选择性TREG刺激剂RUR20kD-IL-2和相关组合物

本申请涉及相对于效应T细胞选择性增加调节性T细胞的数目和活化的长效白介素-2受体(IL-2 R)激动剂Treg刺激剂组合物，并且涉及使用这些Treg刺激剂组合物以治疗自身免疫性疾病和炎性疾病和/或对Treg刺激疗法应答的其他病况的方法。具体而言，本申请涉及选择性Treg刺激剂组合物RUR

免疫系统是机体针对感染性生物的入侵的主要防线。在正常发挥功能的免疫系统中，不针对自身抗原发生免疫应答；这被称为自我耐受性。当机体的自身免疫系统由于对自身抗原的耐受性丧失而攻击机体组织时，发生自身免疫性疾病(Dejaco, C., 等人

尽管各种常规治疗，诸如皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤和甲氨蝶呤在具有自身免疫性疾病的一些患者中略微有效，但它们并不一致地有效，并且与副作用和毒性相关(Jantunen, E., 等人

鉴于对自身免疫性疾病的病理生理学的理解的进来进展，潜在的聚焦于细胞或分子靶标的新疗法已经开发并且目前正在评估。尽管自身免疫性疾病的病因是未知的，但相信其由遗传因素、不当的免疫调节以及激素和环境因素之间的潜在相互作用引起。已经提出诱导自身免疫性疾病的各种机制，包括螯合的抗原，分子模拟，MHC II类分子的不规则表达，细胞因子失衡，独特型网络调节途径的功能障碍，一般调节性T细胞缺陷和多克隆B细胞活化(Kuby, 1994, 同上)。已经研究了几种用于治疗自身免疫疾病的方法，包括B细胞耗竭，抗细胞因子疗法和干细胞疗法，然而这些方法就效力、安全性和/或不期望的副作用而言具有不足。用于治疗自身免疫性疾病的常规疗法通过抑制总体免疫系统而发挥功能，由此导致明显的感染和其他严重副作用的风险。因此，仍然需要额外的治疗以提供用于治疗自身免疫性疾病的效力、安全性和/或耐受性的改进的组合。

持续多年，IL-2在自身免疫性应答中的作用被确立为促炎性细胞因子。然而，更近来的研究已经表明，IL-2在某些条件下可以在慢性自身免疫性炎症中发挥保护作用。具体而言，调节性T细胞(Treg)和效应T细胞(Teff)之间的破坏的平衡已被鉴定为各种自身免疫性疾病的共同特征，其中这种破坏的平衡被认为被内稳态细胞因子、诸如IL-2影响。由于其药代动力学概况，施用未修饰的IL-2用于自身免疫性疗法需要频繁的每天或每隔一天给药，这经常伴随着疼痛的注射部位反应。此外，由于不适和不便，频繁的注射的必要性经常伴随着不良的患者依从性。IL-2的长期重复施用还伴随着IL-2的不想要的多效性和全身性活性的风险升高以及相关风险和不良作用。此外，由于治疗窗口受限，使用未修饰的IL-2来实现免疫内稳态和维持期望的Treg/Teff平衡可以证明在延长的时间段内有挑战性，如果不是无法实现的话。此外，其自身免疫性疾病疗法的狭窄治疗边界需要施用极低剂量的IL-2，由此不利地影响其效力。尽管低剂量IL-2可用于刺激Treg以得到一些临床益处，但不良事件是剂量限制性的，并且Treg增加是适度且短期的。例如，施用未修饰的IL-2用于自身免疫性疾病疗法诱导IL-5的不期望的增加和随后嗜酸性粒细胞水平的升高，其可以导致炎症。因此，仍然需要可以以促进各种自身免疫性疾病中的调节性T细胞和效应T细胞活性的疾病减轻平衡的方式选择性调节IL-2信号传导的药剂。

特定的自身免疫性疾病具有潜在的病因，包括IL-2产生受损和/或调节性T细胞缺陷，其已被牵涉为疾病发作之前的免疫学机制。仍然需要替代的和更有效的治疗组合物和治疗方案，以有效地减轻自身免疫性症状、提高生活质量，和优选在各种自身免疫性疾病中提供延长的缓解。本公开解决了用于治疗慢性自身免疫性疾病的当前选项的有限的可获得性和相关的缺点。

概述

本公开基于选择性Treg刺激剂RUR

附图的简要说明

图1A和1B是代表性反相HPLC图，其举例说明RUR

图2是阿地白介素(125-L-丝氨酸-2-133白介素2，在大肠杆菌中表达的重组的非糖基化白介素-2)的氨基酸序列。

图3A和3B是表明如实施例2中所述在小鼠中施用单剂量的RUR

图4A、4B和4C是显示如实施例2中所述在小鼠中施用单剂量的RUR

图5A和5B是如实施例2中所述在小鼠中施用单剂量的RUR

图6A-D是如实施例3中所述的体外Treg抑制测定中在1和4天从媒介物处理的小鼠分离的脾Treg的图。

图7是表明如实施例3中所述随时间评价的以1:2的比率与Tcon(常规T细胞)培养的分离的Treg的相对抑制能力的图。

图8A和8B表明用RUR

图9A-C是如实施例5中所述在食蟹猴中施用单剂量的RUR

图10A和B是表明如实施例7中所述在小鼠中施用RUR

图11是如实施例8中详细描述当在系统性红斑狼疮(SLE)的小鼠模型中评估时，施用RUR

图12是表明在单次施用各种剂量的量的RUR

图13是表明如实施例10中所述在向人受试者单剂量施用各种剂量的量的RUR

图14A-D是如实施例10中所述向人受试者单次施用各种剂量的量的RUR

图15A、15B是使用流式细胞术计数的CD25亮+/FoxP3+ Treg的图。在治疗前和用单次施用各种剂量的量的RUR

图16A、16B是分别使用流式细胞术计数的CD4+和CD8+ T细胞的图。在治疗前和用单次施用各种剂量的量的RUR

图17A、17B是使用流式细胞术计数的Treg与Tcon剂量-应答比率(图17A)以及CD25亮+/FoxP3+ Treg和CD8+ T细胞(图17B)的图。在治疗前和用单次施用各种剂量的量的RUR

详述

本公开提供了选择性Treg刺激剂组合物，包括RUR

在一个方面，本公开提供了包含具有以下结构的PEG化的IL-2缀合物的组合物：

其中：

IL-2是白介素-2；

n在每次出现时独立地是约3至约4000的整数。

在所述组合物的一个具体实施方案中，IL-2是阿地白介素。在所述组合物的一个具体实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。在所述组合物的一个进一步具体实施方案中，所述组合物的PEG化的IL-2缀合物具有在赖氨酸31处附接的PEG部分。

在一个方面，本文提供了包含下式的缀合物的组合物：

其中IL-2是白介素-2，n是约3至约4000的整数，且n’是2和3。

式(I)的聚合物部分也被称为1,3-双(甲氧基聚(乙二醇) MW 10,000氨基甲酰基)-2-丙氧基)-4-丁酰基(最多达且包括与IL-2部分的氨基氮共价附接的羰基基团)。根据式(I)的混合物组合物在本文中通常被称为RUR-IL2，其涵盖一定范围的PEG大小。除了约3至约4000以外，n的说明性范围包括，例如，约5-2000，或约10-1000，或约10-750，或约10-500，或约10-400，或约10-300，或约10-250，或约20-250。在一些实施方案中，n平均为约226。

在另一个方面，本文提供了下式的组合物：

其中IL-2是白介素-2，n是约3至约4000的整数，且n’是1和2和3。

在一些实施方案中，式I的选择性Treg刺激剂组合物包含与支链的聚乙二醇部分稳定地共价连接的IL-2R，其中每个IL-2部分的支链的PEG部分的数目(PEG化程度)是混合物中的主要2和3-聚体(二-和三-PEG化的)的分布，其中次要级分包括1-聚体(单-PEG化的)和4-聚体(四-PEG化的)。因此，在一些实施方案中，根据式I的组合物中的次要级分将包括其中n’是1、4、5或更高、但不大于11的缀合物。

例如，在一个实施方案中，所述选择性Treg刺激剂组合物由以下结构涵盖：

其中IL-2是IL-2的氨基酸残基之一，且结构(Ib)中显示的“NH”是所述IL-2残基的氨基基团；其中“n”是约3至约4000的整数；且n’是2和3。

在一些实施方案中，本文提供了被称为RUR

在一个实施方案中，本文提供了配方A的RUR

在一个实施方案中，本文提供了配方B的RUR

在一个实施方案中，本文提供了配方C的RUR

在一个实施方案中，本文提供了配方D的RUR

在一个实施方案中，本文提供了配方E的RUR

如本文所用，“RUR

本文提供的选择性Treg刺激剂组合物的进一步实施方案：

本文提供的组合物可以包含其中n等于2的缀合物，例如，这样的二-PEG化的缀合物，其中两个支链聚乙二醇聚合物(其各自具有上文显示的1,3-双(甲氧基聚(乙二醇)

所述组合物还可以包含其中n等于3的单一缀合物，例如，这样的三-PEG化的缀合物，其中三个支链聚乙二醇部分对于所述组合物中的实质上所有IL-2缀合物在相同的相对位置处附接。或者，三-PEG化的缀合物可以包含三-PEG化的缀合物的混合物，例如这样的三-PEG化的缀合物的混合物，其中支链聚乙二醇部分的附接位点对于所述组合物中包含的缀合物存在于IL-2上的不同位点处。因此，此类三-PEG化的组合物在PEG化的程度、特别是附接的支链PEG部分的数目方面是均质的，但在PEG附接在IL-2上的位置方面是异质的，并且在这种情况下代表PEG附接的位置异构体。

所述组合物还可以包含其中n等于1的单一缀合物，例如，这样的单-PEG化的缀合物，其中一个支链聚乙二醇部分对于所述组合物中的实质上所有IL-2缀合物在相同的相对位置处附接。或者，单-PEG化的缀合物可以包含单-PEG化的缀合物的混合物，例如这样的单-PEG化的缀合物的混合物，其中支链聚乙二醇部分的附接位点对于所述组合物中包含的缀合物存在于IL-2上的不同位点处。因此，此类单-PEG化的组合物在PEG化的程度、特别是附接的支链PEG部分的数目方面是均质的，但在PEG附接在IL-2上的位置方面是异质的，并且在这种情况下代表PEG附接的位置异构体。

IL-2分子上的PEG附接的某些位置在本文所述的组合物中更普遍。例如，赖氨酸K7或K8或K31或K75通常是PEG化的位点。RUR

在一些实施方案中，所述组合物含有不超过约20 mol %，和优选不超过约15 mol%的当共同考虑时由式(I)涵盖的缀合物，其中n’是选自1、4、5的整数，或大于5的整数，其中摩尔百分比基于总PEG-IL-2缀合物。在一些实施方案中，所述组合物含有不超过约10 mol%的当共同考虑时由式(I)涵盖的缀合物，其中n’是选自1、4、5的整数，或大于5的整数，其中摩尔百分比基于总PEG-IL-2缀合物。在一些额外实施方案中，所述组合物含有不超过约10mol %的单体，且优选不超过约7 mol %的单体，或不超过约5 mol%的单体(即，根据结构(I)，其中n等于1)。在一些进一步实施方案中，所述组合物含有不超过约10 mol %的四聚体，且优选不超过约7 mol %的四聚体，或不超过约5 mol%的四聚体(即，根据结构(I)，其中n等于4)。在某些额外实施方案中，所述组合物包含不超过约10 mol %的单体和不超过约10mol %的四聚体。或者，所述组合物包含不超过约7 mol %的单体和不超过约7 mol %的四聚体，或者可以包含不超过约5 mol %的单体和不超过约5 mol %的四聚体。

在一些实施方案中，关于所述组合物中的PEG化的IL-2，所述组合物通常将满足以下特征中的一种或多种：所述组合物中的至少约80%的缀合物将包含二-PEG化和三-PEG化缀合物的混合物，一些具有2个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物，且一些具有3个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物；所述组合物中的至少约85%的缀合物将包含二-PEG化和三-PEG化缀合物的混合物，一些具有2个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物，且一些具有3个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物；所述组合物中的至少约90%的缀合物将包含二-PEG化和三-PEG化缀合物的混合物，一些具有2个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物，且一些具有3个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物；且所述组合物中的至少约95%的缀合物将包含二-PEG化和三-PEG化缀合物的混合物，一些具有2个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物，且一些具有3个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物；所述组合物中的不超过约20%的缀合物将具有1或4或更多个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物；所述组合物中的不超过约15%的缀合物将具有1或4或更多个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物；所述组合物中的不超过约10%的缀合物将具有1、4或更多个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物；所述组合物中的不超过约7%的缀合物将具有1或4或更多个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物。

在一些实施方案中，所述组合物含有不超过约20 mol %，和优选不超过约15 mol%的当共同考虑时由式(I)涵盖的化合物，其中n’是选自1、4、5的整数，或大于5的整数，其中摩尔百分比基于总PEG-IL-2缀合物。在一些实施方案中，所述组合物含有不超过约10 mol%的当共同考虑时由式(I)涵盖的缀合物，其中n’是选自1、4、5的整数，或大于5的整数，其中摩尔百分比基于总PEG-IL-2缀合物。在一些额外实施方案中，所述组合物含有不超过约10mol %的单体，且优选不超过约7 mol %的单体，或不超过约5 mol%的单体(即，根据结构(I)，其中n等于1)。在一些进一步实施方案中，所述组合物含有不超过约10 mol %的四聚体，且优选不超过约7 mol %的四聚体，或不超过约5 mol%的四聚体(即，根据结构(I)，其中n等于4)。在某些额外实施方案中，所述组合物包含不超过约10 mol %的单体和不超过约10mol %的四聚体。或者，所述组合物包含不超过约7 mol %的单体和不超过约7 mol %的四聚体，或者可以包含不超过约5 mol %的单体和不超过约5 mol %的四聚体。

在一些进一步实施方案中，所述组合物包含近似等摩尔量的

例如，说明性组合物可以包含任何一种或多种以下近似比率的二-PEG化种类与三-PEG化种类：1.4:1；1.3:1；1.2:1；1.1:1；1:1；1:1.1；1:1.2；1:1.3；或1:1.4。此类组合物的每个IL-2的PEG部分的平均数目选自例如2；2.1；2.2；2.3；2.4；2.5；2.6；2.6；2.7；2.8；2.9；和3。在某些实施方案中，每个IL-2的PEG部分的平均数目为约2.5。

例如，在一些实施方案中，所述组合物包含不超过约20摩尔%(mol %)的当共同考虑时由下式涵盖的IL-2缀合物

其中n’选自1、4、5，或大于5的整数。

还在一些额外实施方案中，所述组合物包含不超过约15摩尔%(mol %)的当共同考虑时由下式涵盖的IL-2缀合物

且其中n’选自1、4、5，或大于5的整数。

还在一些进一步实施方案中，所述组合物包含不超过约10摩尔%(mol %)的当共同考虑时由下式涵盖的IL-2缀合物

且其中n’选自1、4、5，或大于5的整数。

在前述的一些额外实施方案中，所述组合物包含不超过约10 mol %的n’等于1的IL-2缀合物。在还有一些其他实施方案中，所述组合物包含不超过约7 mol %的n’等于1的IL-2缀合物。

在还有一些进一步实施方案中，所述组合物包含不超过约5 mol %的n’等于1的IL-2缀合物。在还有一些替代实施方案中，所述组合物包含少于约5 mol %的n’等于1的IL-2缀合物。

在与前述中的任何一项或多项相关的一些进一步实施方案中，所述组合物包含不超过约10 mol %的n’等于4的IL-2缀合物。或者，在一些其他实施方案中，所述组合物包含不超过约7 mol %的n’等于4的IL-2缀合物。在还有一些进一步实施方案中，所述组合物包含不超过约5 mol %的n’等于4的IL-2缀合物。

本文还提供了组合物，其包含近似等摩尔量的

在还有额外实施方案中，本文提供了包含下式的IL-2缀合物的组合物，

其中二PEG/三PEG缀合物的摩尔比选自1.4:1；1.3:1；1.2:1；1.1:1；1:1；1:1.1；1:1.2；1:1.3；和1:1.4。

在还有一些进一步实施方案中，所述组合物的每个IL-2残基的支链聚乙二醇部分(具有如上所示的结构)的平均数目选自2；2.1；2.2；2.3；2.4；2.5；2.6；2.6；2.7；2.8；2.9；和3。在一个具体实施方案中，每个IL-2部分的支链聚乙二醇部分(具有如上所示的结构)的平均数目为约2.5。在与前述中的一项或多项相关的一些实施方案中，n的值范围为5-2000。在一些其他实施方案中，n的值范围为10-1000。在还有一些额外实施方案中，n的值范围为10-750。在一些实施方案中，n的值范围为10-500，或20-250。

在本文提供的实施方案中，n的值可以在每次出现时独立地变化。在本文所述的一个或多个实施方案中，支链聚合物的每个聚乙二醇臂中的n的值是实质上相同的。在一些进一步实施方案中，构成支链聚合物的每个聚合物臂中的n的值范围为约170至285。在还有一些进一步实施方案中，构成支链聚合物的每个聚合物臂中的n的值范围为约204至约250。在一个或多个具体实施方案中，构成支链聚合物的每个聚合物臂中的n的值为约226。

在与本文提供的方面或实施方案中的任何一个或多个相关的一个或多个实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约250道尔顿至约90,000道尔顿的范围内。在一些其他实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约1000道尔顿至约60,000道尔顿的范围内。在又进一步实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约5,000道尔顿至约60,000道尔顿的范围内。在一些其他实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约10,000道尔顿至约55,000道尔顿的范围内。

在还有一些额外实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约15,000道尔顿至约25,000道尔顿的范围内。在还有一个或多个进一步实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约18,000道尔顿至约22,000道尔顿的范围内。在还有一些进一步实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。

额外的示例性组合物包括根据上式的组合物，其中所述分子的总体聚合物部分具有约250道尔顿至约90,000道尔顿的范围内的标称平均分子量。所述分子的聚合物部分的额外合适的范围包括选自约1,000道尔顿至约60,000道尔顿的范围内、约5,000道尔顿至约60,000道尔顿的范围内、约10,000道尔顿至约55,000道尔顿的范围内、约15,000道尔顿至约50,000道尔顿的范围内和约20,000道尔顿至约50,000道尔顿的范围内的标称平均分子量。

所述聚乙二醇聚合物部分的额外的说明性重均分子量包括约200道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800道尔顿、约900道尔顿、约1,000道尔顿、约1,500道尔顿、约2,000道尔顿、约2,200道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约4,000道尔顿、约4,400道尔顿、约4,500道尔顿、约5,000道尔顿、约5,500道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约55,000道尔顿、约60,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿和约75,000道尔顿。在一些优选实施方案中，支链聚乙二醇聚合物的重均分子量是约20,000道尔顿。在其中每个支链PEG部分具有约20,000道尔顿的标称分子量的一些具体实施方案中，当针对总体组合物进行表征时，所述组合物的所得分子量范围为约55至75 kDa。

本文提供的选择性Treg刺激剂组合物的进一步实施方案包含其药学上可接受的盐。如上所述，IL-2缀合物组合物可以呈药学上可接受的盐的形式。通常，此类盐通过与药学上可接受的酸或酸等效物反应而形成。在这方面，术语“药学上可接受的盐”通常是指相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或通过使如本文所述的长效白介素-2组合物与合适的有机或无机酸反应并分离因此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、氧酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。(参见，例如，Berge等人 (1977)

与未修饰的IL-2相比，选择性Treg刺激剂组合物(包括本文所述的RUR

更具体地，已经发现具有经由其氨基基团稳定地共价连接至IL-2的特定和主要数目的支链聚乙二醇部分的选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR

向人施用单次低递增皮下剂量的选择性Treg刺激剂组合物RUR

本文提供的选择性Treg刺激剂组合物(包括RUR

在一些实施方案中，所治疗的病况是系统性红斑狼疮(SLE)。系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性炎性疾病，其主要影响中年妇女。SLE的特征包括，例如皮肤出疹、关节疼痛、复发性胸膜炎和肾脏疾病。Treg相对于Tcon的进行性体内平衡失衡被许多自身免疫性疾病(包括SLE)所共有。总体而言，将Treg体内稳态与SLE的病理关联的治疗假说，SLE患者中的低剂量IL-2的活性以及本文所述的RUR

在还有一些进一步实施方案中，当以治疗有效剂量施用于受试者时，所述RUR-IL-2或RUR

在另一个方面，本文提供了通过向受试者施用治疗有效剂量的如本文所述的RUR-IL-2或RUR

在与前述方法相关的一些实施方案中，所述调节性T细胞选自Foxp3+和CD25+细胞。在与先前的实施方案或方法相关的一个或多个实施方案中，所述效应T细胞选自CD4+和CD8+细胞。

在与上述方法或相关实施方案相关的一些进一步实施方案中，当在体内小鼠模型中评估时，当与基线相比时，调节性T细胞中的倍数增加达到至少约2、或至少约4或甚至至少约6的值。

在该方法的一些实施方案中，在施用后，调节性T细胞数目的增加维持高于基线水平，持续至少3天。在一些额外实施方案中，在施用后，调节性T细胞数目的增加维持高于基线水平，持续至少5天。优选地，调节性T细胞数目的增加维持高于基线水平，持续至少7天。

在又一个进一步方面，本文提供了治疗具有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的选择性Treg刺激剂组合物，包括如上文或本文别处所述的RUR-IL-2或RUR

在又一个进一步方面，本文提供了治疗具有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的选自以下的组合物：RUR

在又一个进一步方面，本文提供了治疗具有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的选自以下的组合物：RUR

在又一个进一步方面，本文提供了治疗具有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的RUR

在又一个进一步方面，本文提供了治疗具有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的RUR

在又一个进一步方面，本文提供了治疗具有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的RUR

在又一个进一步方面，本文提供了选自以下的组合物在疗法中的用途：RUR

在又一个进一步方面，本文提供了RUR

在又一个进一步方面，本文提供了RUR

在又一个进一步方面，本文提供了RUR

在又一个进一步方面，本文提供了RUR

在又一个进一步方面，本文提供了RUR

在又一个进一步方面，本文提供了选自以下的选择性Treg刺激剂组合物用于制备用于治疗自身免疫性疾病的药物的用途：RUR

在一个更具体实施方案中，系统性红斑狼疮(SLE)的治疗包括皮下施用包含治疗有效量的RUR-IL-2或RUR

在涉及如本文所述的治疗方法的实施方案中，此类实施方案也是用于该治疗中或可替代地用于制备用于该治疗中的药物的进一步实施方案。本公开进一步提供了根据如本文所述的组合物(包括其制剂)的实施方案中的任一个的组合物，其用于疗法中。本公开进一步提供了根据如本文所述的组合物(包括其制剂)的实施方案中的任一个的组合物，其用于治疗自身免疫性疾病。

在一个方面，本公开提供了包含具有以下结构的PEG化的IL-2缀合物的组合物：

其中：

IL-2是白介素-2；

n在每次出现时独立地是约3至约4000的整数；

其用于疗法中。在所述用于疗法中的组合物的一个具体实施方案中，IL-2是阿地白介素。在所述用于疗法中的组合物的一个具体实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。在所述用于疗法中的组合物的一个进一步具体实施方案中，所述组合物的PEG化的IL-2缀合物具有在赖氨酸31处附接的PEG部分。在所述用于疗法中的组合物的一个具体实施方案中，疗法用于自身免疫性疾病中。

术语

在描述和请求保护本公开的某些特征时，将根据以下描述的定义使用以下术语，除非另外指出。

如本文所用和描述的术语“选择性”是指体内免疫应答，其在一些方面体现诱导的免疫细胞或免疫信号应答的特征，但在其他方面则没有。具体而言，就Treg诱导和/或活化而言的“选择性”是指免疫应答，其呈现Treg细胞数增加(通过流式细胞术，CD25高且总体)，和/或Treg活化状态增加，如通过一种或多种活化标志物、诸如ICOS或Ki67或Stat5所示，和/或活化是指下游诱导的免疫抑制应答和/或诱导的免疫耐受应答，而缺乏某些其他免疫应答。在该上下文中，“选择性Treg诱导”是指如所述的Treg的免疫应答，而同时缺乏显著和/或临床重要的效应T细胞和相关的免疫活化应答。重要和/或临床重要的效应T细胞和相关的免疫活化应答包括，例如CD4阳性T效应细胞和/或CD8阳性T效应细胞增殖，和/或活化标志物，诸如ICOS或Ki67，或其他众所周知的效应免疫应答。其他效应免疫应答信号可能包括某些促炎性细胞因子、诸如被称为“细胞因子综合征”的那些和/或诸如IL-5、INF

如本文所用的术语“PEG化程度”是指与个别阿地白介素多肽的一个或多个氨基基团共价连接的稳定PEG取代基的数目。

如本文所用的术语“约”意指在所述数值的合理附近、诸如所述数值的正负10%内。优选地，如本文所用的“约”或“近似”意指给定量的正负5%内。

如本文所用的术语“n’是2和3”是指IL-2缀合物的混合物，其中所述混合物包含如本文所述的二-PEG化和三-PEG化的缀合物。

术语“调节性T细胞”或“ Treg”是指T细胞、诸如CD4+FoxP3+CD25

术语“T con”或“常规T细胞”是指表达αβ T细胞受体(TCR)以及共受体CD4或CD8并实施良好确立的适应性免疫效应子功能、诸如T辅助细胞功能和细胞毒性T细胞效应子功能的T淋巴细胞。例如，Tcon可以指CD4

“IL-2中间体”是指IL-2多肽，特别是阿地白介素。“RUR

如本文所用的术语“IL-2”是指具有人IL-2活性的部分。术语“IL-2部分”是指在附接至支链聚乙二醇部分之前的IL-2部分以及共价附接之后的IL-2部分。应当理解，当原始IL-2部分附接至聚乙二醇聚合物、诸如本文提供的支链聚乙二醇聚合物时，由于存在一个或多个与至聚乙二醇部分的连接相关的共价键，IL-2部分被稍微改变。与另一分子附接的IL-2部分的这种稍微改变的形式在本文中被称为IL-2部分的“残基”。在IL-2的残基的上下文中，术语‘残基’意指IL-2分子在一个或多个共价附接位点处共价附接至聚合物、诸如聚乙二醇后保留的部分，如在本文的式中所示。通常，附接的位点将是IL-2中的赖氨酸的11个胺基团之一。

应理解的是，当未修饰的IL-2附接至聚合物、诸如聚乙二醇时，由于存在一个或多个与至聚合物的连接相关的共价键，IL-2被稍微改变。与另一分子、诸如支链PEG部分附接的IL-2的这种稍微改变的形式在一些情况下可以称为IL-2的“残基”，或者可以简称为“IL-2”等，其中理解这种聚合物缀合物中包含的IL-2由于一个或多个共价键(每个共价键将支链PEG部分连接至IL-2)的存在而稍微改变。术语“更高的PEG化的IL-2缀合物”是指四PEG缀合物或五PEG缀合物或最多达11个PEG部分的缀合物。优选地，“更高的PEG化的IL-2缀合物”是指四PEG缀合物或五PEG缀合物。

例如，具有对应于国际专利公开号WO 2012/065086中描述的SEQ ID NO:1至4中任一个的氨基酸序列的蛋白是示例性IL-2蛋白，与之实质上同源的任何蛋白或多肽也是如此。术语实质上同源意指特定的主题序列，例如突变体序列，与参考序列相差一个或多个取代、缺失或添加，其净效应不导致参考序列和主题序列之间的不利功能差异。为了本文的目的，具有大于95%同源性、等效的生物学活性(尽管不一定具有等效强度的生物学活性)和等效的表达特征的序列被认为是实质上同源的。为了确定同源性的目的，应当忽略成熟序列的截短。如本文所用，术语“IL-2”包括如例如通过定点诱变或偶然地通过突变故意修饰的此类蛋白。这些术语还包括具有1至6个额外的糖基化位点的类似物，在蛋白的羧基末端具有至少一个额外氨基酸的类似物(其中所述额外氨基酸包括至少一个糖基化位点)，以及具有包括至少一个糖基化位点的氨基酸序列的类似物。该术语包括天然和重组产生的部分两者。另外，IL-2可以源自人来源、动物来源和植物来源。一种示例性IL-2是称为阿地白介素的人重组IL-2(参见图2)。对如本文所述的长效IL-2R激动剂的提及意在涵盖其药学上可接受的盐形式。

在一个方面，本文描述的RUR-IL-2或RUR

如本文所用的“PEG”或“聚乙二醇”意在涵盖任何水溶性聚(环氧乙烷)。除非另有指示，否则“PEG聚合物”或聚乙二醇是其中实质上所有(优选所有)单体亚基都是环氧乙烷亚基的聚乙二醇，但是，该聚合物可以含有不同的封端部分或官能团，例如用于缀合。用于本公开中的PEG聚合物将包含两个以下结构之一："-(CH

关于聚合物的几何形状或总体结构的“支链的”是指具有两个或更多个从支链点或中心结构特征延伸的聚合物“臂”或“链”的聚合物。作为一个实例，说明性PEG试剂，mPEG2-丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(1,3-双(甲氧基聚(乙二醇)氨基甲酰基)-2-丙氧基)-4-琥珀酰亚胺基丁酸酯)是由两条线性PEG链构成的支链聚乙二醇聚合物，每条线性PEG链分别经由氨基甲酸酯连接(~NHC(O)O~)共价附接至中央丙基基团的1-和3-碳，从其延伸琥珀酰亚胺氧基丁酸酯。

在水溶性聚合物、诸如PEG的背景下的分子量可以表示为数均(标称平均)分子量或重均分子量。除非另有指明，否则本文中对分子量的所有提及均是指标称平均分子量。两种分子量测定(数均和重均)均可以使用凝胶渗透色谱、凝胶过滤色谱或其他液相色谱技术来测量。也可以使用用于测量分子量值的其他方法，诸如使用端基分析或测量依数性特性(例如，凝固点降低、沸点升高或渗透压)以测定数均分子量或使用光散射技术、超速离心或粘度测定法以测定重均分子量。凝胶过滤色谱法经常用于测定支链聚合物的平均分子量。PEG聚合物通常是多分散的(即，聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，具有优选小于约1.2、更优选小于约1.15、仍更优选小于约1.10、又仍更优选小于约1.05且最优选小于约1.03的低多分散性值。

“稳定的”连接或键是指这样的化学键，其在水中是实质上稳定的，也就是说，在生理条件下在延长的时间段内不在任何可感知程度上经历水解。水解稳定的连接的实例通常包括但不限于以下：碳-碳键(例如，在脂族链中)、醚、酰胺、胺等。通常，稳定的连接是在生理条件下表现出每天小于约1-2%的水解速率的连接。代表性化学键的水解速率可以在大多数标准化学教科书中找到。

如本说明书中所用，单数形式 “一个/种(a)”、 “一个/种(an)”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。

“实质上”或“基本上”意指接近总体或全部，例如，给定量的95%或更多，除非相反地指出。

制备和实施例

应当理解，制备和实施例是通过举例说明而非限制的方式记载，并且本领域普通技术人员可以进行各种修改。本文描述和/或技术人员已知制备选择性Treg刺激剂组合物(包括RUR

IL-2中间体的制备：

IL-2部分可以源自非重组方法和/或重组方法，并且本公开不限于此方面。IL-2部分可以源自人来源、动物来源和植物来源。例如，可能从生物系统分离IL-2，并且以其他方式从培养基获得IL-2。参见，例如，美国专利号4,401,756和Pauly等人 (1984)

用于在体外以及在原核和真核宿主细胞中产生和表达重组多肽的方法是本领域普通技术人员众所周知的。参见，例如，美国专利号5,614,185。IL-2部分可以在细菌[例如，大肠杆菌，参见，例如，Fischer等人 (1995)

取决于用于表达具有IL-2活性的蛋白的系统，IL-2部分可以是未糖基化的或糖基化的，并且可以使用任一种。也就是说，IL-2部分可以是未糖基化的，或者IL-2部分可以是糖基化的，并且在一个或多个优选的实施方案中，IL-2部分是未糖基化的。IL-2部分也可以有利地被修饰以包括和/或取代一个或多个氨基酸残基，诸如例如赖氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸，以便提供聚合物与氨基酸的侧链内的原子的容易附接。IL-2部分的取代的实例描述于美国专利号5,206,344中。另外，IL-2部分可以被修饰为包括非天然存在的氨基酸残基。用于添加氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基的技术是本领域普通技术人员众所周知的。

另外，IL-2部分可以有利地被修饰为包括官能团的附接(除了通过添加含有官能团的氨基酸残基以外)。例如，IL-2部分可以被修饰为包括巯基。另外，IL-2部分可以被修饰为包括N-末端α碳。另外，IL-2部分可以被修饰为包括一个或多个碳水化合物部分。另外，IL-2部分可以被修饰为包括醛基。另外，IL-2部分可以被修饰为包括酮基。在本公开的一些实施方案中，优选IL-2部分不被修饰为包括巯基、N-末端α碳、碳水化合物、醛基和酮基中的一种或多种。

示例性的IL-2部分描述于文献，和例如，美国专利号5,116,943、5,153,310、5,635,597、7,101,965和7,567,215以及美国专利申请公开号2010/0036097和2004/0175337中。优选的IL-2部分具有图2中提供的氨基酸序列，并且代表如本文所用的阿地白介素的氨基酸序列。

在一些情况下，IL-2部分将呈“单体”形式，其中相应肽的单一表达被组织成离散单元。在其他情况下，IL-2部分将呈“二聚体”(例如，重组IL-2的二聚体)的形式，其中蛋白的两个单体形式与彼此缔合(例如，通过二硫键键合)。例如，在重组人IL-2的二聚体的背景下，所述二聚体可以呈通过二硫键与彼此缔合的两个单体的形式，所述二硫键由每个单体的Cys125残基形成。

对于任何给定的肽或蛋白部分或组合物，可能确定该部分是否具有IL-2活性。用于确定体外IL-2活性的各种方法描述于本领域和本文中。一种示例性方法是本文所述的CTTL-2细胞增殖测定。示例性方法也描述于Moreau等人 (1995)

选择性Treg刺激剂组合物(包括RUR

RUR

然后通过合适的方法、诸如离子交换色谱法纯化PEG化的rIL-2反应产物。例如，当采用离子交换色谱法时，RUR

如果期望，通过使用利用合适的柱(例如，C18柱或C3柱，商业可得自公司、诸如Amersham Biosciences或Vydac)的反相高效液相色谱(RP-HPLC)的反相色谱或通过使用离子交换柱(例如，可得自Amersham Biosciences的Sepharose™离子交换柱)的离子交换色谱，可以将产物合并物进一步分离成位置异构体。任一方法可用于分离具有相同分子量的聚合物-活性剂异构体(即，位置同种型)。

选择性Treg刺激剂组合物(包括RUR

制剂：

在又一个或多个实施方案中，本文提供了选择性Treg刺激剂组合物，包括RUR

“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”是指可以包括在本文所述的组合物中并且对受试者没有引起明显的有害毒理作用的组分。本公开的组合物优选被配制为通过使组合物生物可利用的任何途径施用(诸如肠胃外施用，包括静脉内、肌肉内或皮下)的药物组合物。此类药物组合物及其制备方法是本领域中众所周知的(参见，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, 编辑, 第21版,Lippincott, Williams & Wilkins, 2006))。任选地，本文提供的组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂，且示例性的赋形剂包括，但不限于，选自以下的那些：碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱、氨基酸及其组合。所述组合物中的任何单独的赋形剂的量将取决于赋形剂的活性和组合物的特定需要而变化。通常，任何单独的赋形剂的最佳量通过实验，即，通过制备含有不同量的赋形剂(范围从低到高)的组合物，检查稳定性和其他参数，和然后确定达到最佳性能而没有显著的不利影响的范围，进行确定。碳水化合物、诸如糖，衍生的糖、诸如醛醇、醛糖酸、酯化糖和/或糖聚合物可以作为赋形剂存在。特定的碳水化合物赋形剂包括，例如：单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和醛醇，诸如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡萄糖醇)、吡喃糖基山梨醇、肌醇、环糊精等。所述赋形剂还可以包括无机盐或缓冲剂，诸如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及其组合。所述组合物还可以包括用于预防或阻止微生物生长的抗微生物剂。适合于本公开的一个或多个实施方案的抗微生物剂的非限制性实例包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、苯基硝酸汞、硫柳汞及其组合。抗氧化剂同样可以存在于所述组合物中。抗氧化剂用于防止氧化，由此防止制剂的缀合物或其他组分的变质。用于本公开的一个或多个实施方案中的合适的抗氧化剂包括例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠及其组合。表面活性剂可以作为赋形剂存在。示例性的表面活性剂包括：聚山梨醇酯，诸如“Tween 20”和“Tween 80”，以及普朗尼克，诸如F68和F88(其两者可得自BASF,Mount Olive, New Jersey)；脱水山梨醇酯；脂质，诸如磷脂，诸如卵磷脂和其他磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(尽管优选不是呈脂质体形式)、脂肪酸和脂肪酯；类固醇，诸如胆固醇；和螯合剂，诸如EDTA；锌和其他此类合适的阳离子。酸或碱可以作为赋形剂存在于组合物中。可以使用的酸的非限制性实例包括选自以下的那些酸：盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸及其组合。合适的碱的实例包括但不限于选自以下的碱：氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾及其组合。一种或多种氨基酸可以作为赋形剂存在于本文所述的组合物中。在这方面，示例性的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和甘氨酸。额外的合适的药学上可接受的赋形剂包括例如Handbook of PharmaceuticalExcipients, 第7版, Rowe, R.C., 编, Pharmaceutical Press, 2012中描述的那些。选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR

给药：

选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR

优选的剂量的量是在受试者中相比于常规T细胞和自然杀伤细胞有效地优先扩增和活化调节性T细胞的低剂量。调节性T细胞的活化可以通过许多不同的方法来测量。例如，鉴于STAT5在IL-2-依赖性T细胞过程中的整体作用，在淋巴细胞中增加的STAT5的检测可以用作Treg活化的关键标志物。在表型上，Treg的活化还可以通过流式细胞术通过增加的细胞表面IL-2Rα(CD25)和/或增加的蛋白叉头盒P3 (Foxp3)(Treg谱系的主要调节子)的细胞内表达和/或增加的与细胞增殖相关的蛋白Ki67的表达来测量。共同地，这些标志物与Treg细胞的功能相关，并且在自身免疫性疾病中的此类细胞中经常失调。本文中，Treg细胞诱导和活化的优选检测通过流式细胞术进行。Treg的功能性也可以通过离体抑制测定法来评价，所述离体抑制测定法测量其抑制常规T细胞的增殖的能力。还可以使用抗原驱动的炎症模型在体内直接测量Treg动员和活化的结果。

本文提供的RUR

在某些实施方案中，选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR

如本文所用的术语“患者”或“受试者”是指患有或易患可以通过施用如本文提供的组合物预防或治疗的病况、诸如自身免疫性疾病的活生物体，并且包括人和动物两者。受试者包括但不限于哺乳动物(例如，鼠、猿猴、马、牛、猪、犬、猫等)，并且优选是人。在某些实施方案中，所述患者、优选人的进一步特征在于具有疾病、病症或病况，诸如自身免疫性疾病，其将受益于本公开的组合物的施用。

如本文所用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指具有病况的患者的管控和护理，为了抗击或缓解那些病况的症状和并发症的目的，本公开的组合物的施用被指示用于所述病况。治疗包括向有此需要的患者施用本公开的组合物以预防症状或并发症的发作，减轻所述症状或并发症，或消除所述疾病、病况或病症。例如自身免疫病症。优选地，治疗包括向有此需要的患者施用本公开的组合物以导致免疫抑制和/或耐受。待治疗的患者是动物，且优选人类。如本文所用的施用包括所述患者服用所述组合物的情况和/或所述患者被指导服用所述组合物的情况。

短语“药学有效量”和“药理学有效量”和“治疗有效量”和“生理有效量”在本文中可互换使用，并且是指本文提供的RUR

包含本公开的化合物的药物组合物可以肠胃外施用于需要这种治疗的患者。肠胃外施用可以通过皮下、肌肉内或静脉内注射通过注射器、任选笔样注射器或机械驱动的喷射器的方式来进行。或者，肠胃外施用可以通过输注泵的方式来进行。本公开的实施方案提供适合于施用于患者的药物组合物，所述施用包括向有此需要的患者施用治疗有效量的本公开的组合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。此类药物组合物可以使用本领域中众所周知的用于药物产品的常规赋形剂通过各种技术中的任一种来制备。(Remington’sPharmaceutical Sciences, 第21版, University of the Sciences in Philadelphia,Philadelphia, PA, USA (2006))。

选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR

如本文所用，术语“有效量”是指本公开的组合物在单剂量或多剂量施用于患者或受试者后将引发由研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在寻求的组织、系统、动物、哺乳动物或人的生物学或医学应答或对组织、系统、动物、哺乳动物或人的期望的治疗效果的量或剂量。优选地，有效量是指本公开的组合物在单次或多次施用于患者或受试者后将诱导选择性Treg细胞比给药前水平增加至少10倍的量或剂量。剂量可以包括较高的初始负荷剂量，随后为较低的剂量。在一种或多种情况下，选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR

本文提供的组合物有效地恢复免疫系统的体内平衡能力，例如具有积极影响其中Treg功能障碍发挥作用的疾病(诸如自身免疫性疾病、过敏症和移植排斥)的能力。在一个实施方案中，本文提供了通过施用选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR

可以调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗效果)。对于静脉内(

当以治疗有效剂量施用于受试者时，本文提供的组合物可用于增加调节性T细胞(诸如Foxp3+和CD25+细胞)与效应T细胞(诸如CD4+和CD8+细胞)的比率。例如，当与基线比较并在体内小鼠模型中评估(例如，诸如本文所述)时，选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR

如所附实施例中所示，当在合适的剂量范围内施用时，选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR

实施例

应理解，前述描述以及随后的实施例意欲举例说明而非限制本文提供的公开内容的范围。在本公开的范围内的其他方面、优点和修改对于本公开所属领域的技术人员将是显而易见的。

材料和方法

克隆并表达具有与阿地白介素(des-丙氨酰-1，丝氨酸-125人白介素-2，参见图2)的氨基酸序列相同的氨基酸序列的重组人IL-2，并用于制备本文称为RUR

聚乙二醇试剂，mPEG2(20kD)-丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(1,3-双(甲氧基聚(乙二醇)

除非另有指明，否则选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR

RUR

实施例1

RUR

在2 mM HCl中制备mPEG2-ru-20K NHS的储备溶液(100 mg/mL)。典型的IL-2 PEG化反应如下实施：将115 mL IL-2(阿地白介素)储备溶液(1.3 mg/mL)转移至250 mL塑料瓶中，并将15 mL 0.5 M Bicine (

通过使用SP FF Sepharose的阳离子交换色谱法纯化所得的IL-2缀合物产物。在缀合反应完成后，将反应混合物针对20倍体积的10 mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0)进行透析。透析样品用水1:4稀释，并负载至装有SP FF Sepharose树脂的柱上。用于阳离子交换色谱的缓冲液如下：缓冲液A：10 mM乙酸钠(pH 4.0)，和缓冲液B：10 mM乙酸钠，1.0 M氯化钠(pH4.0)。在样品负载之前，将树脂用缓冲液B洗涤并用缓冲液A平衡。在负载之后，将树脂用3倍柱体积的缓冲液A洗涤。缀合和未缀合的IL-2使用由以下组成的四步梯度洗脱：经5倍柱体积的0至50%缓冲液B，经1倍柱体积的25%至50%缓冲液B，经1倍柱体积的50%缓冲液B，经1倍柱体积的50%至100%缓冲液B和经1倍柱体积的100%缓冲液B，其中流速为28 cm/h。含有具有2和3(即，二聚体和三聚体)的PEG化程度(dP)的IL-2缀合物的级分通过SDS-PAGE鉴定并合并。

使用搅拌的超滤室(Amicon)和氮气浓缩含有二聚体和三聚体的合并的级分。通过RP-HPLC使用以下流动相确定最终产物的组成：A，0.09% TFA/水，和B，0.04% TFA/乙腈。使用Intrada WP-RP C18柱(3 x 150 mm)，其中流速为0.5 ml/min，且柱温度为50℃。确定纯化的缀合物混合物包含约4.6% (mol)的单-PEG化的rIL-2，约47.7% (mol)的二-PEG化的rIL-2，约42.9% (mol)的三-PEG化的rIL-2和约4.8% (mol)的四-PEG化的IL-2。参见图1，其中在x轴上提供洗脱时间。最终产物混合物的平均PEG化程度被确定为2.48(即，约2.5)。在最终产物混合物中未检测到游离的IL-2。该制剂是配方A的RUR

实施例1-A

RUR

期望的RUR

期望的RUR

将冷冻的IL-2起始材料(已经在-70℃下储存的10 mM乙酸盐，5%海藻糖，pH 4.5缓冲液中的纯化重组IL-2(阿地白介素序列))解冻至室温。PEG反应物mPEG2-ru-20K NHS(粉末)通过在室温下以~90 g/L添加至2mM HCl溶液中而溶解，并搅拌最少15分钟。然后将溶液装入反应容器中。将解冻的IL-2添加至反应容器中，用水适当稀释，随后添加0.75 Mbicine pH 9.7缓冲液。反应混合物中的最终IL-2浓度为近似1.0 g/L，且bicine浓度为近似50 mM，以达到8.7的目标pH。通常，在pH 8.5至9.5的bicine缓冲溶液中，PEG:rhIL-2质量比为约10:1至13:1，以使蛋白PEG化。将反应物在22℃下在连续搅拌下孵育40分钟，如从完成mPEG2-ru-20K NHS溶液添加所测量。在孵育时段结束时，反应通过添加1N乙酸以迅速降低pH来淬灭，并且随后立即使用额外的1N乙酸进一步逐步滴定至pH 4.0。将淬灭的反应物通过添加水稀释10倍。将稀释的淬灭反应物过滤通过0.22µm过滤器，以提供粗产物。

然后对粗产物进行SP SEPHAROSE®快速流动阳离子交换色谱，以部分分离PEG化的反应级分。将SP SEPHAROSE®快速流动阳离子交换色谱柱平衡，并在室温下负载进料，停留时间为~5分钟，随后用负载缓冲液洗涤5 CV(柱体积)。PEG化的rhIL-2结合树脂，而游离的PEG被洗掉。然后使用线性梯度洗脱用10 mM乙酸钠pH 4.0缓冲液背景中的0-500 mM氯化钠洗脱产物。收集各自0.15 CV的级分，开始~1 CV进入洗脱。当在280 nm处的吸光度为最大峰的<5%时，结束级分收集。通过在280 nm的波长处的吸光度测量每种级分中的PEG化级分浓度(即，单-PEG化的IL-2(单体)，二-PEG化的IL-2(二聚体)，三-PEG化的IL-2(三聚体)，四-PEG化的IL-2(四聚体)等)。PEG化的级分的分布通过如本文所述的RP-HPLC进行测量，并且鉴定含有单-PEG、二-PEG、三-PEG和更高组分的级分，并用于确定生成将具有目标PEG化的级分分布概况(如本文所提供的RUR

分析重新合并的和/或目标产物，并通过本文所述的方法(包括RP-HPLC)验证组合物分布，以评价PEG级分的概况。通过下表1中列出的编号为1-4的实施例产品批次举例说明根据本文说明书的式A-E的RUR

表1. 通过RP-HPLC和SEC-HPLC的RUR

ND检测不到，NMT不超过。

在一些实施方案中，在摩尔基础上，所述RUR

在一些实施方案中，所述RUR

在一些实施方案中，在摩尔基础上，所述RUR

在一些实施方案中，所述RUR

在一些实施方案中，所述RUR

在一些实施方案中，所述RUR

在一些实施方案中，所述RUR

实施例1-B

经由反相高效液相色谱的RUR

使用配备有二极管阵列检测器(215 nm处的UV)的Agilent 1200系列仪器，使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)来评价RUR

将冷冻的RUR

包含二-PEG化的(二-PEG)和三-PEG化的(三-PEG)RUR

表 2：通过RP-HPLC分析的六份RUR

表 3：通过RP-HPLC分析的十二份RUR

实施例1-C

经由大小排阻高效液相色谱法的RUR

使用配备有二极管阵列检测器(在280 nm处的UV)和Yarra SEC-2000柱(Phenomenex)的Agilent 1200系列仪器，大小排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)也可用于测定纯度和表征RUR

在程序上，首先经由注入使制剂缓冲液的至少一种空白对照经历RP-HPLC，以确保不干扰RUR

前五次参考材料注入物的二-PEG和三-PEG RUR

RUR

表 4：通过SEC-HPLC的RUR

表 5：通过SEC-HPLC的RUR

通过RP-HPLC和SEC-HPLC两者的RUR

实施例1-D

SDS-Page

SDS-PAGE用于证实RUR

实施例1-E

使用表面等离振子共振(SPR)的对IL-2Rαβ的亲和力，以及在表达人IL-2Rαβα复合物的U-2 OS细胞中的功效。

使用具有偏振光检测的Biacore X-100表面等离振子共振，测定RUR

表6：使用SPR的RUR

或者，PathHunter

实施例1-F

RUR

通过肽作图通过直接比较RUR

通常，该分析可以如下进行。在直接肽作图比较研究中，RUR

简而言之，在RUR

肽相对强度(Pep/Ref)= UV峰面积(肽)/UV峰面积(参考肽)。

用作RUR

RUR

4k PEG化的rhIL-2替代物的肽作图以高质量准确度(<5ppm)鉴定具有4k PEG标记的赖氨酸的肽。RUR

在第二RUR

表7.

RUR

DEMO批次是指为了证明生产过程的可操作性而进行的制备。

表8. RUR

实施例1-G

RUR

通过如前所述的RP-HPLC在三种不同的储存条件(室温(环境实验室条件)、5℃(冷藏)和-20℃)下在1、3、5和7-天时间点评估1.0 mg/mL的RUR

针对对照、新鲜制备的RUR

体外生物测定：

体外方法可用于进一步测量RUR

生物测定方法

在所有三种测定中，来自剂量-应答曲线(应答相比于浓度)的数据使用非线性回归模型评估。RUR

实施例1-H

CTLL-2细胞增殖测定

在细胞增殖测定中，在将样品和参考孵育~26小时后，在体外使用CTLL-2细胞测量细胞生长，其中细胞增殖经由基于发光三磷酸腺苷的测定(CellTiter-Glo

实施例1-I

磷酸化-STAT5活化

在受体结合后的磷酸化-STAT5测定中，下游细胞信号传导然后可以通过磷酸化活化信号传导子及转录激活子5 (Signal Transducer and Activator of Transcription 5,STAT5)以促进基因表达以诱导细胞增殖。在CTLL-2细胞(一种IL-2-依赖性鼠T淋巴细胞细胞系)中，使用磷酸化-STAT5/总STAT5多重化测定(Meso Scale Discovery, MD)，测量响应于样品和参考处理~10分钟的磷酸化-STAT5的活化。

实施例2

体内研究：小鼠中的单剂量PK/PD研究

可以在小鼠中证明RUR

如图3A和3B中所示，RUR

实施例3

体外Treg抑制测定

该研究的目标是评价调节性T细胞的抑制功能。在皮下施用后的第1-7天和第10天，从未处理和RUR

简而言之，在剂量施用后的所示时间从用各种剂量水平(0.03、0.1和0.3 mg/kg)的RUR

在补充有10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、0.5 μM β-巯基乙醇和1X抗生素/抗真菌剂(100单位/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和250 ng/mL两性霉素B)的RPMI1640培养基中实施体外抑制测定。在96-孔圆底板中，在100 μL培养基中，将5 x 10

如图6A-D中所示，在研究开始后1天和4天从媒介物处理的小鼠分离的脾脏的Treg表现出抑制能力，其中最大抑制发生在1:2的比率。然而，在施用RUR

实施例4

小鼠KLH DTH效力模型中的RUR

为了通过施用RUR

如图8A、8B中所示，在抗原攻击后，诱导耳肿胀，其中耳厚度的平均增加在48小时时达到超过14 mm的最大值。在研究过程期间，未处理的未攻击的耳没有表现出厚度的变化。在该研究中贯穿致敏和攻击时段中的RUR

在啮齿动物和食蟹猴中，在体内施用后评价实施例1的RUR

实施例5

食蟹猴中的单剂量研究

在该研究中，向食蟹猴(一只雌性和一只雄性)皮下施用25 µg/kg RUR

对于免疫表型分析，在以下时间点从每只猴收集血液样品(近似1.0 mL)：处理前(第-6天和第-1天)，处理后第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第10天、第14天和第21天。将静脉穿刺样品收集至含有抗凝剂K

T细胞组：CD45/CD3/CD4/CD8/ICOS

T/B/NK组：CD45/CD3/CD16/CD20

pSTAT5组：CD3/CD4/CD8/CD25/CD127/pSTAT5

Treg组1：CD3/CD4/CD8/CD25/FoxP3/Ki67

Treg组2：CD3/CD4/CD8/CD25/FoxP3/Helios

计算机化的系统可用于研究的进行，例如，流式细胞术数据采集可以使用BDFACSCanto II/FACSDiva LEGENDPlex数据分析软件，并且流式细胞术数据分析可以使用DeNovo FCS Express软件。

将来自雄性和雌性的值平均化，并且显示相对于d-1值的变化幅度，用虚线标记。如图9中所示，Treg细胞数在施用后显著增加，在施用后7天达到其最大水平，并且到第1421天回复至接近d-1水平。如图9A中的空心三角形所示，由RUR

通过施用RUR

实施例6

小鼠、大鼠和猴中的单剂量药代动力学和毒物动力学

概述RUR

表10：RUR

对于小鼠研究，RUR

在皮下施用后，RUR

在大鼠中，RUR

血浆清除率(CL)非常低(大鼠中为0.560-1.14 mL/hr/kg，且猴中为0.245 mL/hr/kg)(表)。在静脉内或皮下给药后，RUR

表11：向C57BL/6小鼠、Sprague-Dawley大鼠或食蟹猴施用单一皮下剂量的RUR

AUCinf：从时间零至无限时间的血浆浓度-时间曲线下的面积；

AUClast：从时间零至最后可测量浓度的血浆浓度-时间曲线下的面积；Cmax：观察到的最大血浆浓度；MRTinf：平均停留时间；Tmax：观察到最大血浆浓度的的时间

1. PK参数基于每个时间点三只大鼠的平均值。

2. 雄性和雌性猴的平均值。

表12：向Sprague-Dawley大鼠或食蟹猴施用单一静脉内剂量的RUR

ND：未测定；AUCinf：从时间零至无限时间的血浆浓度-时间曲线下的面积；AUClast：从时间零至最后可测量浓度的血浆浓度-时间曲线下的面积；CL：清除率；MRTinf：平均停留时间；Vss：稳态下的分布的表观体积。*雄性和雌性猴的平均值。

实施例7

小鼠中的比较研究

进行与实施例2中描述的研究基本上相似的研究，其中向C57BL/6小鼠施用单一皮下剂量的0.03、0.1和0.3 mg/kg的RUR

实施例8

RUR

进行该研究以使用MRL/MpJ-Faslpr小鼠模型(该疾病的最通常研究的小鼠模型)测定RUR

表13-治疗组

a：测试物品的媒介物。

实施例9

RUR

该研究模拟在食物过敏模型(其中建立高程度的过敏反应)中，通过RUR

为了开发DTH模型，将Balb/c小鼠用在完全和不完全弗氏佐剂中乳化的模型抗原钥孔

在DTH的该小鼠模型中，RUR

本文提供的临床前证据支持以下概念：IL-2缀合物Treg刺激剂RUR

实施例10

I期、双盲、随机化的安慰剂对照研究，以评估健康志愿者中的RUR

进行一项双盲、随机化、安慰剂对照的研究，以评估健康志愿者中的单次递增低皮下剂量的RUR

该研究的主要目标是评估作为单次皮下剂量施用的RUR

没有报告剂量限制性毒性(DLT)、严重不良事件(SAE)、死亡或临床明显的异常。不良事件(AE)限于轻度(1级)注射部位反应，并且没有观察到已知与高剂量IL-2相关的AE的证据。

初步PK分析显示，在大多数受试者中，RUR

药效动力学(PD)评价揭示RUR

如图12中所示，RUR

重要地，看到RUR

还分析CD56+ NK细胞群体。注意到循环NK细胞的绝对数目的增加，其中该细胞亚群的百分比在13.5 μg/kg剂量水平下增加较小，但在较低剂量水平下则不是。此外，在3.0、6.0、9.0和13.5 μg/kg下还注意到表达Ki67(增殖的标志物，且因此是活化的标志物)的CD56+ NK细胞的百分比的剂量依赖性增加。在3.0、6.0和9.0 μg/kg下，在施用RUR

根据SAD研究的RUR

还计算RUR

通常，安全性结果发现没有剂量限制性毒性，死亡或导致研究中断的不良事件，没有临床上明显的生命体征，ECG或身体检查异常。不良事件主要限于轻度或中度(1级或2级)注射部位反应，4个受试者经历1级头痛事件，1个测试最高剂量(28.0 µg/kg)的受试者经历轻度(1级)体征以及发热、厌食、呕吐、腹泻、心动过速和肌痛(严重程度均为1级)的症状(其归因于细胞因子水平升高)，且未诱发抗药物抗体。

通常，观察到响应于RUR

在Tcon细胞的百分比中未观察到实质性变化，并且观察到CD56+ NK细胞响应于RUR

研究目标评价RUR

RUR

实施例11

I期、双盲、随机化的安慰剂对照的递增多剂量研究，以评估皮下RUR

进行一项双盲、随机化、安慰剂对照的研究，以评估4个剂量群组的具有最小至中度系统性红斑狼疮(SLE)的患者中的递增多剂量的RUR

表15. 单剂量和多剂量人研究中的PK数据