.3-0.5mg/L，优选0.4mg/L氢化可的松；

b)4-6mg/L，优选5mg/L菊粉；

c)7-9μg/L，优选8.3μg/L霍乱毒素；

d)20-30mg/L，优选24.2mg/L腺嘌呤；

e)8-12μg/L，优选10μg/L EGF；

f)8-12μmol/L，优选10μmol/L Y-27632；

g)青霉素/链霉素；

h)8-12％，优选10％FBS；

i)F12培养基；

j)高糖DMEM，以及可选地

k)非必需氨基酸溶液；

l)GlutaMAX补充剂。

在实施方案中，该肿瘤活检样本是穿刺活检样本。在实施方案中，从穿刺活检中获得的样本中原代肿瘤细胞的浓度小于约2mol/L、小于约1.9mol/L、小于约1.8mol/L、小于约1.7mol/L、小于约1.6mol/L、小于约1.5mol/L、小于约1.4mol/L、小于约1.3mol/L、小于约1.2mol/L、小于约1.1mol/L、小于约1.0mol/L、小于约0.9mol/L、小于约0.8mol/L、小于约0.7mol/L、小于约0.6mol/L、小于约0.5mol/L、小于约0.4mol/L、小于约0.3mol/L、小于约0.2mol/L、小于约0.1mol/L或更少，例如小于约2mol/L、小于约1.7mol/L、小于约0.8mol/L、小于约0.64mol/L、小于约0.59mol/L。在实施方案中，原代肿瘤细胞与滋养层细胞一起在步骤(1)的组合物中进行培养，尤其地，该滋养层细胞是小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞。在实施方案中，该MEF细胞用丝裂霉素C处理过。

在实施方案中，本发明中的动物是小鼠或大鼠，尤其是免疫缺陷小鼠，例如裸鼠。在实施方案中，步骤(1)中获得的原代肿瘤细胞在中空纤维中被植入动物中。在实施方案中，中空纤维由改良聚偏氟乙烯制成，更具体而言，中空纤维由改良聚偏氟乙烯制成，且可截留分子量为500000道尔顿。

本发明的另一个方面提供了一种通过本发明的方法获得的用于筛选抗肿瘤药物的动物模型。在实施方案中，本发明中的动物是小鼠或大鼠，尤其是免疫缺陷小鼠，例如裸鼠。

本发明的另一个方面提供了一种使用本发明的动物模型来筛选抗肿瘤药物的方法，该方法包括向本发明的动物模型施用候选药物。在实施方案中，上述方法还包括在本发明的动物模型中测量肿瘤细胞生长。

附图说明

图1示出了来自各种肿瘤样本的克隆样生长中的条件性重编程细胞的形态。A，条件性重编程的原代细胞的P0、P4和P6代源自肺癌患者的手术样本；B，P3条件性重编程的细胞源自肺癌患者的活检样本；C，P4条件性重编程的细胞源自腺样囊性癌患者的穿刺活检样本；D，P12细胞源自腹膜间皮瘤患者的穿刺活检样本；E，P7细胞源自恶性胶质瘤患者的手术样本；F，P6细胞源自结直肠癌患者的活检样本；G，P3细胞源自胆囊癌患者的手术样本。

图2A，受试药物在MDX079 Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果；B，受试药物在MDX083 Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果；C，受试药物在MDX095 Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果；D，受试药物在MDX107 Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果；E，受试药物在MDX123Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果。

图3A，受试药物在MDX133 Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果；B，受试药物在MDX154 Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果；C，受试药物在MDX164 Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果；D，受试药物在MDX165 Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果；E，受试药物在MDX168Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果；F，受试药物在MDX169 Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果；G，受试药物在MDX174 Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果；H，受试药物在MDX186 Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果；I，受试药物在MDX189 Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果；J，受试药物在MDX203 Mini-PDX模型中的抗肿瘤药效的结果。

具体实施方式

本发明的一个方面提供了一种获得用于筛选抗肿瘤药物的动物模型的方法，该方法包括(1)在组合物中培养从患者的肿瘤活检样本中获得的原代肿瘤细胞，该组合物包含：

a)0.01-1.0mg/L氢化可的松；

b)1.0-10.0mg/L菊粉；

c)1.0-20.0μg/L霍乱毒素；

d)2.0-50.0mg/L腺嘌呤；

e)1.0-30.0μg/L EGF；

f)1.0-30.0μmol/L Y-27632；

g)青霉素/链霉素；

h)2-20％FBS；

i)F12培养基；

j)高糖DMEM，以及可选地

k)非必需氨基酸溶液；

l)GlutaMAX补充剂；以及

(2)将步骤(1)中获得的原代肿瘤细胞植入到动物中。在实施方案中，肿瘤活检样本是穿刺活检样本。在实施方案中，通过穿刺活检获得的样本中肿瘤细胞的浓度小于约2mol/L。

步骤(1)的组合物中氢化可的松的浓度可以为0.01-1.0mg/L，尤其为约0.05-1.0mg/L、约0.1-1.0mg/L、约0.1-0.9mg/L、约0.2-0.8mg/L、约0.2-0.7mg/L、约0.25-0.65mg/L、约0.25-0.6mg/L、约0.3-0.5mg/L、约0.35-0.55mg/L、约0.35-0.4mg/L、约0.4-0.45mg/L、约0.35-0.45mg/L、约0.45-0.55mg/L、约0.05mg/L、约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.31mg/L、约0.32mg/L、约0.33mg/L、约0.34mg/L、约0.35mg/L、约0.36mg/L、约0.37mg/L、约0.38mg/L、约0.39mg/L、约0.4mg/L、约0.41mg/L、约0.42mg/L、约0.43mg/L、约0.44mg/L、约0.45mg/L、约0.46mg/L、约0.47mg/L、约0.48mg/L、约0.49mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、约1.0mg/L。

步骤(1)的组合物中胰岛素的浓度可以为1.0-10mg/L，尤其为约1-10mg/L、约2-9mg/L、约3-8mg/L、约3-7mg/L、约4.5-6.5mg/L、约4-6mg/L、约1mg/L、约2mg/L、约3mg/L、约4mg/L、约5mg/L、约6mg/L、约7mg/L、约8mg/L、约9mg/L、约10mg/L。

步骤(1)的组合物中霍乱毒素的浓度可以为1-20μg/L，尤其为约2-20μg/L、约3-18μg/L、约4-15μg/L、约5-10μg/L、约6-10μg/L、约7-9μg/L、约7.5-8.5μg/L、约1μg/L、约2μg/L、约3μg/L、约4μg/L、约5μg/L、约6μg/L、约7μg/L、约8μg/L、约8.1μg/L、约8.2μg/L、约8.3μg/L、约8.4μg/L、约8.5μg/L、约8.6μg/L、约8.7μg/L、约8.8μg/L、约8.9μg/L、约9μg/L、约10μg/L、约11μg/L、约12μg/L、约13μg/L、约14μg/L、约15μg/L、约16μg/L、约17μg/L、约18μg/L、约19μg/L、约20μg/L。

步骤(1)的组合物中腺嘌呤的浓度可以为2-50mg/L，尤其为约5-40mg/L、约10-30mg/L、约15-30mg/L、约20-30mg/L、约22-27mg/L、约23-26mg/L、约24-25mg/L、约2mg/L、约6mg/L、约8mg/L、约10mg/L、约12mg/L、约14mg/L、约16mg/L、约18mg/L、约20mg/L、约21mg/L、约22mg/L、约23mg/L、约24mg/L、约24.1mg/L、约24.2mg/L、约24.3mg/L、约24.4mg/L、约24.5mg/L、约24.6mg/L、约24.7mg/L、约24.8mg/L、约24.9mg/L、约25mg/L、约26mg/L、约27mg/L、约28mg/L、约29mg/L、约30mg/L、约35mg/L、约40mg/L。

步骤(1)的组合物中EGF的浓度可以为1-30μg/L，尤其为约2-20μg/L、约4-18μg/L、约6-16μg/L、约8-12μg/L、约9-11μg/L、约9.5-10.5μg/L、约2μg/L、约4μg/L、约6μg/L、约7μg/L、约8μg/L、约9μg/L、约10μg/L、约11μg/L、约12μg/L、约14μg/L、约16μg/L、约18μg/L、约20μg/L、约25μg/L、约30μg/L。

步骤(1)的组合物中Y-27632的浓度可以为1-30μmol/L，尤其为约2-20μmol/L、约4-18μmol/L、约6-16μmol/L、约8-12μmol/L、约9-11μmol/L、约9.5-10.5μmol/L、约2μmol/L、约4μmol/L、约6μmol/L、约7μmol/L、约8μmol/L、约9μmol/L、约10μmol/L、约11μmol/L、约12μmol/L、约14μmol/L、约16μmol/L、约18μmol/L、约20μmol/L、约25μmol/L、约30μmol/L。

步骤(1)的组合物中FBS的浓度可以为2-20％，尤其为约4-15％、约5-18％、约6-16％、约7-14％、约8-12％、约9-11％、约9.5-10.5％、约2％、约4％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约14％、约16％、约18％、约20％。

在实施方案中，本发明提供了一种用于获得用于筛选抗肿瘤药物的动物模型的方法，该方法包括(1)在组合物中培养从患者的肿瘤活检样本中获得的原代肿瘤细胞，该组合物包含：

a)0.3-0.5mg/L，优选0.4mg/L氢化可的松；

b)4-6mg/L，优选5mg/L菊粉；

c)7-9μg/L，优选8.3μg/L霍乱毒素；

d)20-30mg/L，优选24.2mg/L腺嘌呤；

e)8-12μg/L，优选10μg/L EGF；

f)8-12μmol/L，优选10μmol/L Y-27632；

g)青霉素/链霉素；

h)8-12％，优选10％FBS；

i)F12培养基；

j)高糖DMEM，以及可选地

k)非必需氨基酸溶液；

l)GlutaMAX补充剂；以及

(2)将步骤(1)中获得的原代肿瘤细胞植入到动物中。在实施方案中，肿瘤活检样本是穿刺活检样本。在实施方案中，通过穿刺活检获得的样本中原代肿瘤细胞的浓度小于约2mol/L、小于约1.9mol/L、小于约1.8mol/L、小于约1.7mol/L、小于约1.6mol/L、小于约1.5mol/L、小于约1.4mol/L、小于约1.3mol/L、小于约1.2mol/L、小于约1.1mol/L、小于约1.0mol/L、小于约0.9mol/L、小于约0.8mol/L、小于约0.7mol/L、小于约0.6mol/L、小于约0.5mol/L、小于约0.4mol/L、小于约0.3mol/L、小于约0.2mol/L、小于约0.1mol/L或更少，例如小于约2mol/L、小于约1.7mol/L、小于约0.8mol/L、小于约0.64mol/L、小于约0.59mol/L。在实施方案中，原代肿瘤细胞与滋养层细胞一起在步骤(1)的组合物中进行培养，尤其地，滋养层细胞是小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞。在实施方案中，该MEF细胞用丝裂霉素C处理过。

在实施方案中，本发明的方法中的动物是小鼠或大鼠，尤其是免疫缺陷小鼠，例如裸鼠。在实施方案中，步骤(1)中获得的原代肿瘤细胞在中空纤维中被植入动物中。在实施方案中，中空纤维由改良聚偏氟乙烯制成，更具体而言，中空纤维由改良聚偏氟乙烯制成，且可截留分子量为500000道尔顿。

本发明的另一个方面提供了一种通过本发明的方法获得的用于筛选抗肿瘤药物的动物模型。在实施方案中，本发明中的动物是小鼠或大鼠，尤其是免疫缺陷小鼠，例如裸鼠。

本发明的另一个方面提供了一种使用本发明的动物模型来筛选抗肿瘤药物的方法，该方法包括向本发明的动物模型施用候选药物。在实施方案中，上述方法还包括在本发明的动物模型中测量肿瘤细胞生长。

肿瘤细胞可从多种肿瘤类型获得，包括但不限于消化道(例如胃、肠、十二指肠、结肠、胰腺等)肿瘤、乳腺肿瘤、肺部肿瘤、肝脏肿瘤和内分泌腺(例如肾上腺、甲状旁腺、脑垂体、睾丸、卵巢，以及胸腺、甲状腺)肿瘤、泌尿和生殖系统(例如肾脏、膀胱、卵巢、睾丸、前列腺等)肿瘤、骨骼肌肉系统(例如骨、平滑肌、横纹肌等)肿瘤、皮肤肿瘤等。例如，肿瘤细胞可以源自胃癌、十二结直肠癌和肺癌的活检标本。

条件性重编程的原代肿瘤细胞可以通过注射器或本领域已知的其他方法或装置被植入动物中。在实施方案中，借助于产生用于体内肿瘤生长的PDX模型的方法，将条件性重编程的原代肿瘤细胞植入动物中。参见例如，Berglind O.Einarsdottir等人,“Melanomapatient-derived xenografts accurately model the disease and develop fastenough to guide treatment decisions”,Oncotarget,Vol.5,No.20,公开于2014年9月8日；Maria C.Villarroel,“Personalizing Cancer Treatment in the Age of GlobalGenomic Analyses:PALB2 Gene Mutations and the Response to DNA Damaging Agentsin Pancreatic Cancer”,Molecular Cancer Therapies,公开于2010年12月6日,DOI:10.1158/1535-7163.MCT-10-0893。在实施方案中，条件性重编程的原代肿瘤细胞被转移至中空纤维管中，然后该中空纤维管被植入动物中。中空纤维可以由改良聚偏氟乙烯制成，且可截留分子量为500000道尔顿。在本发明中，mini-PDX装置是指中空纤维，其可以由改良聚偏氟乙烯制成，且可截留分子量为500000道尔顿，可以容纳从患者获得的原代肿瘤细胞，并且被植入候选动物中，例如经皮下被植入候选动物中。在本发明中，mini-PDX模型是指已植入了本发明的mini-PDX装置的动物。该mini-PDX动物模型可用于本发明所述的方法/试验中。

本发明的另一个方面提供了一种使用本发明的动物模型来筛选抗肿瘤药物的方法，该方法包括向本发明的动物模型施用候选药物。在一些实施方案中，该方法还包括在所述施用之前和之后测量由本发明的动物模型携带的肿瘤细胞的生长。在一些实施方案中，在向本发明的动物模型施用药物之前以及施用药物之后5-14天，特别是5-7天，测量肿瘤的大小。在一些实施方案中，在向本发明的动物模型施用药物之前和施用药物之后5-14天，特别是5-7天，测量肿瘤细胞凋亡。在一些实施方案中，在向本发明的动物模型施用药物之前和施用药物之后5-14天，特别是5-7天，测量肿瘤细胞分化。本领域技术人员将选择合适的方法以在所述施用之前和之后测量由本发明的动物模型携带的肿瘤细胞的生长。

药物可以通过任何合适的途径(口服或肠胃外)施用。例如，通过口服施用或肌肉注射(例如通过肌内、皮下或静脉内输注)、局部施用、吸入和透皮递送(例如皮肤贴剂、植入物、栓剂等)将候选药物施用至本发明的动物模型。本领域技术人员将根据其需要选择合适的给药途径。

本发明中待筛选的候选药物可以是已知的抗肿瘤药物或其组合、新抗肿瘤药物或组合或者已知抗肿瘤药物的新组合。在本发明的方法中，待筛选的药物可以以固体、半固体或液体的形式使用。

可以通过口服施用或肌肉注射(例如通过肌内、皮下或静脉内输注)、局部施用、吸入和透皮递送(例如皮肤贴剂、植入物、栓剂等)将药物施用至候选动物。本领域技术人员将根据其需要选择合适的给药途径。

实施例

下面将参考附图对本发明进行更好的描述。

条件性重编程培养基

培养基含有以下成分：

·375mL F12培养基(市售)、125mL高糖DMEM(市售)、25mL 10％FBS(市售)、5mL氢化可的松、5mL胰岛素、5mL霍乱毒素、5mL腺嘌呤、5mL青霉素/链霉素(市售)、5mL EGF、1mLY-27632。

·可选成分：非必需氨基酸溶液(市售)；和GlutaMAX补充剂(市售)。

制备：

制备以下成分：

·氢化可的松：将25mg市售氢化可的松溶解在5mL 100％冷乙醇中，以制备5mg/mL溶液。向含有5％胎牛血清(FBS)的100mL HBES中加入0.8mL的所述5mg/mL溶液。过滤除菌，并在–20℃以10mL小份存储。氢化可的松的最终浓度为0.4mg/L。

·霍乱毒素：向含有1mg霍乱毒素(市售)的小瓶中加入1.2mL无菌水，得到10μM溶液。将50μL的所述10μM溶液稀释在含有0.1％牛血清血白蛋白的50mL HBES中。过滤除菌，并在4℃以10mL小份存储。霍乱毒素的最终浓度为8.3μg/L。

·胰岛素：将12.5mg市售胰岛素溶解在25mL的0.005M HCL中。使用预先用FBS润湿的注射器式过滤器进行过滤除菌。胰岛素的最终浓度为5mg/L。

·腺嘌呤：通过搅拌1h将121mg市售腺嘌呤溶解在50mL的0.05MHCl中。过滤除菌，并在–20℃以10mL小份存储。腺嘌呤的最终浓度为24.2mg/L。

·表皮生长因子(EGF)：将100μg市售EGF溶解在10mL无菌水中。加入含0.1％牛血清血白蛋白的90mL HBES。过滤除菌，并在–20℃以10mL小份存储。EGF的最终浓度为10μg/L。

·Y-27632；DMSO中10μmol，市售。

然后，将培养基适当地保存在阴凉处备用。

滋养层细胞制备：

MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)从C57小鼠的e13.5胚胎分离，并在补充有10％FBS的DMEM中生长。3-5代中分离的MEF细胞用丝裂霉素C(10μg/ml)处理2h，并用PBS洗涤。收集经过处理的MEF，并冷冻保存，即为滋养层细胞。

实施例1

1.材料

1.1用于条件性重编程的肿瘤

分别收集来自MDX079、MDX083、MDX095、MDX107、MDX123的条件性重编程细胞。MDX079源自女性肺癌患者，MDX083模型源自27岁的男性腺样囊性癌患者，MDX095模型源自54岁的男性腹膜恶性间皮瘤患者，MDX107模型源自54岁的男性恶性胶质瘤患者，MDX123模型源自53岁的男性结直肠癌患者。

1.2动物

1.2.1Balb/c裸鼠，雌性，购自上海实验室动物中心(Shanghai LaboratoryAnimal Center)(中国，上海灵畅生物科技有限公司，SCXK(SH)2013-0018)。

年龄：6-8周

性别：雌性

体重：18-22g

1.2.2居住条件

将小鼠饲养在恒温和恒湿的SPF室中，每个笼子中饲养3只动物。

-温度：20-26℃

-湿度：40-70％

-光照周期：12小时光照和12小时黑暗

笼子：由聚碳酸酯制成。尺寸为325mm x 210mm x 180mm。铺垫材料为玉米芯，每周更换两次。

饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒饲料。

水：动物可自由饮用无菌饮用水。

笼子识别：每个笼子的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、品系、接收日期、疗法、研究编号、组编号和治疗开始日期。动物识别：通过耳部编码标记动物。

1.3设备

倒置显微镜DMIL，LEICA(徕卡公司)；天平ALC-310.3，Acclulab(德国艾科勒公司)；微量天平BSA224S，Sartorius(赛多利斯公司)；离心机5810R，Eppendorf(德国艾本德)。

Mini-PDX装置：中空纤维由改良聚偏氟乙烯制成，可截留分子量为500000道尔顿，内径为1-2mm。切割成所需长度。

2.流程和方法

2.1细胞培养物

2.1.1用缓冲溶液洗涤肿瘤组织样本，并在生物安全操作柜中取出非肿瘤组织和坏死性肿瘤组织。将肿瘤切成1-3mm

2.1.2将通过活检/穿刺活检获得的肿瘤组织悬浮在1X胶原酶溶液中，并在37℃温育1-2小时。通过70uM过滤器收集单个细胞，计数细胞数以计算出肿瘤细胞浓度(参见9.从手术和活检/穿刺活检获得的肿瘤细胞浓度)。用条件性重编程培养基培养细胞，然后在肿瘤细胞增殖后，收集条件性重编程细胞。2.2 Mini-PDX装置接种

将细胞悬浮液注入到Mini-PDX装置中，并将该装置皮下接种到Nu/Nu裸鼠的两侧腹，以建立Mini-PDX模型。接种日定义为第0天。根据体重将小鼠随机分组，并在第0天开始进行治疗。下列实验设计表中示出了每个研究组中的测试物给药和mini-PDX装置数量。

表1 MDX079组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

i.p.：腹腔注射；

qd：每天一次；

q4d：每4天一次；

qw：每周一次。

表2 MDX083组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

i.p.：腹腔注射；

qd：每天一次；

q4d：每4天一次；

qw：每周一次。

表3 MDX095组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

i.p.：腹腔注射；

qd：每天一次；

q4d：每4天一次；

qw：每周一次。

表4 MDX107组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

p.o.：口服；

qd：每天一次。

表5 MDX123组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

i.p.：腹腔注射；

qd：每天一次；

q4d：每4天一次。

2.3观察

进行此项研究之前，先由上海立迪生物技术股份有限公司(Shanghai LIDE)的实验动物管理和使用委员会(IACUC)审查并批准涉及本研究中动物的保护和使用的规程及任何修正案或流程。在研究过程中，动物的照料和使用按照国际实验动物饲养管理评估与认证协会(AAALAC)的规定进行。接种后，每天检查动物的发病和死亡。在常规监测时，检测动物肿瘤生长和治疗对正常行为的任何影响，所述正常行为例如活动能力、食物和水的消耗、体重增加/减少(每周两次或隔天一次测量体重)、眼睛/毛发无光泽和任何其他异常影响。根据每个分组中的动物数量，记录死亡和所观察到的临床症状。

2.4终止

2.4.1每天测量体重，这些研究的治疗时间为7天，终止时，对所有小鼠实施安乐死并取出Mini-PDX装置进行CTG(细胞活力)测定。肿瘤相对增殖率(％)是抗肿瘤活性的指标。

2.4.2当V

3.结果(见图2)

4.总结与讨论

在MDX079 Mini-PDX模型中，多西他赛和卡铂联合疗法(T/C％＝-21％)可导致肿瘤细胞活力显著降低；吉西他滨和卡铂联合疗法(T/C％＝55％)也显示出抗肿瘤活性；培美曲塞和卡铂联合疗法(T/C％＝103％)、培美曲塞、卡铂和贝伐珠单抗联合疗法(T/C％＝119％)、依托泊苷和卡铂联合疗法(T/C％＝114％)无抗肿瘤活性。

在MDX083 Mini-PDX模型中，所有治疗组，包括紫杉醇和顺铂联合疗法(T/C％＝44％)、吉西他滨和顺铂联合疗法(T/C％＝41％)、多西他赛和卡铂联合疗法(T/C％＝50％)、5-Fu和顺铂联合疗法(T/C％＝45％)、表阿霉素、5-Fu和顺铂联合疗法(T/C％＝45％)可导致肿瘤细胞活力降低。

在MDX095 Mini-PDX模型中，5-Fu疗法(T/C％＝80％)、紫杉醇疗法(T/C％＝79％)导致肿瘤细胞活力略有下降；吉西他滨和顺铂联合疗法(T/C％＝119％)无抗肿瘤活性，顺铂疗法(T/C％＝128％)、表阿霉素疗法(T/C％＝120％)、依托泊苷疗法(T/C％＝109％)无抗肿瘤活性。

在MDX107 Mini-PDX模型中，替莫唑胺疗法无抗肿瘤活性。

在MDX123 Mini-PDX模型中，5-Fu疗法(T/C％＝75％)、奥沙利铂疗法(T/C％＝61％)、伊立替康疗法(T/C％＝68％)、贝伐珠单抗疗法(T/C％＝76％)可导致肿瘤细胞活力降低；雷替曲塞疗法(T/C％＝92％)、贝伐珠单抗疗法(T/C％＝101％)无抗肿瘤活性。

实施例2

5.材料

5.1用于条件性重编程的肿瘤

分别收集来自MDX133、MDX154、MDX164、MDX165、MDX168、MDX169、MDX174、MDX186、MDX189、MDX203的条件性重编程细胞。MDX133源自45岁的男性胃癌患者，MDX154模型源自女性胆囊癌患者，MDX164模型源自43岁的男性恶性胶质瘤患者，MDX165模型源自64岁的男性恶性胶质瘤患者，MDX168模型源自66岁的女性胆囊癌患者，MDX169模型源自52岁的男性肺癌患者，MDX174模型源自59岁的男性肺癌患者，MDX186模型源自54岁的女性胰腺癌患者，MDX189模型源自44岁的男性食道癌患者，MDX203模型源自61岁的男性胆囊癌患者。

5.2动物

5.2.1Balb/c裸鼠，雌性，购自上海实验室动物中心(Shanghai LaboratoryAnimal Center)(中国，上海灵畅生物科技有限公司，SCXK(SH)2013-0018)。

年龄：6-8周

性别：雌性

体重：18-22g

5.2.2居住条件

将小鼠饲养在恒温和恒湿的SPF室中，每个笼子中饲养3只动物。

-温度：20-26℃

-湿度：40-70％

-光照周期：12小时光照和12小时黑暗

笼子：由聚碳酸酯制成。尺寸为325mm x 210mm x 180mm。铺垫材料为玉米芯，每周更换两次。

饮食：在整个研究期间，动物可自由食用经辐射灭菌的干燥颗粒饲料。

水：动物可以自由饮用无菌饮用水。

笼子识别：每个笼子的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、品系、接收日期、疗法、研究编号、组编号和治疗开始日期。动物识别：通过耳部编码标记动物。

5.3设备

倒置显微镜DMIL，LEICA(徕卡公司)；天平ALC-310.3，Acclulab(德国艾科勒公司)；微量天平BSA224S，Sartorius(赛多利斯公司)；离心机5810R，Eppendorf(德国艾本德)。

Mini-PDX装置：中空纤维由改良聚偏氟乙烯制成，可截留分子量为500000道尔顿，内径为1-2mm。切割成所需长度。

6.流程和方法

6.1细胞培养

6.1.1用缓冲溶液洗涤肿瘤组织样本，并在生物安全操作柜中取出非肿瘤组织和坏死性肿瘤组织。将肿瘤切成1-3mm3的碎片，用1X胶原酶溶液悬浮沉淀，并在37℃温育1-2小时。通过70uM过滤器收集单个细胞，计数细胞数以计算出肿瘤细胞浓度(参见9.从手术和活检/穿刺活检获得的肿瘤细胞浓度)。用条件性重编程培养基培养细胞，然后在肿瘤细胞增殖后，收集条件性重编程细胞。

6.1.2将通过活检/穿刺活检获得的肿瘤组织悬浮在1X胶原酶溶液中，并在37℃温育1-2小时。通过70uM过滤器收集单个细胞，计数细胞数以计算出肿瘤细胞浓度(参见9.从手术和活检/穿刺活检获得的肿瘤细胞浓度)。用条件性重编程培养基培养细胞，然后在肿瘤细胞增殖后，收集条件性重编程细胞。

6.2 Mini-PDX装置接种

将细胞悬浮液注入到Mini-PDX装置中，并将该装置皮下接种到Nu/Nu裸鼠的两侧腹，以建立Mini-PDX模型。接种日定义为第0天。根据体重将小鼠随机分组，并在第0天开始治疗。下列实验设计表中示出了每个研究组中的测试物给药和mini-PDX装置数量。

表6 MDX133组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

i.p.：腹腔注射；

p.o.：口服；

qd：每天一次；

q4d：每4天一次。

表7 MDX154组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

i.p.：腹腔注射；

i.v.：静脉内注射；

qd：每天一次；

q4d：每4天一次。

表8 MDX164组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

p.o.：口服；

qd：每天一次。

表9 MDX165组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

p.o.：口服；

qd：每天一次。

表10 MDX168组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

i.p.：腹腔注射；

i.v.：静脉内注射；

qd：每天一次；

q4d：每4天一次。

表11 MDX169组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

i.p.：腹腔注射；

p.o.：口服；

qd：每天一次；

q4d：每4天一次；

qw：每周一次。

表12 MDX174组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

i.p.：腹腔注射；

p.o.：口服；

qd：每天一次；

q4d：每4天一次；

qw：每周一次。

表13 MDX186组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

i.p.：腹腔注射；

i.v.：静脉内注射；

qd：每天一次；

q4d：每4天一次；

qw：每周一次。

表14 MDX189组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

i.p.：腹腔注射；

p.o.：口服；

qd：每天一次；

q4d：每4天一次；

qw：每周一次。

表15 MDX203组及治疗

注：N：mini-PDX装置数量；

i.p.：腹腔注射；

i.v.：静脉内注射；

qd：每天一次；

q4d：每4天一次；

qw：每周一次。

6.3观察

进行此项研究之前，先由上海立迪生物技术股份有限公司(Shanghai LIDE)的实验动物管理和使用委员会(IACUC)审查并批准涉及本研究中动物的保护和使用的规程及任何修正案或流程。在研究过程中，动物的照料和使用按照国际实验动物饲养管理评估与认证协会(AAALAC)的规定进行。接种后，每天检查动物的发病和死亡。在常规监测时，检测动物肿瘤生长和治疗对正常行为的任何影响，所述正常行为例如活动能力、食物和水的消耗、体重增加/减少(每周两次或隔天一次测量体重)、眼睛/毛发无光泽和任何其他异常影响。根据每个分组中的动物数量，记录死亡和所观察到的临床症状。

6.4终止

6.4.1每天测量体重，这些研究的治疗时间为7天，终止时，对所有小鼠实施安乐死并取出Mini-PDX装置进行CTG(细胞活力)测定。肿瘤相对增殖率(％)是抗肿瘤活性的指标。

6.4.2当V

7.结果(见图3)

8.总结与讨论

在MDX133 Mini-PDX模型中，紫杉醇疗法(T/C％＝52％)可导致肿瘤细胞活力降低，伊立替康疗法(T/C％＝72％)、S-1疗法(T/C％＝86％)、奥沙利铂疗法(T/C％＝89％)也显示出较小的抗肿瘤活性；5-Fu疗法(T/C％＝103％)无抗肿瘤活性。

在MDX154 Mini-PDX模型中，所有的治疗组，包括吉西他滨疗法(T/C％＝100％)、奥沙利铂疗法(T/C％＝174％)、5-Fu疗法(T/C％＝111％)、白蛋白结合型紫杉醇疗法(T/C％＝162％)、伊立替康疗法(T/C％＝227％)无抗肿瘤活性。

在MDX164 Mini-PDX模型中，替莫唑胺疗法(T/C％＝102％)无抗肿瘤活性。

在MDX165 Mini-PDX模型中，替莫唑胺疗法(T/C％＝29％)可以导致肿瘤细胞活力降低。

在MDX168 Mini-PDX模型中，白蛋白结合型紫杉醇疗法(T/C％＝15％)、伊立替康疗法(T/C％＝12％)可以导致肿瘤细胞活力降低；吉西他滨疗法(T/C％＝53％)、奥沙利铂疗法(T/C％＝75％)也显示出较小的抗肿瘤活性；5-Fu疗法(T/C％＝146％)无抗肿瘤活性。

在MDX169 Mini-PDX模型中，多西他赛和卡铂联合疗法(T/C％＝20％)、紫杉醇和卡铂联合疗法(T/C％＝40％)可以导致肿瘤细胞活力下降；培美曲塞和卡铂联合疗法(T/C％＝55％)、吉西他滨和卡铂联合疗法(T/C％＝82％)、长春瑞滨和卡铂联合疗法(T/C％＝91％)也显示出较小的抗肿瘤活性。

在MDX174 Mini-PDX模型中，吉西他滨和卡铂联合疗法(T/C％＝86％)显示出较小的抗肿瘤活性；培美曲塞和卡铂联合疗法(T/C％＝104％)、紫杉醇和卡铂联合疗法(T/C％＝120％)、多西他赛和卡铂联合疗法(T/C％＝110％)、长春瑞滨和卡铂联合疗法(T/C％＝134％)无抗肿瘤活性。

在MDX186 Mini-PDX模型中，白蛋白结合型紫杉醇疗法(T/C％＝0％)、伊立替康疗法(T/C％＝5％)可以导致肿瘤细胞活力显著降低；奥沙利铂疗法(T/C％＝47％)显示出抗肿瘤活性；吉西他滨疗法(T/C％＝83％)、5-Fu疗法(T/C％＝90％)也显示出较小的抗肿瘤活性。

在MDX189 Mini-PDX模型中，S-1和奥沙利铂联合疗法(T/C％＝-2％)、多西他赛、顺铂和5-Fu联合疗法(T/C％＝14％)、5-Fu和顺铂联合疗法(T/C％＝19％)可以导致肿瘤细胞活力显著降低。

在MDX203 Mini-PDX模型中，奥沙利铂疗法(T/C％＝43％)、伊立替康疗法(T/C％＝48％)、白蛋白结合型紫杉醇疗法(T/C％＝52％)可以导致肿瘤细胞活力降低；吉西他滨疗法(T/C％＝77％)、5-Fu疗法(T/C％＝83％)也显示出较小的抗肿瘤活性。

9.从手术和活检/穿刺活检肿瘤样本获得的样本的肿瘤细胞计数

使用本领域已知的方法对肿瘤细胞的数目进行计数，然后转化为悬浮液中的肿瘤细胞浓度。M：mol/L。