一种超灵敏检测前列腺特异性抗原PSA的方法

技术领域

本发明属于生物传感器的开发方法，涉及一种超灵敏检测前列腺特异性抗原PSA的方法。

背景技术

前列腺特异性抗原(PSA)是一种特异性的前列腺癌标志物，目前已成为临床诊 断前列腺癌的重要生物标志物

考虑到蛋白质在疾病中的重要作用，PCR被应用到对蛋白质的高灵敏度检测，从而发展了免疫PCR(immuno-PCR,IPCR)

金纳米颗粒(AuNPs)作为一种替代信号报告物在生物传感器中得到了广泛的研究，其具有高的光稳定性，易于与DNA等生物分子合成和功能化，具有较强的光吸 收和散射特性

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发明内容

要解决的技术问题

为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种超灵敏检测前列腺特异性抗原PSA的方法，降低现有技术易出现假阳性的风险，提高现有技术的灵敏度。

技术方案

一种超灵敏检测前列腺特异性抗原PSA的方法，其特征在于步骤如下：

步骤1、制备脱氧核糖核酸DNA修饰AuNPs：将巯基修饰的DNA的Oligo 6和 Oligo 7分别溶解于60.0μL的pH为5.0的醋酸盐缓冲溶液，再加入12.0μL的20.0mM 的三(2-羧乙基)膦(TCEP)，以还原修饰在DNA上的巯基为二硫键，然后将上述溶 液全部转移至10.0mLAuNPs溶液中，室温孵育16.0h；然后在接下来的44.0h内， 向金纳米粒子溶液中加入5.0M的氯化钠NaCl溶液，并使最终溶液中NaCl的浓度为 100.0mM；修饰完成，除去未修饰到金纳米粒子表面的DNA；最后将制备的修饰了 DNA的金纳米粒子稀释到所需浓度；

步骤2、分子内杂交反应：2.0μL 0.4nM的DNA的Oligo 1和Oligo 2在90.0℃ 加热变性10.0分钟并迅速冷却到室温，然后向20.0mM Tris-Cl，pH值7.9、50.0mM 醋酸钾KAc、10.0mM醋酸镁Mg(Ac)

步骤3、聚合酶链扩增反应：PCR混合物的总量为50.0μL的溶液，包括小于50.0 μL的步骤2的溶液、1U Taq酶、200.0μM dNTPs、2.5mM氯化镁MgCl

当PSA存在时，Oligo 1和Oligo 2为DNA/DNA双链结构，PSA识别并结合Oligo 1形成PSA/Oligo 1复合物，与PSA混合后释放Oligo 2，反应终止；当PSA不存在时， Oligo 1和Oligo 2在克列诺片段聚合酶的作用下以彼此为模板延伸，得到两条更长的 DNA链，这两条长DNA链在PCR循环中，通过正向引物和反向引物Oligo 3和Oligo 4识别新模板进行PCR扩增，并在每个周期的延伸过程中对Oligo 5进行切割，其中， Oligo 5包含两个部分，一部分与新扩增模板DNA互补，另一部分与AuNPs上修饰的 DNA的Oligo 6和Oligo 7互补，因此在PCR扩增前AuNPs处于聚集状态，随着PCR 循环周期的延长，AuNPs的聚集程度会逐渐减弱，PSA浓度变化会影响溶液中AuNPs 的直径变化，通过测定直径变化可以定量PSA

PCR扩增条件是：首先94℃变性3分钟，接着以94℃20s，48℃30s，72℃30 s的程序循环30次，最后为保证延伸充分进行，72℃温度条件下继续延伸3分钟； PCR反应后溶液中AuNPs的直径变化用动态光散射方法检测；

步骤4、动态光散射粒子直径的测量：采用Nano/Zeta电位计动态光散射粒径测量方法检测步骤3的溶液直径变化；操作条件：温度25.0℃，入射角度90.0°，入射激 光波长683.0nm，激光功率100.0mW；所有测量的尺寸均以强度平均值为基础，每个 粒径为五个测量值的平均值；

所述DNA序列为：

所述金纳米粒子AuNPs的制备：将2.0mL38.8 mM柠檬酸钠溶液快速加入煮沸的1.0mM氯金酸HAuCl

所述步骤1的除去未修饰到金纳米粒子表面的DNA是：将溶液放置在13800.0rpm转速的离心机离心三次，每次离心30.0分钟，以除去未修饰到金纳米粒子表面的DNA， 每次用pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸Tris-Ac缓冲溶液洗涤。

有益效果

本发明提出的一种超灵敏检测前列腺特异性抗原PSA的方法，利用Taq聚合酶的复制和酶切特性，切断连接DNA修饰的AuNPs的链，使本来处于聚集状态的AuNPs 分散。AuNPs的分散导致AuNPs的大小发生变化，DLS对其进行了高度敏感的测量。

采用动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)研究了该方法的可行性。如图1A 所示，加入0.1μg mL

对分析物的线性响应是分析的关键，因此该方法对不同浓度的PSA存在时AuNPs溶液的直径进行了DLS检测。由图2可知，随着PSA浓度的增加，AuNPs的平均直 径逐渐减小且AuNPs平均直径与PSA浓度的线性关系，结果显示在10.0pg mL

附图说明

图1：(A)动态光散射的结果；(B)透射电镜的结果(a)没有PSA的PCR反应产物； (b)0.1mg mL

图2：金纳米粒子的水合直径与PSA浓度对数变化的线性关系，PSA的浓度从10.0pg mL

具体实施方式

现结合实施例、附图对本发明作进一步描述：

实例一：通过加标回收率研究该检测方法在复杂生物体质中的检测能力，即在没有被测物质的样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果 与理论值的比值。具体过程如下：首先在分子内杂交反应的缓冲液中加入5％人血清 和100.0pgmL

实例二：通过加标回收率研究该检测方法在复杂生物体质中的检测能力，即在没有被测物质的样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果 与理论值的比值。具体过程如下：首先在分子内杂交反应的缓冲液中加入5％人血清 和1.0ngmL

实例三：通过加标回收率研究该检测方法在复杂生物体质中的检测能力，即在没有被测物质的样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果 与理论值的比值。具体过程如下：首先在分子内杂交反应的缓冲液中加入5％人血清 和10.0ngmL

基于PCR的蛋白质检测需要将蛋白质的信息转化为核酸的检测。因此，我们设想，含有靶蛋白适配体的单链DNA(ssDNA)亲和探针可以作为我们系统中PCR的双链 DNA(dsDNA)模板，从而实现对蛋白质的灵敏度和普遍性检测。依据适配体也能够 结合互补的DNA序列形成一个双链结构，我们设计了一种基于适配体与AuNPs检测 的方法，该方法通过将DNA/DNA双链结构转换为DNA/目标复合物的结果来实现。 图1所示的原理图显示了基于AuNPs的的检测原理，通过双链DNA与复合物的结构 变化到双链DNA的结构来实现。Oligo 1和Oligo 2为DNA/DNA双链结构，PSA识 别并结合Oligo 1形成DNA/target complex，与PSA混合后释放Oligo 2，反应终止。 当PSA不存在时，Oligo 1和Oligo 2在exo

基于PCR的PSA检测需要将PSA的信息转化为核酸的检测。采用动态光散射 (DLS)和透射电镜(TEM)研究了该方法的可行性。如图2所示，加入0.1μg mL

对分析物的线性响应是分析的关键，因此该方法对不同浓度的PSA存在时金纳米粒溶液的直径进行了DLS检测。随着PSA浓度的增加，AuNPs的平均直径逐渐减小。 图2为AuNPs平均直径与PS浓度的线性关系，结果显示在10.0pg mL

为了研究该检测方法在复杂生物体质中的检测能力，我们进行了加入回收实验。如表1-2所示，在每个含有5％人血清的缓冲液中加入不同浓度的PSA，其回收率为 94.6％-97.7％，相对标准偏差(RSD)为2.8％-5.3％。这些结果表明，DLS可以准确 地检测到这些样品中的PSA，表明其在生物系统中检测PSA蛋白的潜在应用价值。

表1-2人血清的PSA加入回收法