包含IL-15/IL-15RA Fc融合蛋白和TIM-3抗原结合结构域的靶向TIM-3的异源二聚体融合蛋白

相关申请的交叉引用

本申请案主张2018年4月18日递交的美国专利申请案第62/659,626号、 2018年12月20日递交的美国专利申请案第62/783,110号的优先权，其全部内容明确地以全文引用的方式并入本文中，特别参考其中的图、说明书和权利要求书。

背景技术

癌症免疫疗法中两种非常有前途的方法包括基于细胞因子的治疗和对免疫检查点蛋白(例如PD-1)的阻断。

细胞因子如IL-2和IL-15的功能有助于B细胞、T细胞和NK细胞的增殖和分化。这两种细胞因子均通过与三聚体复合物结合而发挥其细胞信号传导功能，所述三聚体复合物由两个共有受体，即共同γ链(γc；CD132)和IL-2受体β链(IL-2Rβ；CD122)，以及每种细胞因子特有的α链受体：IL-2受体α(IL-2Rα； CD25)或IL-15受体α(IL-15Rα；CD215)组成。这两种细胞因子均被认为是肿瘤学中潜在有价值的治疗剂，并且IL-2已被批准用于患有转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤的患者。尽管正在进行几项临床试验，但目前尚未批准使用重组IL-15。然而，作为潜在的药物，两种细胞因子都具有非常快的清除率，半衰期测得为几分钟。当以高剂量施用以克服快速清除时，IL-2免疫疗法已与全身毒性相关。在最近的临床试验中，IL-15免疫疗法也报道了这种全身毒性(Guo等，J Immunol，2015，195(5)：2353-64)。

T细胞活化后，免疫检查点蛋白(例如PD-1)被上调，以通过与免疫检查点配体(例如PD-L1)结合而耗尽活化的T细胞来排除自身免疫。然而，免疫检查点蛋白在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中也上调，并且免疫检查点配体在肿瘤细胞上过表达，从而有助于肿瘤细胞的免疫逃逸。已经证明，通过

因此，对于不需要高剂量且靶向肿瘤以避免细胞毒性的细胞因子的治疗策略，肿瘤学治疗仍存在未满足的需求。此外，需要确定其他治疗方式以与检查点阻断相叠加，以提高患者的反应率。

本发明通过提供靶向TIM-3的IL-15异源二聚体融合蛋白，从而解决了这些需求和注意事项，所述融合蛋白具有增强的半衰期和更具选择性的TIL靶向性，以改善安全性，并可与检查点阻断抗体协同结合(图1)。

发明内容

在一个方面，本发明提供具有靶向性的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白，其包含：a)第一单体，其由N端到C端包含：i)IL-15IL sushi结构域；ii)第一结构域连接子；iii)变体IL-15结构域；iv)第二结构域连接子；v)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和b)第二单体，其由N端到C端包含：i)scFv结构域；ii) 第三结构域连接子；iii)包含CH2-CH3的第二变体Fc结构域；其中scFv结构域包含第一可变重结构域、scFv连接子和第一可变轻结构域，其中scFv结构域结合人TIM-3。

在本发明的其他方面，此处提供的是具有靶向性的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白，其包含：a)第一单体，其由N端到C端包含：i)IL-15sushi结构域； ii)第一结构域连接子；iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和b)第二单体，其由N端到C端包含：i)scFv结构域；ii)第三结构域连接子；iii)包含CH2-CH3 的第二变体Fc结构域；其中所述scFv结构域包含第一可变重结构域、scFv连接子和第一可变轻结构域；和c)包含变体IL-15结构域的第三单体，其中所述 scFv结构域结合人TIM-3。

一方面，提供了“scIL-15/RαX Fab”格式的异源二聚体蛋白。此类“scIL- 15/RαXFab”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其从N端至C端包含： i)IL-15Rα(sushi)结构域；ii)第一结构域连接子；iii)IL-15变体；iv)第二结构域连接子；v)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；b)第二单体，其从N端到C 端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c) 包含VL-CL的第三单体。VH和VL分别是可变的重结构域和可变的轻结构域，其形成人TIM-3抗原结合结构域。在一些实施方式中，第二结构域连接子是抗体铰链。

在“scIL-15/RαX Fab”格式异源二聚体蛋白的某些实施方式中，第一变体 Fc结构域第二变体Fc结构域包含以下偏斜变体组之一：S267K/L368D/K370S: S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K； L368E/K370S:S364K；T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S: S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，其中所述编号根据EU编号。在示例性实施方式中，偏斜变体组是S364K/E357Q：L368D/K370S。

在“scIL-15/RαX Fab”格式异源二聚体蛋白的示例性实施方式中，“scIL- 15/RαXFab”格式异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其从N端至C端包含的：)IL-15Rα(sushi)结构域；ii)第一结构域连接子；iii)IL-15变体；iv)铰链；v) 包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；b)第二单体，其从N端到C端包含VH- CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)包含VL-CL 的第三单体。VH和VL分别是可变的重结构域和可变的轻结构域，其形成人 TIM-3抗原结合结构域。在这样的实施方式中，第一变体Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第一变体Fc结构域包含pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中所述编号根据 EU编号。在一些实施方式中，第一单体的铰链包含氨基酸取代C220S，其中所述编号根据EU编号。在示例性实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包含半衰期延长变体M428:/N434S。

在“scIL-15/RαX Fab”格式异源二聚体蛋白的一些实施方式中，本文提供的异源二聚体蛋白的IL-15变体包含选自以下的氨基酸取代N1D、N4D、D8N、 D30N、D61N、E64Q、N65D、Q108E、N4D/N65D、D30N/N65D和 D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，IL-15变体包含氨基酸取代 N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。

在示例性实施方式中，“scIL-15/RαX Fab”格式异源二聚体蛋白是 XENP27974、XENP27979、XENC1000、XENC1001、XENC1002或 XENC1003。

在某些实施方式中，本文提供的“scIL-15/RαXFab”格式异源二聚体蛋白的 VH和VL是图12和13中任何TIM-3抗原结合结构域的可变重结构域和可变结构域。在示例性的实施方式中，TIM-3抗原结合结构域是3H3_H1_L2.1。

一方面，本文提供了具有“scIL-15/RαX scFv”格式的异源二聚体蛋白。在一个实施方式中，所述异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其从N端至C端包含：i)IL-15Rα(sushi)结构域；ii)第一结构域连接子；iii)IL-15变体；iv)第二结构域连接子；和v)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和b)第二单体，其从 N端到C端包含：i)scFv结构域；ii)第三结构域连接子；和iii)包含CH2-CH3 的第二变体Fc结构域。在一些实施方式中，scFv结构域包含可变重结构域(VH)、scFv连接子和可变轻结构域(VL)，并且scFv结构域结合人TIM-3。在“scIL-15/RαX scFv”格式异源二聚体蛋白的一些实施方式中，第二结构域连接子和第三结构域连接子各自是抗体铰链。

在某些实施方式中，第一变体Fc结构域第二变体Fc结构域包含以下偏斜变体组之一：S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q: L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K； T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S: S364K/E357Q，其中所述编号根据EU编号。在示例性实施方式中，偏斜变体组是S364K/E357Q：L368D/K370S。

在“scIL-15/RαX scFv”格式的一些实施方式中，异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其从N端到C端包含：i)IL-15Rα(sushi)结构域；ii)第一结构域连接子； iii)IL-15变体；iv)铰链；和v)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和b)第二单体，其从N端到C端包含：i)scFv结构域；ii)铰链；和iii)包含CH2-CH3的第二变体Fc结构域。在一些实施方式中，scFv结构域包含可变重结构域(VH)、 scFv连接子和可变轻结构域(VL)，并且scFv结构域结合人TIM-3。在这样的实施方式中，第一变体Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第一变体Fc结构域包含pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且所述编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一和第二铰链各自包含氨基酸取代C220S，其中所述编号根据EU编号。在一个实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包含半衰期延长变体 M428:/N434S。

在另一方面，本文提供了“scFv X ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白。此类异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其从N端到C端包含：i)scFv结构域；ii) 第一结构域连接子；和iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；b)第二单体，其从N端至C端包含：i)IL-15Rα(sushi)结构域；ii)第二结构域连接子；和iii)包含CH2-CH3的第二变体Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体。scFv结构域包含可变重结构域(VH)、scFv连接子和可变轻结构域(VL)，并且scFv结构域结合人TIM-3。在一个实施方式中，第一结构域连接子和第二结构域连接子各自是抗体铰链。

在“scFv X ncIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的一些实施方式中，第一变体 Fc结构域第二变体Fc结构域包含以下偏斜变体组之一：S267K/L368D/K370S: S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K； L368E/K370S:S364K；T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S: S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，其中所述编号根据EU编号。在示例性实施方式中，偏斜变体组是S364K/E357Q：L368D/K370S。

在示例性实施方式中，“scFv X ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白包括：a) 第一单体，其从N端至C端包含的：i)scFv结构域；ii)铰链；和iii)包含CH2- CH3的第一变体Fc结构域；b)第二单体，其从N端至C端包含的：i)IL- 15Rα(sushi)结构域；ii)铰链；和iii)包含CH2-CH3的第二变体Fc结构域；和c) 包含IL-15变体的第三单体。此外，scFv结构域包含可变重结构域(VH)、scFv 连接子和可变轻结构域(VL)，并且scFv结构域结合人TIM-3。在这样的实施方式中，第一变体Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第一变体Fc结构域包含pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且其中所述编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一和第二铰链各自包含氨基酸取代C220S，其中所述编号根据EU编号。在一个实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包含半衰期延长变体M428:/N434S。

在另一方面，本文提供“scFv x dsIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白。“scFv xdsIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其从N端至C端包含： i)包含取代半胱氨酸残基的氨基酸的变体IL-15Rα(sushi)结构域；ii)第一结构域连接子；和iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；b)第二单体，其从N端到C端包含：i)scFv结构域；ii)第二结构域连接子；iii)包含CH2-CH3的第二变体Fc结构域；c)第三单体，其包含IL-15变体，该IL-15变体包含取代半胱氨酸残基的氨基酸。scFv结构域包含可变重结构域(VH)、scFv连接子和可变轻结构域(VL)，其中变体IL-15Rα(sushi)结构域的半胱氨酸残基和IL-15变体的半胱氨酸残基形成二硫键，并且scFv结构域结合人TIM-3。在某些实施方式中，第一结构域连接子和第二结构域连接子各自是抗体铰链。

在“scFv x dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的一些实施方式中，第一变体Fc结构域第二变体Fc结构域包含以下偏斜变体组之一：S267K/L368D/K370S: S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K； L368E/K370S:S364K；T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S: S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，其中所述编号根据EU编号。在示例性实施方式中，偏斜变体组是S364K/E357Q：L368D/K370S。

在示例性实施方式中，“scFv x dsIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白包括：a) 第一单体，其包含从N端到C端：i)包含取代半胱氨酸残基的氨基酸的变体IL- 15Rα(sushi)结构域；ii)铰链；和iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；b)第二单体，其包含从N端到C端：i)scFv结构域；ii)铰链；iii)包含CH2-CH3的第二变体Fc结构域；c)第三单体，其包含IL-15变体，该IL-15变体包含取代半胱氨酸残基的氨基酸。scFv结构域包含可变重结构域(VH)、scFv连接子和可变轻结构域(VL)，其中变体IL-15Rα(sushi)结构域的半胱氨酸残基和IL-15变体的半胱氨酸残基形成二硫键，并且scFv结构域结合人TIM-3。在这样的实施方式中，第一变体Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第一变体Fc结构域包含pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中所述编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一和第二单体的铰链各自包含氨基酸取代C220S，其中所述编号根据EU编号。在一些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自包含半衰期延长变体 M428:/N434S。

一方面，本文提供“Fab X ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白。此类异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其从N端到C端包含：VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其从N端至C端包含： i)IL-15Rα(sushi)结构域；ii)第一结构域连接子；iii)包含CH2-CH3的第一变体 Fc结构域；c)第三单体，其包含含有VL-CL的轻链；和d)包含IL-15变体的第四单体。VH和VL分别是可变的重结构域和可变的轻结构域，其形成人TIM-3 抗原结合结构域。在一些实施方式中，第一结构域连接子是抗体铰链。

在“Fab X ncIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的一些实施方式中，第一变体 Fc结构域第二变体Fc结构域包含以下偏斜变体组之一：S267K/L368D/K370S: S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K； L368E/K370S:S364K；T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S: S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，其中所述编号根据EU编号。在示例性实施方式中，偏斜变体组是S364K/E357Q：L368D/K370S。

在示例性实施方式中，“Fab X ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白包括：a) 第一单体，其从N端至C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3为第一变体Fc结构域；b)第二单体，其从N端至C端包含：i)IL-15Rα(sushi)结构域；ii)铰链；iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；c)第三单体，其包含含有VL-CL的轻链；和d)包含IL-15变体的第四单体。VH和VL分别是可变的重结构域和可变的轻结构域，其形成人TIM-3抗原结合结构域。在这样的实施方式中，第一变体Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO 变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，和第一单体的铰链-第一变体Fc结构域包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中所述编号根据EU 编号。在一些实施方式中，第二单体的铰链包含氨基酸取代C220S，其中所述编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包含半衰期延长变体M428:/N434S。

在另一方面，本文提供了“Fab X dsIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白。此类“FabX dsIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其从N端至C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其从N端到C端包含：i)变体IL-15Rα(sushi)结构域，其包含取代半胱氨酸残基的氨基酸；ii)第一结构域连接子；和iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；c)第三单体，其从N端到C端包含VL-CL；和d)第四单体，其包含IL- 15变体，该IL-15变体包含取代半胱氨酸残基的氨基酸。此外，变体IL- 15Rα(sushi)结构域的半胱氨酸残基和IL-15变体的半胱氨酸残基形成二硫键，并且VH和VL分别是可变重结构域和可变轻结构域，其形成人TIM-3抗原结合结构域。在一些实施方式中，第一结构域连接子是抗体铰链。

在“Fab X dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的一些实施方式中，第一变体 Fc结构域，第二变体Fc结构域包含以下偏斜变体组之一： S267K/L368D/K370S：S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q：L368D/K370S； L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K； L368D/K370S：S364K/E357L和K370S：S364K/E357Q，其中所述编号根据EU 编号。在示例性实施方式中，偏斜变体组是S364K/E357Q：L368D/K370S。

在示例性实施方式中，“Fab X dsIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白包括：a) 第一单体，其从N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3为第一变体Fc结构域；b)第二单体，其从N端到C端包含：i)变体IL-15Rα(sushi) 结构域，其包含取代半胱氨酸残基的氨基酸；ii)铰链；和iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；c)第三单体，其从N端到C端包含VL-CL；和d)第四单体，其包含IL-15变体，该IL-15变体包含取代半胱氨酸残基的氨基酸。此外，变体IL-15Rα(sushi)结构域的半胱氨酸残基和IL-15变体的半胱氨酸残基形成二硫键，并且VH和VL分别是可变重结构域和可变轻结构域，其形成人TIM-3 抗原结合结构域。在这样的实施方式中，第一变体Fc结构域包含偏斜变体 L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，和第一单体的铰链-第一变体Fc结构域包含pI变体 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中所述编号根据EU编号。在某些实施方式中，第二单体的铰链包含氨基酸取代C220S，其中所述编号根据EU编号。在一些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包含半衰期延长变体M428:/N434S。

一方面，本文提供“mAb-scIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白。“mAb-scIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其从N端到C端包含VH- CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其从N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域连接子-IL-15Rα(sushi)结构域-结构域连接子-IL-15变体，其中CH2-CH3为第二变体Fc结构域；和c)第三单体和第四单体，其各自从N端至C端包含VL-CL。此外，第一单体的VH和第三单体的VL形成第一人TIM-3结合结构域，并且第二单体的VH和第四单体的VL形成第二人TIM-3结合结构域。

在“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的一些实施方式中，第一变体Fc 结构域第二变体Fc结构域包含以下偏斜变体组之一：S267K/L368D/K370S: S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K； L368E/K370S:S364K；T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S: S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，根据EU编号。在示例性实施方式中，偏斜变体组是S364K/E357Q：L368D/K370S。

在“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的一些实施方式中，第一变体Fc 结构域包含偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含偏斜变体 S364K/E357Q，并且第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中所述编号根据EU编号。在某些实施方式中，a)第一单体的铰链第一变体Fc结构域还包含pI取代N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且第二单体的铰链-第二变体Fc结构域还包含pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K；b)第一单体的铰链第一变体Fc结构域还包含pI取代N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D；或c)第二单体的铰链-第二变体Fc结构域还包含pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，其中所述编号根据EU编号。

在“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的一些实施方式中，第一变体Fc 结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包含偏斜变体 L368D/K370S，以及第一和第二变体Fc结构域每个都包含FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中所述编号根据EU编号。在这样的实施方式中，a)第一单体的铰链第一变体Fc结构域还包含pI取代 Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，第二单体的铰链第二变体Fc结构域还包含 pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D；b)第一单体的铰链第一变体Fc结构域还包含pI取代Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K；或者c)第二单体的铰链-第二变体Fc结构域还包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，其中所述编号根据EU编号。

在“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的一些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包含半衰期延长变体M428:/N434S。

在另一方面，本文提供“mAb-ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白。此类异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其从N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其从N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域连接子-IL-15Rα(sushi)结构域，其中CH2- CH3是第二变体Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自从N端至C端包含VL-CL。第一单体的VH和第四单体的VL形成第一人TIM-3结合结构域，并且第二单体的VH和第五单体的VL形成第二人 TIM-3结合结构域。

在“mAb-ncIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的一些实施方式中，第一变体Fc 结构域第二变体Fc结构域包含以下偏斜变体组之一：S267K/L368D/K370S: S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K； L368E/K370S:S364K；T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S: S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，其中所述编号根据EU编号。在示例性实施方式中，偏斜变体组是S364K/E357Q:L368D/K370S。

在“mAb-ncIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的示例性实施方式中，第一变体 Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含偏斜变体 S364K/E357Q，并且第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中所述编号根据EU编号。在一些实施方式中，a)第一单体的铰链-第一变体Fc结构域还包含pI取代 N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且第二单体的铰链-第二变体Fc结构域还包含pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K；b)第一单体的铰链-第一变体Fc结构域还包含pI取代N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D；c)第二单体的铰链-第二变体Fc结构域还包含pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，其中所述编号根据EU编号。

在“mAb-ncIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的另一示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包含偏斜变体 L368D/K370S，以及第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中所述编号根据EU编号。在某些实施方式中，a)第一单体的铰链-第一变体Fc结构域还包含pI取代Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，第二单体的铰链-第二变体Fc结构域还包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D；b)第一单体的铰链-第一变体 Fc结构域还包含pI取代Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K；c)第二单体的铰链 -第二变体Fc结构域包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，其中所述编号根据EU编号。

在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包含半衰期延长变体M428:/N434S。

在另一方面，本文提供的是“mAb-dsIL-15/Rα”异源二聚体蛋白。此类“mAb-dsIL-15/Rα”异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其从N端至C端包含 VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其从N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域连接子-变体IL- 15Rα(sushi)结构域，其中变体IL-15Rα(sushi)结构域取代半胱氨酸残基的氨基酸，并且其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)第三单体，其包含IL-15变体，该IL-15变体包含取代半胱氨酸残基的氨基酸；和d)第四和第五单体，其各自从N端至C端包含VL-CL。

变体IL-15Rα(sushi)结构域的半胱氨酸残基与IL-15变体的半胱氨酸残基形成二硫键，第一单体的VH和第四单体的VL形成第一人TIM-3结合结构域，并且第二单体的VH和第五单体的VL形成第二人TIM-3结合结构域。

在一些实施方式中，第一变体Fc结构域第二变体Fc结构域包含以下偏斜变体组之一：S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q: L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K； T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S: S364K/E357Q，其中所述编号根据EU编号。在示例性实施方式中，偏斜变体组是S364K/E357Q：L368D/K370S。

在“mAb-dsIL-15/Rα”异源二聚体蛋白的示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含偏斜变体 S364K/E357Q，以及第一和第二变体Fc结构域每个都包含FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中所述编号根据EU编号。在一些实施方式中，a)第一单体的铰链-第一变体Fc结构域还包含pI取代N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且第二单体的铰链-第二变体Fc结构域还包含pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K；b)第一单体的铰链-第一变体Fc结构域还包含pI取代N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D；c)第二单体的铰链-第二变体Fc结构域还包含pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，其中所述编号根据EU编号。

在“mAb-dsIL-15/Rα”异源二聚体蛋白的另一示例性实施方式中，第一变体 Fc结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包含偏斜变体 L368D/K370S，以及第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中所述编号根据EU编号。在某些实施方式中，a)第一单体的铰链-第一变体Fc结构域还包含pI取代 Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，并且第二单体的铰链-第二变体Fc结构域还包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D；b)第一单体的铰链-第一变体Fc结构域还包含pI取代Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K；或者c)第二单体的铰链-第二变体Fc结构域还包含pI变体 N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，其中所述编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包含半衰期延长变体 M428:/N434S。

一方面，本文提供了“中央IL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白。这样的“中央 -IL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其从N端到C端包含VH- CH1-结构域连接子-IL-15变体-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc 结构域；b)第二单体，其从N端到C端包含VH-CH1-结构域连接子-IL- 15Rα(sushi)结构域-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；并且c)第三和第四单体，其各自从N端至C端包含VL-CL。第一单体的VH和第三单体的VL形成第一人TIM-3结合结构域，并且第二单体的VH和第四单体的VL形成第二人TIM-3结合结构域。

在“中央IL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的一些实施方式中，第一变体Fc结构域第二变体Fc结构域包含以下偏斜变体组之一：S267K/L368D/K370S: S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K； L368E/K370S:S364K；T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S: S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，其中所述编号根据EU编号。在示例性实施方式中，偏斜变体组是S364K/E357Q：L368D/K370S。

在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含偏斜变体对S364K/E357Q，第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第一变体 Fc结构域包含pI取代Q295E/N384D/Q418D/N421D，其中所述编号根据EU编号。

在“中央IL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的示例性实施方式中，第一变体Fc 结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包含偏斜变体对 L368D/K370S，第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二单体的第二变体Fc结构域包含 pI取代Q295E/N384D/Q418D/N421D，其中所述编号根据EU编号。在“中央 IL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的一些实施方式中，第一和第二单体的铰链各自包含氨基酸取代C220S，其中所述编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包含半衰期延长变体M428:/N434S。

在另一方面，本文提供了“中央-scIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白。这样的“中央-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其从N端到C端包含VH-CH1-结构域连接子-IL-15Rα(sushi)结构域-结构域连接子-IL-15变体-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其从N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)第三和第四单体，其各自从N端到C端包含VL-CL。第一单体的VH和第三单体的VL形成第一人TIM-3结合结构域，并且第二单体的VH和第四单体的VL形成第二人TIM-3结合结构域。

在“中央-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白的一些实施方式中，第一变体Fc 结构域第二变体Fc结构域包含以下偏斜变体组之一：S267K/L368D/K370S: S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K； L368E/K370S:S364K；T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S: S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，根据EU编号。在示例性实施方式中，偏斜变体组是S364K/E357Q：L368D/K370S。

在一个示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包含偏斜变体 L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第一变体Fc结构域包含pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中所述编号根据EU编号。在一些实施方式中，第一单体的铰链包含氨基酸取代C220S，其中所述编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包含半衰期延长变体M428:/N434S。

在某些实施方式中，本文提供的任何异源二聚体蛋白的VH和VL是图12 和13中任何TIM-3抗原结合结构域的可变重结构域和可变结构域。在示例性的实施方式中，TIM-3抗原结合结构域是3H3_H1_L2.1。

在一些实施方式中，本文提供的异源二聚体蛋白的IL-15变体包含选自由 N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D、Q108E、N4D/N65D、 D30N/N65D和D30N/E64Q/N65D组成的组的氨基酸取代。在示例性实施方式中，IL-15变体包含氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。

在一个方面，本文提供了一种药物组合物，其包含本文公开的任何异源二聚体蛋白和药学上可接受的载体。

在另一方面，本文提供了一种治疗对其有需要的患者的方法，该方法包括向该患者施用本文公开的任何异源二聚体蛋白或药物组合物。在一些实施方式中，该方法进一步包括施用抗体，其中该抗体是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体或抗-抗TIGIT抗体。

在另一方面，本文提供了核酸组合物，其包括编码本文公开的任何异源二聚体蛋白的一个或多个核酸，包括该核酸的表达载体，包括该核酸或表达载体的宿主细胞。本文还提供了通过在合适的条件下培养宿主细胞并回收异源二聚体蛋白来制备本发明的异源二聚体蛋白的方法。

附图说明

图1描绘了靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白对表达PD-1的肿瘤反应性肿瘤浸润淋巴细胞的选择性，及其与PD-1阻断抗体的组合。

图2A-2B描绘IL-15及其受体的序列。

图3描绘了TIM-3的序列，包括人和食蟹猴(预测的)序列，用于促进抗原结合结构域的开发，所述抗原结合结构域与两者结合以便于临床开发。

图4A至4E描绘异源二聚变体组的有用对(包括偏斜和pI变体)。有些变体没有相应的“单体2”变体；这些是pI变体，可以单独用于任一单体。

图5描绘等排变体抗体恒定区和其各自的取代的列表。pI_(-)表示较低的pI 变体，而pI_(+)表示较高的pI变体。这些可以与本发明的其它异源二聚化变体 (以及如本文所概述的其它变体类型)可选且独立地组合。

图6描绘有用消除变体，其消除FcγR结合(有时被称为“敲除”或“KO”变体)。通常，在两种单体上都发现了消除变体，不过在一些情况下其可能仅在一种单体上。

图7A-7F展示本发明的靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的“非细胞因子”/“非Fv”组分的特别有用的实施方式。

图8描绘用于IL-15/Rα-Fc融合蛋白的大量示例性的可变长度连接子。在一些实施方式中，这些连接子可用于将IL-15和/或IL-15Rα(sushi)的C端连接于Fc区的N端。在一些实施方式中，这些连接子可用于将IL-15与IL- 15Rα(sushi)融合。

图9A-9C描绘许多带电荷的scFv连接子，其可用于增加或减少利用一个或多个scFv作为组分的异源二聚体抗体的pI。(+H)正连接子在本文中特别有用。根据Whitlow等Protein Engineering 6(8):989-995(1993)，具有单一电荷的单个现有技术scFv连接子被称为“Whitlow”。应注意，这种连接子用于减少scFv的聚集和增强scFv的蛋白水解稳定性。

图10展示基于人IgG1的几个有用的靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合形式主链序列，而无细胞因子序列(例如，IL-15和/或IL-15Rα(sushi))或VH，并且进一步排除图11中所描绘的轻链主链。主链1基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、C220S和具有 L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421DpI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消除变体。主链2基于人类 IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 变体、具有S364K/E357Q变体的链上的C220S和两条链上的 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消除变体。主链3基于人IgG1(356E/358M 同种异型)，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有 L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、具有S364K/E357Q变体的链上的Q196K/I199T/P217R/P228R/N276K pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消除变体。这样的主链序列可以包含在例如本文所述的“scIL-15/RαX Fab”格式异源二聚体蛋白内。).在一些实施方式中，“scIL-15/RαX Fab”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15-变体-(铰链)- CH2-CH3，其中铰链-CH2-CH3具有图10中任何主链序列的“链2”的氨基酸序列(SEQ ID NO：XXX-XXX)；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，并且CH1-铰链-CH2-CH3具有图10 中任何主链序列的链1的氨基酸序列(SEQID NO：XXX-XXX)，以及c)轻链，其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变轻结构域，并且VC在图11中具有“恒定轻链-κ”或“恒定轻链-λ”的序列(SEQ ID NO：XXX-XXX)。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和VL分别是图12和13A-C中提供的任何TIM-3ABD的可变重结构域和可变轻结构域。

在某些实施方式中，这些序列可以是356D/358L同种异型。在其它实施方式中，这些序列可包括N297A或N297S取代。在一些其它实施方式中，这些序列可包括M428L/N434SXtend突变。在另一些其它实施方式中，这些序列可以取代地基于人IgG4，并且包括两条链上的S228P(EU编号，这是Kabat中的 S241P)变体，其消除如所属领域已知的Fab臂交换。在又其它实施方式中，这些序列可以取代性基于人IgG2。此外，这些序列可以取代地利用图中描绘的其他偏斜变体、pI变体和消除变体。

如所属领域技术人员将理解并且如下所概述，这些序列可与本文概述的任何IL-15和IL-15Rα(sushi)对一起使用，包括但不限于scIL-15/Rα、ncIL-15/Rα和dsIL-15Rα，如图21中示意性描绘。此外，如所属领域技术人员将理解并且如下所概述，任何IL-15和/或IL-15Rα(sushi)变体可以并入这些主链中。此外，如所属领域技术人员将理解并且如下所概述，这些序列可与本文概述的任何 VH和VL对一起使用，包括scFv或Fab。

在这些主链的每一个内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％一致(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列(与图的“亲代”相比，如所属领域技术人员将理解，与亲代人类 IgG1(或IgG2或IgG4，这取决于主链)相比，其已含有多个氨基酸修饰)。即，除了此图的主链内所含的偏斜变体、pI变体和消除变体之外，所列举主链可以含有额外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。

图11描绘可用于本发明的靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的轻链的“非Fv”主链(即恒定轻链)。

图12描述了选择数量的抗TIM-3抗体结合结构域的可变区序列。CDR是带下划线的。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH 和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL 序列可以以scFv格式或Fab格式使用。

图13A-13C描述了可用于本发明的靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白中的其他TIM-3ABD的可变区。CDR是带下划线的。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以以scFv格式或Fab格式使用。

图14描绘展示工程化的二硫键对位置的IL-15/Rα异源二聚体的结构模型。

图15描绘示例性IL-15Rα(sushi)变体的序列，该变体在C端处以额外残基工程化，从而充当工程化的半胱氨酸残基的框架。

图16描绘为了与用半胱氨酸工程化的IL-15Rα(sushi)变体形成共价二硫键，用半胱氨酸工程化的示例性IL-15变体的序列。

图17描绘为了与用半胱氨酸工程化的IL-15变体形成共价二硫键，用半胱氨酸工程化的示例性IL-15Rα(sushi)变体的序列。

图18描绘与IL-15Rα、IL-2Rβ和共同γ链复合的IL-15的结构。展示被设计成降低效能的取代位置。

图19A-19C描绘了用于降低效力而工程化的示例性IL-15变体的序列。在这些变体IL-15序列的每一个内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％一致(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列。在一非限制性实例中，所列举的序列可以含有额外的氨基酸修饰，例如有助于形成如图16、和图17中所示的共价二硫键的氨基酸修饰。

图20描绘通过变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白NK和CD8

图21A-图21K描绘用于本发明的靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的几种格式。“scIL-15/Rα×scFv”格式(图21A)包含通过可变长度的连接子与IL-15融合的IL-15Rα(sushi)(称为“scIL-15/Rα”)，其随后与异源二聚体Fc区的N端融合，而scFv与异源二聚体Fc的另一侧融合。“scFv×ncIL-15/Rα”格式(图21B)包含与异源二聚体Fc区的N端融合的scFv，IL-15Rα(sushi)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。“scFv×dsIL- 15/Rα”格式(图21C)与“scFv×ncIL-15/Rα”格式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(sushi)和IL-15共价连接。“scIL-15/Rαx Fab”格式(图21D)包含通过可变长度的连接子与IL-15融合的IL-15Rα(sushi)(称为“scIL-15/Rα”)，其随后与异源二聚体Fc区的N端融合，可变重链(VH)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。“ncIL-15/Rα×Fab”格式(图 21E)包含与异源二聚体Fc区的N端融合的VH，IL-15Rα(sushi)与异源二聚体 Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。“dsIL-15/Rα×Fab”格式(图 21F)与“ncIL-15/Rα×Fab”格式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL- 15Rα(sushi)和IL-15共价连接。“mAb-scIL-15/Rα”格式(图21G)包含与第一和第二异源二聚体Fc的N端融合的VH，IL-15与随后与异源二聚体Fc区中的一个的C端进一步融合的IL-15Rα(sushi)融合，同时单独转染相应轻链以形成具有 VH的Fab。“mAb-ncIL-15/Rα”格式(图21H)包含与第一和第二异源二聚体Fc的 N端融合的VH，IL-15Rα(sushi)与异源二聚体Fc区中的一个的C端融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。“mAb-dsIL-15/Rα”格式(图21I)与“mAb-ncIL-15/Rα”格式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(sushi)和IL-15共价连接。“中央-IL-15/Rα”格式(图21J)包含：以重组方式与随后与异源二聚体Fc的一侧进一步融合的IL-15的N端融合的VH，和以重组方式与随后与异源二聚体Fc的另一侧进一步融合的IL-15Rα(sushi)的N端融合的VH，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。“中央-scIL-15/Rα”格式(图21K)包含与IL-15Rα(sushi)的 N端融合的VH和与异源二聚体Fc的另一侧融合的VH，所述IL-15Rα(sushi)与随后与异源二聚体Fc的一侧进一步融合的IL-15融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。

图22描述了XENP27974的序列，XENP27974是“scIL-15/RαX Fab”格式的示例性靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白。CDR用粗体显示。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-15和IL-15Rα(sushi)加下划线，连接子加双下划线(不过如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子、可变区与恒定/Fc区之间的边界。

图23描绘了XENP26842的序列，其是具有消除变体 (E233P/L234V/L235A/G236del/S267K的二价抗PD-1mAb，“IgG1_PVA_/S267k”)。CDR是带下划线的。如本文中所指出并且对本文中含有 CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR 位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的V

图24A-24B描绘了在第一剂量的所示测试物后第A)6和B)10天的PBMC 移植的NSG小鼠全血中的CD8

图25A-25B描绘了在第一剂量的所示测试物后第A)6和B)10天的PBMC 移植的NSG小鼠全血中的CD4

图26A-26B描绘了在第一剂指定剂量的测试物接种后第A)6和B)10天植入PBMC的NSG小鼠全血中CD45

图27A-27B描绘了在第一剂指定剂量的试验物品注射后第A)6和B)10天， PBMC移植的NSG小鼠全血中CD16

图28描述了用指定的测试物给药后，PBMC移植的NSG小鼠的体重变化 (相对于初始体重的百分比)。

图29描述了两个Fc结构域中包括M428L/N434S变体的XENP27979的序列。

图30描绘了以靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白(和对照)诱导A)CD8+ T 细胞和B)CD4+ T细胞的增殖，以增殖细胞百分比表示(根据CFSE稀释度确定)。数据显示，与未靶向的IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-Fc融合蛋白(以及对照靶向 RSV的IL-15/Rα-Fc融合蛋白)相比，以靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白在诱导CD8+T和CD4+T细胞增殖方面更有效。

图31描述靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白(和对照)对A)CD8记忆T细胞和B)CD8天然T细胞增殖的诱导，以增殖细胞百分比表示(根据CFSE稀释度确定)。数据显示，与未靶向的IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-Fc融合蛋白(以及对照靶向RSV的IL-15/Rα-Fc融合蛋白)相比，靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白在诱导CD8记忆T细胞增殖方面更为有效。值得注意的是，与CD8天然T细胞相比，靶向TIM-3-的IL-15/Rα-Fc融合蛋白在诱导CD8记忆T细胞增殖方面也更有效。

图32描述了如细胞计数所示，通过靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白 (和对照)诱导A)CD8记忆T细胞和B)CD8天然T细胞增殖。

图33描述了靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白(和对照)诱导A)CD4记忆 T细胞和B)CD4天然T细胞增殖，以增殖细胞百分比表示(根据CFSE稀释度确定)。数据显示，与未靶向的IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-Fc融合蛋白(以及对照靶向RSV的IL-15/Rα-Fc融合蛋白)相比，靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白在诱导CD8记忆T细胞增殖方面更为有效。值得注意的是，与CD4天然 T细胞相比，靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白在诱导CD4记忆T细胞增殖方面也更有效。

图34描述了如细胞计数所示，通过靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白 (和对照)诱导A)CD8记忆T细胞和B)CD8天然T细胞增殖。

图35描绘了通过靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合(和对照)诱导NK细胞增殖，如A)增殖细胞百分比(基于CFSE稀释度确定)和B)通过细胞计数所示。数据显示，与未靶向的IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-Fc融合蛋白(以及对照靶向 RSV的IL-15/Rα-Fc融合蛋白)相比，靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白在诱导NK细胞增殖方面更有效得多。

图36描绘了在与靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合(和对照)孵育后活化的 CD8

图37描绘了与靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合(和对照)孵育后，CD8+T细胞的激活，如A)CD8记忆T细胞上的HLA-DR MFI，B)表达HLA-DR的CD8 记忆T细胞的百分比，C)CD8天然T细胞上的HLA-DR MFI和D)表达HLA- DR的CD8天然T细胞百分比。

图38描绘了与靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合(和对照)孵育后，CD4+ T细胞的激活，如A)CD4记忆T细胞上的HLA-DR MFI，B)表达HLA-DR的CD4 记忆T细胞的百分比，C)CD4天然T细胞上的HLA-DR MFI和D)表达HLA- DR的CD4天然T细胞百分比。

图39描绘了XENP22853的序列，XENP22853是包含野生型IL-15和 Xtend Fc(M428L/N434S)变体的IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白。IL-15和IL- 15Rα(sushi)加下划线，连接子加双下划线(不过如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图中)，并且斜线(/)表示IL-15、 IL-15Rα、连接子与恒定/Fc区之间的边界。

图40描述了XENP24113的序列，XENP24113是包含IL-15(N4D/N65D)变体和XtendFc(M428L/N434S)变体的IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白。IL-15和IL- 15Rα(sushi)加下划线，连接子加双下划线(不过如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图中)，并且斜线(/)表示IL-15、 IL-15Rα、连接子与恒定/Fc区之间的边界。

图41描述了XENP24294的序列，XENP24294是包含IL-15(N4D/N65D)变体和XtendFc(M428L/N434S)取代的scIL-15/Rα-Fc融合蛋白。IL-15和IL- 15Rα(sushi)加下划线，连接子加双下划线(不过如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图中)，并且斜线(/)表示IL-15、 IL-15Rα、连接子与恒定/Fc区之间的边界。

图42描绘了XENP24306的序列，XENP24306是包含IL- 15(D30N/E64Q/N65D)变体和Xtend Fc(M428L/N434S)取代的IL-15/Rα-杂Fc融合蛋白。IL-15和IL-15Rα(sushi)加下划线，连接子加双下划线(不过如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与恒定/Fc区之间的边界。

图43描绘了以指示的相对浓度进行第一剂之后食蟹猴中指示的测试物随时间的血清浓度。

图44A-44C描绘了包含另外的IL-15功效变体的示例性scIL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(sushi)加下划线，连接子加双下划线(不过如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子、可变区与恒定/Fc区之间的边界。

图45A-G示出将PBMC与所示测试物孵育3天后，A)CD4+CD45RA-， B)CD4+CD45RA+，C)CD8+CD45RA-，d)CD8+CD45RA+，E)CD16+NK细胞， F)CD56+NK细胞，和G)表达Ki67的γδ细胞的百分比。

图46描绘了包含IL-15(D30N/N65D)变体的示例性靶向TIM-3的IL-15/Rα- Fc融合蛋白的序列。CDR用粗体显示。如本文中所指出并且对本文中含有 CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR 位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-15和IL- 15Rα(sushi)加下划线，连接子加双下划线(不过如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示 IL-15、IL-15Rα、连接子、可变区与恒定/Fc区之间的边界。

图47描绘了包含IL-15(D30N/N65D)变体的示例性靶向TIM-3的IL-15/Rα- Fc融合蛋白的序列。CDR用粗体显示。如本文中所指出并且对本文中含有 CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR 位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-15和IL- 15Rα(sushi)加下划线，连接子加双下划线(不过如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示 IL-15、IL-15Rα、连接子、可变区与恒定/Fc区之间的边界。

图48A和图48B描述了包含Xtend(M428L/N434S)取代以延长血清半衰期的示例性靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。CDR用粗体显示。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-15和IL-15Rα(sushi)加下划线，连接子加双下划线(不过如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子、可变区与恒定/Fc区之间的边界。应当注意，本文描述的任何序列可以包括或排除M428L/N434S取代。

图49A-49C描绘了对照靶向RSV的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的XENP26007， XENP29481和XENP30432的序列。CDR是带下划线的。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。 IL-15和IL-15Rα(sushi)加下划线，连接子加双下划线(不过如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子、可变区与恒定/Fc区之间的边界。

具体实施方式

I.定义

为了能更全面地了解本申请，下文阐述几种定义。这类定义意味着涵盖语法等效物。

本文中的“消除”意指减小或去除活性。因此，例如，“消除FcγR结合”意指 Fc区氨基酸变体与不含有特异性变体的Fc区相比具有少于50％的起始结合，优选少于70％-80％-90％-95％-98％的活性损失，并且通常所述活性低于Biacore 测试中可检测结合的水平。FcγR结合的消除中的特定用途是图6所示的特定用途。然而，除非另有说明，否则本发明的Fc单体保持与FcRn受体的结合。

如本文使用的“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”是指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞的裂解。ADCC与FcγRIIIa的结合相关；与FcγRIIIa的结合增加导致ADCC活性增加。如本文所论述，本发明的许多实施例完全消除ADCC 活性。

本文所用的“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用是指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，并随后引起靶细胞的吞噬作用。

“抗原结合结构域”或“ABD”在本文中意味着六个互补决定区 (ComplementaryDetermining Region，CDR)的组，当作为多肽序列的一部分存在时，特异性结合如本文所讨论的靶抗原。因此，“TIM-3抗原结合结构域”结合本文概述的人TIM-3抗原。如本领域中已知，这些CDR通常作为可变重 CDR(vhCDR或V

本文的“修饰”意味着多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或与蛋白化学连接的部分的改变。举例来说，修饰可以是连接到蛋白的改变的碳水化合物或PEG结构。本文的“氨基酸修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另外指出，否则氨基酸修饰始终是由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。

本文的“氨基酸取代”或“取代”是指用不同的氨基酸替换亲代多肽序列中特定位置的氨基酸。特定言之，在一些实施例中，取代为不在特定位置天然存在的氨基酸，亦即不在有机体内天然存在或不在任何有机体中天然存在的氨基酸。例如，取代E272Y是指在位置272处的谷氨酸被酪氨酸替换的变体多肽，在这种情况下是Fc变体。为了清楚起见，已经过工程改造以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)换成CGA(仍然编码精氨酸)来提高宿主生物体表达水平)的蛋白不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管创建了编码相同蛋白的新基因，但是如果蛋白在其起始的特定位置具有相同的氨基酸，那么它就不是氨基酸取代。

本文所用的“氨基酸插入”或“插入”是指在亲代多肽序列的特定位置添加氨基酸序列。举例来说，-233E或233E表示在位置233之后和位置234之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE表示在位置233之后和位置234之前插入AlaAspGlu。

如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲代多肽序列中在特定位置处去除氨基酸序列。例如，E233-或E233#，E233()或E233del表示在位置233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示从位置233开始的序列 GluAspAla的缺失。

如本文所用的“变体蛋白”或“蛋白变体”或“变体”意味着通过至少一个氨基酸修饰而不同于亲代蛋白的蛋白。蛋白变体可以指代蛋白本身、包括所述蛋白的组合物或编码所述蛋白的氨基酸序列。优选地，蛋白变体与亲代蛋白相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲代相比，具有约1个至约70个氨基酸修饰，优选约1个至约5个氨基酸修饰。如下文所描述的，在一些实施方式中，亲代多肽(例如，Fc亲代多肽)是人野生型序列，如来自人IgG1、IgG2、IgG3或 IgG4的Fc区。本文的蛋白变体序列将优选与亲代蛋白序列具有至少约80％的同一性，并且最优选至少约90％的同一性，更优选至少约95-98-99％的同一性。变体蛋白可以指代变体蛋白本身、包括蛋白变体的组合物或编码所述蛋白变体的DNA序列。

因此，本文所用的“Fc变体”或“变体Fc”是指包含Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白。本发明的Fc变体是根据构成其的氨基酸修饰来定义。因此，举例来说，N434S或434S是相对于亲代Fc多肽在位置434处具有丝氨酸取代的Fc 变体，其中编号是根据EU编号。同样，M428L/N434S定义了相对于亲代Fc 多肽具有取代M428L和N434S的Fc变体。WT氨基酸的同一性可能未指明，在此情况下，上述变体被称为428L/434S。应注意，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如，428L/434S是与M428L/N434S相同的Fc变体等。关于本发明中所讨论的与抗体有关的所有位置，除非另外指出，否则氨基酸位置编号根据EU编号。EU编号或如Kabat或EU编号方案中的EU编号是指EU抗体的编号(Edelman等，1969、Proc Natl Acad SciUSA 63:78-85，在此通过引用整体并入)。修饰可以是添加、缺失或取代。取代可以包含天然存在的氨基酸，以及在一些情况下合成氨基酸。实例包括美国专利第6,586,207号；WO 98/48032； WO 03/073238；US2004-0214988A1；WO 05/35727A2；WO 05/74524A2；J.W. Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J. W.Chin和P.G.Schultz、(2002)，ChemBioChem 11:1135-1137；J.W.Chin等人， (2002)，PICAS UnitedStates of America 99:11020-11024；和L.Wang和P.G. Schultz，(2002)、Chem.1-10，所有所述文献以引用的方式整体并入本文中。

如本文所使用的，本文的“蛋白”意指至少两个共价连接的氨基酸，包含蛋白、多肽、寡肽和肽。

如本文所用，“残基”意味着蛋白中的位置和其相关的氨基酸身份标识。举例来说，天冬酰胺297(也称为Asn297或N297)是人类抗体IgG1中位置297处的残基。

本文所用的“Fab”或“Fab区”是指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以单独指代该区域，或者在全长抗体、抗体片段或Fab融合蛋白的背景下指代该区域。

本文所用的“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”是指包含单一抗体的VL和VH结构域的多肽。如本领域技术人员所理解的，这些通常由两条链组成，或者可以组合(通常与本文所述的连接子)以形成scFv。

本文的“单链Fv”或“scFv”意味着通常使用如本文所讨论的scFv连接子将可变重结构域共价连接到可变轻结构域，以形成scFv或scFv结构域。scFv结构域由N端至C端可呈任一定向(VH-连接子-VL或VL-连接子-VH)。

如本文所用，“IgG子类修饰”或“同型修饰”意指将IgG同型的一个氨基酸转化成不同比对的IgG同型中的对应的氨基酸的氨基酸修饰。举例来说，因为在EU位置296处IgG1包含酪氨酸且IgG2包含苯丙氨酸，所以IgG2中的 F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。

如本文所用的“非天然存在的修饰”意指不是同型的氨基酸修饰。例如，因为IgG均不包括位置434处的丝氨酸，所以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其杂交体)的取代434S被视为非天然存在的修饰。

如本文所使用的，“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指由DNA和RNA编码的 20个天然存在的氨基酸之一。

如本文所用，“效应功能”意味着由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用产生的生物化学事件。效应子功能包含但不限于ADCC、ADCP和CDC。

如本文所使用的，“Fcγ受体”或“FcγR(FcgammaR)”意指结合IgG抗体Fc区并由FcγR基因编码的蛋白家族的任何成员。在人中，这个家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb- 2)和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和 F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等、 2002、Immunol Lett 82:57-65，其以引用的方式整体并入本文中)，以及任何未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。

如本文所用，“FcRn”或“新生Fc受体”意指结合IgG抗体Fc区且至少部分地由FcRn基因编码的蛋白。如所属领域中已知，功能性FcRn蛋白包括两个多肽，通常称为重链和轻链。轻链是β-2微球蛋白且重链由FcRn基因编码。除非本文另有说明，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。多种FcRn变体可用于增加与FcRn受体的结合，并且在一些情况下用于增加血清半衰期。通常，除非另有说明，否则本发明的Fc单体保持与FcRn受体的结合(并且如下所述，可包括氨基酸变体以增加与FcRn受体的结合)。

本文所用的“亲代多肽”是指随后经过修饰以产生变体的起始多肽。亲代多肽可以是天然存在的多肽或者天然存在的多肽的变体或工程化版本。亲代多肽可以指代多肽本身、包括所述亲代多肽的组合物或编码所述亲代多肽的氨基酸序列。

本文使用的“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”是指包含抗体恒定区(不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如CH1))的多肽，并且在一些情况下是铰链的一部分。对于IgG来说，Fc结构域包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3(Cγ2和Cγ3)以及位于CH1(Cγ1)与CH2(Cγ2)之间的较低铰链区。因此，在某些情况下，Fc结构域包括从N端到C端的CH2-CH3和铰链-CH2-CH3。在一些实施方式中，Fc 结构域是来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域，其中IgG1铰链-CH2- CH3和IgG4铰链-CH2-CH3在许多实施方式中具有特定用途。另外，在某些实施方式中，其中Fc结构域是人IgG1 Fc结构域，铰链包含C220S氨基酸取代。此外，在其中Fc结构域是人IgG4 Fc结构域的某些代谢物中，铰链包含S228P 氨基酸取代。虽然Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常被定义成在其羧基端包含残基C226或P230，其中根据如Kabat中的EU编号进行编号。因此，IgG情形下的“CH”结构域如下：“CH1”根据如Kabat中的EU编号是指位置118-215。“铰链”是指根据如Kabat中的EU编号的位置216-230。“CH2”根据如Kabat中的EU编号是指位置231-340，并且“CH3”根据如Kabat中的EU 编号是指位置341-447。因此，“Fc结构域”包含-CH2-CH3结构域，和可选地铰链结构域(铰链-CH2-CH3)。

如所属领域技术人员将理解，重链恒定区域的确切编号和放置在不同编号系统之间可以不同。根据EU和Kabat编号的重链恒定区的有用比较如下，参见Edelman等，1969，Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85和Kabat等、1991， Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，美国公共卫生服务部 (United States Public HealthService)，美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)，贝塞斯达(Bethesda)，其以引用的方式整体并入本文中。

表1

在本文的实施方式中，当scFv或IL-15复合物连接至Fc结构域时，其是 scFv、IL-15或IL-15Rα构建体的C端经由结构域连接子(例如，如图8所示的铰链区域)连接至Fc结构域。在一些实施方式中，如下文更充分描述，对Fc区进行氨基酸修饰，例如改变与一个或多个FcγR受体或与FcRn受体的结合，并且实现如本文所概述的异源二聚体形成和纯化。

“重链恒定区”在本文中意味着抗体的CH1-铰链-CH2-CH3部分。

本文中的“Fc融合蛋白”或“免疫粘附素”是指包含Fc区的蛋白，通常与不同的蛋白连接(可选通过如本文所述的连接子部分)，例如与如本文所述的IL-15和 /或IL-15R连接。在一些例子中，两个Fc融合蛋白可以形成同源二聚体Fc融合蛋白或异源二聚体Fc融合蛋白，后者是优选。在一些情况下，异源二聚体 Fc融合蛋白的一种单体包含单独的Fc结构域(例如，空Fc结构域)，并且另一种单体是Fc融合，其包含变体Fc结构域和蛋白结构域，例如受体、配体或其它结合搭配物。

如本文所用，“位置”意指蛋白序列中的位置。位置可以顺序编号，或根据确定的形式(例如用于抗体编号的EU编号)编号。

本发明的异源二聚体抗体的单体背景中的“链性(strandedness)”是指，与“匹配”的两条DNA链相似，将异二聚化变体掺入每种单体中以保持“匹配”以形成异源二聚体的能力。例如，如果将一些pI变体工程化为单体A(例如使pI更高)，则还可以利用的“电荷对”的空间变体不会干扰pI变体，例如将使pI更高的电荷变体放在相同的“链”或“单体”上以保持两种功能。类似地，对于如下面更全面概述的组中成对出现的“偏斜”变体，所属领域技术人员在决定将进入合并一组对的哪一条链或单体时将考虑pI，使得也使用偏斜的pI使pI分离最大化。

本文使用的“靶细胞”是指表达靶抗原(本情况中是TIM-3)的细胞。

如本文所用的“可变区”意指免疫球蛋白的区域，其包含一个或多个基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因座的Vκ、Vλ和/或VH基因中的任一种编码的Ig结构域。

“野生型或WT”在本文中意指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变体。WT蛋白具有未经过有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。

本发明的靶向TIM-3的异源二聚体蛋白通常是分离的或重组的。当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”是指多肽已经从表达其的细胞或细胞培养物中鉴定和分离和/或回收。通常，通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。“分离的蛋白”是指基本上不含具有不同结合特异性的其他蛋白的蛋白。“重组”是指使用重组核酸技术在外源宿主细胞中产生蛋白。

相对于蛋白序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和如果需要引入缺口以实现最大百分比序列同一性并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中氨基酸残基与特定(亲代)序列中的氨基酸残基相同的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域的技术内的各种方式实现，例如使用可开获得的计算机软件，如BLAST、 BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在进行比较的序列的全长内实现最大比对所需的任何算法。一个特定的程序是在美国公布号20160244525的第[0279]至[0280]段中描述的ALIGN-2程序，该专利在此通过引用并入。

本发明的氨基酸序列(“发明序列”)与亲代氨基酸序列之间的同一性程度计算为两个序列比对中的精确匹配数除以“发明序列”的长度或亲代序列的长度，以最短者为准。结果以同一性百分比表示。

在一些实施方式中，两个或更多个氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、 80％或90％的同一性。在一些实施方式中，两个或更多个氨基酸序列具有至少 95％、97％、98％、99％或甚至100％同一性。

“特异性结合”或“特异性结合于”特定抗原或表位(在此情况下为人TIM-3)，或对特定抗原或表位(在此情况下为人TIM-3)“具有特异性”意指与非特异性相互作用可测量地不同的结合。特异性结合可以例如通过与对照分子的结合相比确定分子的结合来测量，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。举例而言，特异性结合可藉由与类似于目标的对照分子竞争来确定。

特定抗原或表位的特异性结合可以通过例如抗体来展现，所述抗体针对抗原或表位的KD为至少约10

另外，可以例如通过抗体对抗原或表位的KA或Ka对于表位相对于对照大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍来展现对特定抗原或表位的特异性结合，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率。通常使用Biacore测定法测量结合亲和力。

II.引言

本发明提供异源二聚体融合蛋白，其一侧包含IL-15复合物，而另一侧包含抗人TIM-3抗原结合结构域。因此，本发明的异源二聚体融合蛋白可以与检查点抑制剂TIM-3抗原结合并且可以与共同的γ链(γc；CD132)和/或IL-2受体β-链(IL-2Rβ；CD122)复合。通常，本发明的异源二聚体融合蛋白具有三种功能组分：IL-15/IL-15Rα(sushi)组分，本文通常称为“IL-15复合物”；抗TIM-3ABD 组分，其通过将融合蛋白带入表达TIM-3的细胞来充当“靶向”部分；和Fc组分，其中每一种可以采用不同的形式，并且每种形式可以以任何构型与其他组分组合。

通常，如本文更充分描述的，本发明的融合蛋白是基于抗体Fc结构域的缔合的异源二聚体蛋白。也就是说，通过使用已被改造成比同源二聚体更倾向于形成异源二聚体的两个不同的变异Fc结构域，形成了异源二聚体蛋白。在这种情况下，变体Fc结构域中的一个与IL-15/RA复合物融合，而另一个具有如本文更全面概述的TIM-3ABD。通过包括可选的pI变体，可以更容易地从同源二聚体中纯化异源二聚体。另外，包括消除变体消除了Fc结构域的效应子功能。

A.IL-15/IL-15Rα(sushi)结构域

如图所示，IL-15复合物可以采用几种形式。如上所述，IL-15蛋白本身不如与IL-15Rα蛋白复合时稳定。如本领域所知，IL-15Rα蛋白含有“sushi结构域”，它是保留IL-15结合活性的受体的最短区域。因此，尽管可以制备包含整个IL-15Rα蛋白的异源二聚体融合蛋白，但本文的优选实施方式包括仅使用 IL-15Rα(sushi)结构域的复合物，其序列示于图中。

因此，IL-15复合物通常包含IL-15蛋白和IL IL-15Rα的IL-15Rα(sushi)结构域(除非另有说明，否则使用全长序列，“IL-15Rα”、“IL-15Rα(sushi)”和“sushi”在整个过程中可互换使用)。

重要的是，IL-15成分通常经过工程设计以降低其效力。在许多实施方式中，野生型IL-15过于有效并且可以引起不希望的毒性。因此，IL-15复合物的 IL-15组分可具有一个或多个氨基酸取代，导致活性降低。进行了各种氨基酸取代(请参见图19)并经过测试(请参见图20)。在一些实施方式中，特别感兴趣的是双重变体N4D/N65D或D30N/N65D，或三重变体D30N/E64Q/N65D。

本发明的靶向IL-15/IL-15Rα异源二聚体融合蛋白包括IL-15/IL-15受体α(IL-15Rα)-Fc融合单体；参见2017年10月16日提交的US2018/0118828、 2016年10月14日提交的美国系列号62/408,655、2016年1011月1日提交的美国系列号62/416,087，2017年1月6日提交的美国系列号62/443,465、2017 年3月28日提交的美国系列号62/477,926和2018年4月18日提交的美国系列号62/659,571，其全部内容通过引用并入本文，特别是其中概述的序列。在一些情况下，IL-15和IL-15受体α(IL-15Rα)蛋白结构域处于不同的方向。IL- 15/IL-15Rα-Fc融合单体的示例性实施方式提供于例如US2018/0118828所述的 XENP21480(链1；图64A)，XENP22022(链1，图64D)，XENP22112，(链1和3；图64E)，XENP22641(链2和4；图64F)，XENP22642(链1和4；图64H)和 XENP22644(链1和4；图64I)中。

1.IL-15变体

在一些实施方式中，人IL-15蛋白具有图2所示的NCBI参考序列第 NP_000576.1号所示的氨基酸序列。在一些情况下，人类IL-15的编码序列阐述于NCBI参考序列第NM_000585号中。本文概述的Fc融合异源二聚体蛋白的例示性IL-15蛋白可具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或SEQ ID NO:1的氨基酸49-162。在一些实施方式中，IL-15蛋白具有与SEQ IDNO:2至少90％、例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方式中，IL-15蛋白具有SEQ ID NO:2中所阐述的氨基酸序列，不同之处在于氨基酸取代N72D。在其它实施方式中，IL-15蛋白具有 SEQ ID NO:2的氨基酸序列，不同之处在于一个或多个选自由C42S、L45C、 Q48C、V49C、L52C、E53C、E87C和E89C组成的组的氨基酸取代。在一些方面，IL15蛋白具有一个或多个选自由N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D和Q108E组成的组的氨基酸取代。在其他实施方式中，氨基酸取代是N4D/N65D。在一些实施方式中，氨基酸取代是Q108E。在某些实施方式中，氨基酸取代是N65D。在其他实施方式中，氨基酸取代是 D30N/E64Q/N65D。在某些实施方式中，氨基酸取代是N65D。在一些情况下，氨基酸取代是N1D/N65D。在一些情况下，氨基酸取代是D30N/N65D。可选地， IL-15蛋白还具有N72D取代。Fc融合蛋白的IL-15蛋白可具有1、2、3、4、5、 6、7、8或9个氨基酸取代。在一些实施方式中，Fc融合蛋白的IL-15蛋白包含D30N取代。在一些实施方式中，Fc融合蛋白的IL-15蛋白包含N65D取代。在一些实施方式中，Fc融合蛋白的IL-15蛋白在IL-15：CD132界面上包含一个或多个氨基酸取代。在某些实施方式中，本文所述的Fc融合蛋白诱导NK细胞和CD8+ T细胞的增殖。

在一些实施方式中，人IL-15受体α(IL-15Rα)蛋白具有NCBI参考序列第 NP_002180.1号或SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列。在一些情况下，人IL- 15Rα的编码序列阐述于NCBI参考序列第NM_002189.3号中。本文概述的Fc 融合异源二聚体蛋白的示例性IL-15Rα蛋白可包含SEQ ID NO:3的IL- 15Rα(sushi)结构域(例如，SEQ ID NO:3的氨基酸31-95，或换句话说、SEQ ID NO:4的氨基酸序列)或由其组成。在一些实施例中，IL-15Rα蛋白具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列和选自由以下组成的群组的氨基酸插入：D96、P97、A98、D96/P97、D96/C97、D96/P97/A98、D96/P97/C98和D96/C97/A98，其中氨基酸位置是相对于全长人类IL-15Rα蛋白或SEQ ID NO:3。举例来说，可以将例如 D(例如Asp)、P(例如Pro)、A(例如Ala)、DP(例如Asp-Pro)、DC(例如Asp- Cys)、DPA(例如Asp-Pro-Ala)、DPC(例如Asp-Pro-Cys)或DCA(例如Asp-Cys- Ala)的氨基酸添加到SEQ ID NO:4的IL-15Rα蛋白的C端。在一些实施例中， IL-15Rα蛋白具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列和一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：K34C、A37C、G38C、S40C和L42C，其中氨基酸位置是相对于SEQ ID NO:4。IL-15Rα蛋白可具有1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个氨基酸突变(例如，取代、插入和/或缺失)。

2.IL-15/RA复合物

如本文所述，IL-15变体和sushi结构域可以以至少三种不同的方式复合。

在一些实施方式中，如在图21B中所示，IL-15蛋白和IL-15Rα(sushi)不共价连接，而是通过规律的配体-配体相互作用自组装。如本文更全面描述的，它可以是与Fc结构域共价连接的IL-15结构域或sushi结构域(通常使用可选的结构域连接子)。再次，在该实施方式中特别有用的是与野生型IL-15Rα(sushi)结构域一起使用的双重变体N4D/N65D或D30N/N65D，或三重变体 D30N/E64Q/N65D。

在取代实施方式中，可以使用结构域连接子将变体IL-15复合至(sushi)结构域，使得它们能够如一般在图21D中所示共价连接；该图将IL-15Rα(sushi) 结构域描绘为N端结构域，不过这可逆。再次，在该实施方式中特别有用的是与野生型(sushi)结构域一起使用的双重变体N4D/N65D或D30N/N65D，或三重变体D30N/E64Q/N65D。

作为另选，IL-15和(sushi)结构域中的每一个都可以被设计成含有半胱氨酸氨基酸，其形成二硫键以形成如图21C中所示的复合物，同样IL-15结构域或(sushi)结构域(使用可选的结构域连接子)与Fc结构域共价连接。同样，在该实施方式中特别有用的是双变体N4D/N65D或D30N/N65D(另外包括半胱氨酸的氨基酸取代)，或三重变体D30N/E64Q/N65D(另外包括氨基酸的半胱氨酸取代)，与(sushi)结构域一起使用，该结构域还包含氨基酸取代以提供半胱氨酸。

下面概述了其他特定实施方式。

B.抗TIM-3成分

在一些实施方式中，本文提供的异源二聚体融合蛋白包括一些抗体组分。

传统抗体结构单位通常包括四聚体。每种四聚体典型地由相同的两对多肽链组成，每对具有一条“轻链”(典型地具有约25kDa的分子量)和一条“重链”(典型地具有约50-70kDa的分子量)。人类轻链被分类为κ和λ轻链。本发明涉及通常基于IgG类的抗体或抗体片段(抗体单体)，其具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通常，IgG1、IgG2和IgG4比IgG3更频繁地使用。应该注意，IgG1具有不同的同种异型，其在356(D或E)和358(L或M)处具有多态性。本文中所描绘的序列使用356D/358M同种异型，然而本文包括其它同种异型。也就是说，本文包括的包括IgG1 Fc结构域的任何序列可以具有取代356D/358M同种异型的356E/358L。

另外，本文的许多单体序列在位置220处的至少一个半胱氨酸被丝氨酸代替，以减少二硫键的形成。特别包含在本文的序列内的是这些取代的半胱氨酸 (C220S)中的一个或两个。

因此，如本文所用，“同型”意指根据其恒定区的化学和抗原特征界定的免疫球蛋白的任一子类。

每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100到110个或更多个氨基酸的可变区，在本领域和本文中通常称为“Fv结构域”或“Fv区”。在可变区中，重链和轻链的每个V结构域聚集三个环以形成抗原结合位点。每个环被称为互补决定区(下文中称为“CDR”)，其中氨基酸序列的变化是最显著的。“可变”是指可变区的某些区段在抗体之间序列差异很大的事实。可变区内的可变性不是均匀分布的。相反，V区由通过称为“高变区”的极端可变性的较短区分隔开的称为框架区(FR)的15-30个氨基酸的相对不变的区段组成，所述高变区各自9- 15个氨基酸长或更长。

每个VH和VL由三个高变区(“互补决定区”，“CDR”)和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

高变区通常包含：来自轻链可变区中约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)，以及重链可变区中约31- 35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)的氨基酸残基； Kabat等、SEQUENCES OF PROTEINS OFIMMUNOLOGICAL INTEREST、第 5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md(1991)和/ 或那些形成高变环的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50- 52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的26-32(HCDR1)、53- 55(HCDR2)和96-101(HCDR3)；(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。下面描述本发明的特定CDR。

如所属领域的技术人员将了解，CDR的精确编号和布置在不同系统中可以不同。然而，应理解，可变重和/或可变轻序列的公开包含相关(固有)CDR的公开。因此，每个重可变区的公开内容是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和 vhCDR3)的公开内容，并且每个轻可变区的公开内容是vlCDR(例如vlCDR1、 vlCDR2和vlCDR3)的公开内容。

CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等、Dev.Comp.Immunol. 27(1):55-77(2003):

表2

在整个本说明书中，当提及可变结构域(大致是轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)中的残基时，通常使用Kabat编号系统以及用于Fc区的EU编号系统(例如Kabat等人，见上文(1991))。

本发明提供了大量不同的CDR组。在这种情况下，“完整CDR组”包含三个可变轻链和三个可变重链CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、 vhCDR2和vhCDR3。这些可以分别是较大可变轻结构域或可变重结构域的一部分。另外，如本文中更全面地概述，当使用重链和轻链时(例如当使用Fab 时)，可变重结构域和可变轻结构域可以位于单独的多肽链上，或在scFv序列的情况下位于单个多肽链上。

CDR有助于抗体的抗原结合位点，或更具体地说，表位结合位点的形成。“表位”是指与抗体分子可变区中的特定抗原结合位点(称为互补位)相互作用的决定子。表位是如氨基酸或糖侧链的分子的聚组，且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个抗原可以具有超过一个表位。

表位可以包含直接涉及结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和未直接涉及结合的其它氨基酸残基，如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换而言之，氨基酸残基位于特异性抗原结合肽的覆盖区范围内。

表位可以是构形的也可以是线性的。构形表位是由来自线性多肽链的不同区段的氨基酸空间并置而产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构形和非构形表位的区别可以在于在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。

表位典型地包括呈独特空间构象的至少3个且更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫分析中验证，展示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力，例如“装箱”。如下文所概述，本发明不仅包括本文所列举的抗原结合结构域和抗体，还包括竞争与所列举的抗原结合结构域结合的表位结合的抗原结合结构域和抗体。

每条链的羧基端部分限定主要负责效应功能的恒定区。Kabat等人收集重链和轻链可变区的许多一级序列。基于序列的保守度，其将单个一级序列分类为CDR和框架并且列出其列表(参见，SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST、第5版、NIH出版，第91-3242号、E.A.Kabat等人，其以引用的方式整体并入本文中)。

在免疫球蛋白的IgG亚类中，重链中存在数个免疫球蛋白结构域。“免疫球蛋白(Ig)结构域”在本文中意指具有不同三级结构的免疫球蛋白区域。本发明相关的是重链结构域，包括重链恒定(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的情况下，IgG同型各自具有三个CH区。因此，在IgG的上下文中，“CH”结构域如下：“CH1”是指根据如Kabat中的EU编号的位置118-220。“CH2”根据如 Kabat中的EU编号是指位置237-340，并且“CH3”根据如Kabat中的EU编号是指位置341-447。如本文所示和下文所述，pI变体可以在一个或多个CH区以及铰链区中，在下面讨论。

重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”在本文中意味着包含抗体的第一与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置220处终止，并且IgG CH2结构域在残基EU位置237处开始。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中定义为包括位置221(IgG1中的D221)到236(IgG1中的G236)，其中编号是根据如Kabat中的EU编号。在一些实施方式中，例如在Fc区的背景下，包括下铰链，“下铰链”通常指的是位置226或230。如本文所述，pI变体也可以在铰链区中制备。

轻链通常包含两个结构域，即可变轻链结构域(含有轻链CDR并与可变重链结构域一起形成Fv区)和轻链恒定区(通常称为CL或Cκ)。

所关注的用于如本文所概述的另外取代的另一区是Fc区。

因此，本文提供的本发明的异源二聚体融合蛋白包括一个或多个抗体结构域。如本文所述以及所属领域中已知，本文提供的异源二聚体抗体包括重链和轻链内的不同结构域，其也可以重叠。这些结构域包括但不限于Fc结构域、 CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域、重链恒定结构域(CH1- 铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3)、可变重链结构域、可变轻链结构域、轻链恒定结构域、FAb结构域和scFv结构域。

如本文一般概述的，本发明的异源二聚体蛋白包括一个或多个结合人TIM- 3的Fv。“甲型肝炎病毒细胞受体2”、“HAVCR2”、“含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3”、“TIM-3”、“TIM3”、“CD366”(例如，Genebank登录号 NM_032782和NP_116171(人))是指属于TIM家族细胞表面受体蛋白的免疫检查点。TIM-3与PD-1和LAG-3一起介导CD8+ T细胞的耗竭。TIM-3表达在肺癌、胃癌、头颈癌、神经鞘瘤、黑色素瘤和滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤的肿瘤浸润淋巴细胞中表达上调，并在癌症中可能与功能障碍性CD8+和Tregs中的PD-1途径相互作用。TIM-3的示例序列如图3所示。

所述Fv或所述主题的异源二聚体融合蛋白的抗TIM-3组分(抗TIM-3抗原结合结构域或TIM-3ABD)通常是一组6个CDR和/或可变重结构域和可变轻结构域，其形成可结合人TIM-3的Fv结构域。如本文所述，通常可以通过使用本文概述的scFv或Fab来使用多种不同的格式。

在某些实施方式中，本发明的ABD包含具有来自特定种系重链免疫球蛋白基因的框架的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，此类ABD可包含人ABD或由人ABD组成，所述人ABD包含作为特定种系序列的“产物”或“衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区。通过比较ABD的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择序列与ABD序列最接近(即，最大％同一性)的人种系免疫球蛋白序列，可以鉴定ABD是人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生自”人种系免疫球蛋白序列。由于例如CDR，天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变，作为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生自”人种系免疫球蛋白序列的ABD与种系序列相比可含有氨基酸差异。然而，人源化ABD的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列通常至少90％相同，并且与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比时，含有将ABD鉴定为衍生自人序列的氨基酸残基。在某些情况下，人源化ABD的氨基酸序列与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以至少95、96、97、98或99％或甚至至少96％、97％、98％或99％一致。典型地，来源于特定人生殖系序列的人源化ABD相比于由人生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列将显示不超过10-20个氨基酸差异(在引入本文的任何偏斜、pI和消除变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体数目通常较低)。在某些情况下，相比于由生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，人源化ABD可显示不超过5或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异(同样，在引入本文的任何偏斜、pI和消除变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体数目通常较低)。在一个实施方式中，亲代ABD已经亲和力成熟，如本领域已知。可以利用基于结构的方法进行人源化和亲和力成熟，例如如 USSN 11/004,590中所述。基于选择的方法可以用于人类化和/或亲和成熟抗体可变区，包括但不限于以下文献中所述的方法：Wu等人，1999，J.Mol.Biol. 294:151-162；；Baca等人，1997J.Biol.Chem.272(16):10678-10684；Rosok等人， 1996，J.Biol.Chem.271(37):22611-22618；Rader等人，1998，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 95:8910-8915；Krauss等人，2003，Protein Engineering 16(10):753-759，所有所述文献都以引用的方式整体并入本文中。其它人源化方法可涉及仅移植部分CDR，包括但不限于以下文献中所述的方法：USSN 09/810,510；Tan等， 2002，J.Immunol.169:1119-1125；De Pascalis等，2002，J.Immunol.169:3076- 3084，所有所述文献都以引用的方式整体并入本文中。

如本文所示，抗TIM-3ABD可以呈Fab或scFv的形式。

在一些实施方式中，例如如图21B和C中所示，抗TIM-3ABD是scFv，其中使用scFv连接子将VH和VL结构域连接，所述连接子可以可选为带电荷的scFv连接子。如本领域技术人员所理解的，scFv可以从N端到C端组装为 N-vh-scFv连接子-v1-C或组装为N-v1-scFv连接子-vh-C，其中scFv结构域的C 端通常与铰链-CH2-CH3Fc结构域连接，其中铰链在这种情况下用作结构域连接子。可以以scFv格式或Fab格式使用合适的Fv(包括CDR集和可变的重/可变轻结构域)，如图所示以及WO2017/218707中公开，出于所有目的将其全部内容并入本文，并且尤其对于图13中的TIM-3ABD，图21和图22中的数据和序列表中SEQ ID NO:s 20765-20884、SEQ ID NO:s 37587-37698和SEQ ID NO:s 36347-36706序列。

如本领域技术人员将进一步理解的，全部或部分铰链(其也可以是来自 IgG1，IgG2或IgG4的野生型铰链或其变体，例如具有取代脯氨酸的IgG4 S241P或S228P铰链变体。在相对于亲代IgG4铰链多肽的位置228处(其中编号S228P根据EU编号且S241P是Kabat编号))可以用作scFv和CH2-CH3结构域之间的结构域连接子，或者不同的可以使用如图中所示的结构域连接子。

作为另选，TIM-3ABD可以是Fab片段的形式。在该实施方式中，ABD 由由重链贡献的可变重结构域和由轻链贡献的可变轻结构域组成。可以以scFv 格式或Fab格式使用合适的Fv(包括CDR集和可变的重/可变轻结构域)，如图所示以及WO2017/218707中公开，出于所有目的将其全部内容并入本文，并且尤其对于图13中的TIM-3ABD，图21和图22中的数据和序列表中SEQ ID NO:s 20765-20884、SEQ ID NO:s 37587-37698和SEQ ID NO:s 36347-36706序列。

如本领域技术人员将理解的那样，合适的TIM-3结合结构域可包含一组6 个CDR，如序列表和附图(例如，图12和13)中所描绘的，无论它们是带下划线的/是粗体的还是在它们的下面如本文所述以及如表2所示使用不同编号方案的情况，如在图(例如，图12和13A-C)和序列表中所示的可变重(VH)结构域和可变轻结构域(VL)序列中使用其他比对识别的CDR。在主题的靶向的IL- 15/IL-15Rα异源二聚体融合蛋白中发现有用的合适的TIM-3ABD也可以包括如在这些序列和图中所描绘的完整VH和VL序列，用作scFv或Fab。

在一个实施方式中，TIM-3抗原结合结构域包括图12和13A-C或序列表中描述的任何TIM-3结合结构域的6个CDR(即，vhCDR1-3和v1CDR1-3)。

除了在图和序列表中公开的形成靶向TIM-3的ABD的亲代CDR集外，本文还提供了具有CDR的TIM-3ABD变体，其中CDR包括本文公开的TIM-3 ABD CDR的至少一种修饰(例如，图12和13A-C)。在一个实施方式中，异源二聚体融合蛋白包括TIM-3ABD，其包括一组6个CDR，与图112和3A-C或序列表所示的TIM-3ABD的6个CDR相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10个氨基酸修饰。在某些实施方式中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定， TIM-3ABD能够结合TIM-3抗原，后一种测定在许多实施方式中有特殊的用途。

在一个实施方式中，主题的靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体融合蛋白的 TIM-3ABD包括6个CDR，其与图12和13A-C或序列表所示的TIM-3ABD 的6个CDR有至少90、95、97、98或99％同一性。在某些实施方式中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，TIM-3ABD能够结合所述TIM-3，后一种测定在许多实施方式中有特殊的用途。

在主题靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体融合蛋白的一个实施方式中， TIM-3抗原结合结构域包括以下TIM-3ABD之一的6个CDR(即，vhCDR1-3 和v1CDR1-3)：3H3[TIM-3]_H0_L0、3H3[TIM-3]_H1_L2、3H3[TIM- 3]_H1_L2.1、APE137[TIM-3]、APE5121[TIM-3]、ABTIM3-hum03[TIM-3]、 ABTIM3-hum11[TIM-3]、ABTIM3-hum21[TIM-3]、4177[TIM-3]、4545[Tim-3]、 8213[TIM-3]、mAb15[TIM-3]、mAb58[TIM-3]、TIM3-0433[TIM-3]、TIM3- 0434[TIM-3]、TIM3-0438[TIM3]和TIM3-0443[TIM3](例如见图12和13A-C)。在示例性实施例中，TIM-3ABD是3H3[TIM-3]_H1_L2.1。

在一个实施方式中，TIM-3抗原结合结构域是包含6个CDR(即vhCDR1-3 和vlCDR1-3)的变体TIM-3抗原结合结构域，其中6个CDR与以下TIM-3 ABD之一的6个CDR相比包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰： 3H3[TIM-3]_H0_L0、3H3[TIM-3]_H1_L2、3H3[TIM-3]_H1_L2.1、 APE137[TIM-3]、APE5121[TIM-3]、ABTIM3-hum03[TIM-3]、ABTIM3- hum11[TIM-3]、ABTIM3-hum21[TIM-3]、4177[TIM-3]、4545[Tim-3]、 8213[TIM-3]、mAb15[TIM-3]、mAb58[TIM-3]、TIM3-0433[TIM-3]、TIM3- 0434[TIM-3]、TIM3-0438[TIM3]和TIM3-0443[TIM3](例如参见图12和13A-C)。在示例性实施例中，TIM-3ABD是3H3[TIM-3]_H1_L2.1。

在一个实施方式中，IL-15/IL-15Rα异源二聚体融合蛋白的TIM-3抗原结合结构域是包含6个CDR(即vhCDR1-3和vlCDR1-3)的变体TIM-3抗原结合结构域，其中6个CDR与以下TIM-3ABD之一的6个CDR相比至少有90、95、 97、98或99％同一性)：3H3[TIM-3]_H0_L0、3H3[TIM-3]_H1_L2、3H3[TIM- 3]_H1_L2.1、APE137[TIM-3]、APE5121[TIM-3]、ABTIM3-hum03[TIM-3]、 ABTIM3-hum11[TIM-3]、ABTIM3-hum21[TIM-3]、4177[TIM-3]、4545[Tim-3]、8213[TIM-3]、mAb15[TIM-3]、mAb58[TIM-3]、TIM3-0433[TIM-3]、TIM3- 0434[TIM-3]、TIM3-0438[TIM3]和TIM3-0443[TIM3](例如，参见图12和13A- C)。在示例性实施例中，TIM-3ABD是3H3[TIM-3]_H1_L2.1。

在一些实施方式中，IL-15/IL-15Rα异源二聚体融合蛋白的TIM-3ABD包括本文公开的任何LAG-ABD的可变重结构域(VH)和轻结构域(VL)，包括但不包括限于图12和13A-C中公开的内容。除了本文公开的亲代TIM-3可变重和可变轻结构域之外，本文提供的主题的靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体融合蛋白具有一个或多个TIM-3ABD，其包括是本文公开的TIM-3ABD VH和VL 结构域的变体的可变重结构域和/或可变轻结构域。在一个实施方式中，变体 VH结构域和/或VL结构域与图12、13A-C或序列表所示的TIM-3ABD的VH 和/或VL结构域相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化。在某些实施方式中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，TIM-3ABD能够结合所述TIM-3，后一种测定在许多实施方式中有特殊的用途。

在一个实施方式中，IL-15/IL-15Rα异源二聚体融合蛋白的变体VH和/或 VL结构域与图12和13A-C或序列表所示的TIM-3ABD的VH和/或VL至少 90、95、97、98或99％同一性。在某些实施方式中，TIM-3ABD能够结合 TIM-3，如通过Biacore，表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定的，后者在许多实施例中找到了特殊的用途。

在一些实施方式中，TIM-3ABD包含以下TIM-3ABD中一个的VH和VL： 3H3[TIM-3]_H0_L0、3H3[TIM-3]_H1_L2、3H3[TIM-3]_H1_L2.1、 APE137[TIM-3]、APE5121[TIM-3]、ABTIM3-hum03[TIM-3]、ABTIM3- hum11[TIM-3]、ABTIM3-hum21[TIM-3]、4177[TIM-3]、4545[Tim-3]、 8213[TIM-3]、mAb15[TIM-3]、mAb58[TIM-3]、TIM3-0433[TIM-3]、TIM3- 0434[TIM-3]、TIM3-0438[TIM3]和TIM3-0443[TIM3](例如参见图12和13A-C)。在示例性实施例中，TIM-3ABD是3H3[TIM-3]_H1_L2.1。

在一些实施方式中，TIM-3ABD包括VH和VL，其中VH和/或VL与 TIM-3ABD中一个的VH和VL相比，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 个氨基酸修饰：3H3[TIM-3]_H0_L0、3H3[TIM-3]_H1_L2、3H3[TIM- 3]_H1_L2.1、APE137[TIM-3]、APE5121[TIM-3]、ABTIM3-hum03[TIM-3]、 ABTIM3-hum11[TIM-3]、ABTIM3-hum21[TIM-3]、4177[TIM-3]、4545[Tim-3]、 8213[TIM-3]、mAb15[TIM-3]、mAb58[TIM-3]、TIM3-0433[TIM-3]、TIM3- 0434[TIM-3]、TIM3-0438[TIM3]和TIM3-0443[TIM3](例如参见图12和13A-C)。在示例性实施例中，TIM-3ABD是3H3[TIM-3]_H1_L2.1。

在某些实施方式中，TIM-3ABD包括VH和VL，其中VH和/或VL与以下TIM-3ABD中一个的VH和VL相比有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性：3H3[TIM-3]_H0_L0、3H3[TIM-3]_H1_L2、3H3[TIM-3]_H1_L2.1、 APE137[TIM-3]、APE5121[TIM-3]、ABTIM3-hum03[TIM-3]、ABTIM3- hum11[TIM-3]、ABTIM3-hum21[TIM-3]、4177[TIM-3]、4545[Tim-3]、 8213[TIM-3]、mAb15[TIM-3]、mAb58[TIM-3]、TIM3-0433[TIM-3]、TIM3- 0434[TIM-3]、TIM3-0438[TIM3]和TIM3-0443[TIM3](例如，参见图12和13A- C)。在示例性实施例中，TIM-3ABD是3H3[TIM-3]_H1_L2.1。

C.Fc结构域

本发明的Fc结构域组分如本文所述，其通常包含偏斜变体和/或可选的pI 变体和/或本文概述的消除变体。参见例如WO2017/218707在标题“IV异源二聚体抗体”下的公开内容，包括IV.A、IV.B、IV.C、IV.D、IV.E、IV.F、IV.G、 IV.H和IV.I部分，其全部通过引用明确地整体并入。在本发明的异源二聚体蛋白中特别有用的是包含如本文概述的“偏斜变体”、“pI变体”、“消除变体”和 FcRn变体的Fc结构域。这样的变体的特别有用的组合被描绘在例如图7A-F。

Fc结构域可以衍生自IgG Fc结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc 结构域。在示例性实施方式中，本文提供的主题的异源二聚体融合蛋白包括 IgG1 Fc结构域。以下描述了可用于IL-15/IL-15RαFc融合单体和靶向IL-15/IL- 15Rα异源二聚体融合蛋白的抗TIM-3抗体片段的Fc结构域。

因此，“Fc结构域”包括-CH2-CH3结构域和可选的铰链结构域，并且可以来自人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4，其中Fc结构域衍生自IgG1。在本文中的一些实施方式中，当蛋白片段(例如IL-15或IL-15Rα)连接于Fc结构域时，IL- 15或IL-15Rα构建体的C端连接于Fc结构域的全部或部分铰链。在其他实施方式中，当蛋白片段(例如IL-15或IL-15Rα)连接至Fc结构域时，IL-15或IL- 15Rα构建体的C端连接至Fc结构域的CH1结构域。

在本文概述的Fc结构域蛋白的一些构建体和序列中，IL-15或IL-15Rα蛋白片段的C-端附着于结构域连接子的N-端，其C-端连接。到恒定Fc结构域的 N端(N-IL-15或IL-15Rα蛋白片段-连接子-Fc结构域-C)尽管可以转换(N-Fc结构域-连接子-IL-15或IL-15Rα)蛋白片段-C)。在本文概述的其它构建体和序列中，可选地第一蛋白片段的C端通过结构域连接子连接于第二蛋白片段的N端，可选地第二蛋白片段的C端通过结构域连接子连接于恒定Fc结构域的N端。在本文概述的又其它构建体和序列中，提供不与第一蛋白片段或第二蛋白片段连接的恒定Fc结构域。异源二聚体Fc融合蛋白可含有两种或更多种本文所述的例示性单体Fc结构域蛋白。可以使用任何结构域连接子将IL-15或IL-15Rα蛋白片段连接至本文提供的异源二聚体融合蛋白的Fc结构域。在一些实施方式中，连接子是图8中的连接子中的任何一个。

在一些实施方式中，连接子是“结构域连接子”，其用于将如本文概述的任何两个结构域(例如，IL-15或IL-15Rα蛋白片段连接到Fc结构域，或scFv连接到Fc结构域)连接在一起，其中一些描绘于图7C和8中。虽然可以使用任何合适的连接子，但许多实施例使用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、 (GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少一的整数(并且通常为1到2 到3到4到5)以及允许两个结构域以足够的长度和柔性重组连接的任何肽序列以允许每个结构域保留其生物学功能。在一些情况下，并且注意“链状”，如下所述，可以使用带电荷的结构域连接子。

在一个实施方式中，异源二聚体Fc融合蛋白含有至少两个恒定结构域，其可以被工程化以产生异源二聚体，例如pI工程化。可以使用的其它Fc结构域包括：含有一个或多个已经过pI工程化的本发明的CH1、CH2、CH3和铰链结构域的片段。特别地，21描绘的格式是异源二聚体Fc融合蛋白，意味着该蛋白具有两个相关联的Fc序列的自组装成异源二聚体Fc结构域和如下文更全面地描述的至少一个融合蛋白片段(例如，1、2或更多种蛋白片段)。在一些情况下，第一融合蛋白与第一Fc连接，并且第二融合蛋白与第二Fc连接。在其他情况下，第一融合蛋白与第一Fc连接，并且第一融合蛋白非共价连接未与 Fc连接的第二融合蛋白。在一些情况下，异源二聚体Fc融合蛋白含有与第二融合蛋白连接的第一蛋白片段，第二融合蛋白连接于第一Fc序列，和不与第一或第二蛋白片段连接的第二Fc序列。

因此，在一些实施方式中，本发明提供异源二聚体Fc融合蛋白，其依赖于使用两种不同的重链变体Fc序列，其将自组装以形成异源二聚体Fc结构域融合多肽。

本发明涉及新的构建体，以提供允许与一种或多种结合搭配物、配体或受体结合的异源二聚体Fc融合蛋白。异源二聚体Fc融合构建体基于抗体重链的两个Fc结构域的自组装性质，例如组装成“二聚体”的两个“单体”。异源二聚体Fc融合通过改变如下面更充分讨论的每种单体的氨基酸序列来制备。因此，本发明一般涉及异源二聚体Fc融合蛋白的形成，其可以几种方式共同接合结合搭配物或配体或受体，这依赖于在每条链上不同的恒定区中的氨基酸变体，以促进异源二聚体形成和/或使异源二聚体比同源二聚体更易于纯化。下文更详细地描述了本文所述的主题的异源二聚体融合蛋白的特定实施方式的Fc结构域中所包括的特定变体。

1.异源二聚化变体

本发明提供了异源二聚体蛋白，包括多种格式的异源二聚体融合蛋白。这样的异源二聚体蛋白包括两个不同的Fc结构域(在第一和第二单体的每一个上)，其包括促进第一和第二单体的异源二聚化和/或允许比同型二聚体更容易纯化异源二聚体的修饰，在本文中统称为“异源二聚化变体。”如下所述，异源二聚体变体可包括偏斜变体(例如，下文所述的“旋钮和孔”和“电荷对”变体)以及有助于将同源二聚体与异源二聚体分离的“pI变体”。如在美国专利号US 9,605,084(其全部内容通过引用并入本文)中一般性描述的，并且特别是如下文对异源二聚化变体所讨论，异源二聚化的有用机理包括美国专利US 9,605,084中所述的“旋钮和孔”(“KIH”)、US 9,605,084中描述的“静电操纵”或“电荷对”、 US 9,605,084中描述的pI变体、以及US 9,605,084中概述的一般其他Fc变体及以下内容。

a.偏斜变体

在一些实施方式中，主题的异源二聚体蛋白包括偏斜变体，其是在第一Fc 结构域(A)和/或第二Fc结构域(B)中的一个或多个氨基酸修饰，其有利于Fc异源二聚体(包括第一和第二Fc结构域的Fc二聚体；AB)优先于Fc同源二聚体(包括两个第一Fc结构域或两个第二Fc结构域的Fc二聚体；AA或BB)的形成。合适的偏斜变体包括在美国公开第2016/0355608号美国专利的图29中，其全部内容通过引用并入本文，并且特别是针对其偏斜变体以及图4的公开内容。

偏斜变体的一种机制在所属领域通常称为“旋钮和孔”，是指形成空间影响以利于异源二聚体形成和不利于同源二聚体形成的氨基酸工程化，如在USSN 61/596,846、Ridgway等，Protein Engineering 9(7):617(1996)；Atwell等、J. Mol.Biol.1997 270:26；美国专利第8,216,805号中所述，所有这些都以全文引用的方式并入本文中，并专门用于披露“旋钮和孔”突变。在本文中有时将其称为“空间变体”。附图确定了许多依靠“旋钮和孔”的“单体A–单体B”对。另外，如Merchant等，Nature Biotech.16:677(1998)中所述，这些“旋钮和孔”突变可以与二硫键组合以进一步有利于形成Fc异源二聚体。

一种用于产生异源二聚体抗体的另一种偏斜变体机制有时称为“静电转向”，如Gunasekaran等，J.Biol.Chem.285(25):19637(2010)中所述，所述文献以全文引用的方式并入本文中。在本文中有时将其称为“电荷对”。在该实施方式中，静电用于偏斜向异源二聚化的形成。如所属领域技术人员将了解，这些还可以影响pI，并且因此影响纯化，并且因此在一些情况下还可以被视为pI变体。但是，由于生成的这些片段会迫使异源二聚化，并且不用作纯化工具，因此将它们归类为“偏斜变体”。这些包括但不限于与D221R/P228R/K409R配对的 D221E/P228E/L368E(例如，这些是“单体”对应组)，和与 C220R/E224R/P228R/K409R配对的C220E/P228E/368E。

在一些实施方式中，同时基于上述的“旋钮和孔”机制以及“静电转向”机制，偏斜变体有利地且同时有利于异源二聚化。在一些实施方式中，异源二聚体蛋白包括一组或多组此类异源二聚化偏斜变体。这些变体以“成对”的“集合”形式出现。也就是说，将一组对并入第一单体中且将另一组对并入第二单体中。此类别中的示例性“偏斜变体”包括S364K/E357Q：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K； L368D/K370S:S364K/E357L；K370S:S364K/E357Q；或T366S/L368A/Y407V: T366W(可选地包括桥接二硫键，T366S/L368A/Y407V/Y349C： T366W/S354C)“偏斜”变体氨基酸取代集。就术语而言，对“S364K/E357Q： L368D/K370S”是指其中一个单体包括具有氨基酸取代S364K和E357Q的Fc结构域，而另一单体包括具有氨基酸取代L368D和K370S的Fc结构域；如上所述，这些对的“链度”取决于起始pI。应当注意的是，这些组不一定表现为“孔中的旋钮”变体，其中在一个单体上的残基与另一单体上的残基之间一一对应。即，组中的这些对可以取代性形成了两个单体之间的界面，促进异源二聚体形成且阻碍了同型二聚体形成，从而使在生物学条件下自发形成异源二聚体的百分比超过90％，而非预期的50％(25％同型二聚体A/A:50％异源二聚体A/B:25％同型二聚体B/B)。

在示例性的实施方式中，异源二聚体融合蛋白包括S364K/E357Q: L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K； T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L；K370S: S364K/E357Q；或T366S/L368A/Y407V:T366W(可选地包括桥接二硫键， T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)“偏斜”变体氨基酸取代集。在示例性实施方式中，异源二聚体融合蛋白包括“S364K/E357Q：L368D/K370S”氨基酸取代集。

在一些实施方式中，本文提供的偏斜变体独立地与引入到异源二聚体融合蛋白的第一和第二Fc结构域中的一个或两个中的其他修饰结合，包括但不限于其他偏斜变体(参见，例如，美国公开申请第2012/0149876号的图37，其通过引用并入本文，特别是因为其关于偏斜变体的公开)、pI变体、等位基因变体、 FcRn变体、消除变体等。此外，个体修饰也可以独立地并且可选地从主题异源二聚体融合蛋白中包括或排除。

b.用于异源二聚体的pI(等电点)变体

在一些实施方式中，异源二聚体融合蛋白包括纯化变体，其有利地允许将异源二聚体融合蛋白与同源二聚体蛋白分离(“pI变体”)。

一般来说，如所属领域的技术人员将了解，pI变体存在两种通用类别：提高蛋白pI(碱性变化)的变体和降低蛋白pI(酸性变化)的变体。如本文所述，可以实现这些变体的所有组合：一个单体可以是野生型，或pI与野生型无显著差异的变体；且另一个单体可以更具碱性或更具酸性。作为选择，改变每种单体，一种具有更强碱性且一种具有更强酸性。

有几种基本的机制可以使纯化异源二聚体蛋白变得容易。一种这样的机制依赖于pI变体的使用，所述pI变体包括一种或多种影响融合蛋白单体中一个或两个单体的等电点的修饰，从而每个单体以及随后的每个二聚体具有不同的 pI，因此可以等电纯化AA、AB和BB二聚体蛋白。作为另选，某些形式还允许基于尺寸进行分离。如下文进一步概述，利用偏斜变体还可以“偏斜”形成异源二聚体(相对于同源二聚体)。因此，异源二聚化偏斜变体和pI变体的组合在本文提供的主题异源二聚体融合蛋白中特别有用。

另外，如下面更全面概述，取决于异源二聚体Fc融合蛋白的形式，pI变体可以含于单体的恒定和/或Fc结构域内，或者可以使用结构域连接子。在一些实施方式中，异源二聚体融合蛋白包括用于取代性功能的附加修饰，所述取代性功能还可产生pI变化，例如Fc、FcRn和KO变体。

在利用pI作为分离机制以允许纯化异源二聚体融合蛋白的实施方式中，可以将氨基酸修饰引入异源二聚体融合蛋白的一个或两个单体中。即，一种单体 (为了简单起见，本文中称为“单体A”)的pI可以加以工程化以与单体B不同，或单体A和B两者都可以改变，其中单体A的pI增加，而单体B的pI降低。如所论述，任一种或两种单体的pI变化可以如下进行：除去或添加带电荷的残基(例如用带正或负电荷的氨基酸残基置换中性氨基酸，例如谷氨酰胺置换成谷氨酸)、将带电荷的残基从正或负电荷变为相反电荷(例如天冬氨酸变为赖氨酸) 或将带电荷的残基变为中性残基(例如电荷的失去；赖氨酸变为丝氨酸)。多种这些变体展示于图中，包括图4和5。

通过使用“野生型”重链恒定区和经过工程化以增加或降低其pI的变体区 (wt A：B+或wt A：B-)，或通过增加一个区域并减小另一个区域(A+：B-或A-： B+)，可以在至少一种单体中产生足够的pI变化，从而使异源二聚体与同二聚体分离。

因此，通常，本发明的一些实施方式的成分是Fc结构域或恒定结构域区域中的氨基酸变体，所述氨基酸变体涉及通过将氨基酸取代(“pI变体”或“pI取代”)并入到单体中的一个或两个中来更改二聚体蛋白的单体中的至少一个单体 (如果不是两个单体的话)的等电点(pI)。如果两种单体的pI相差小到0.1个pH 单位(0.2、0.3、0.4和0.5或更大pH单位都能适用于本发明中)，那么就可以实现异源二聚体与两种同源二聚体的分离。

如所属领域技术人员将理解，为了获得良好分离而包括在异源二聚体融合蛋白的每一种或两种单体上的pI变体的数量将部分取决于组分的起始pI。即，为了确定要工程化哪个单体或在哪种“方向”(例如更正或更负)进行工程化，计算Fc结构域和每个单体中所含任何IL-15、IL-15Rα或连接子的序列，并给予单体的PI由此做出决定。如本领域已知，不同的Fc结构域、连接子IL-15和 IL-15Rα将具有不同的起始pI。一般来说，如本文所概述，pI经工程化而使得每种单体的总pI差异达到至少约0.1log，如本文所概述优选0.2到0.5。

一般来说，如所属领域的技术人员将了解，影响pI的氨基酸修饰存在两种通用类别：提高蛋白pI(碱性变化)的变体和降低蛋白pI(酸性变化)的变体。如本文所述，可以使用这些变体的所有组合：一种单体可以包括野生型Fc结构域，或者不显示与野生型显著不同的pI的变体Fc结构域，并且另一种可以是更碱性或更酸性的Fc结构域。作为另选，可以改变每种单体，一种更碱性，并且一种更酸性。

在使用pI变体实现异源二聚化的情况下，提供了设计和纯化异源二聚体融合蛋白的更模块化方法。因此，在一些实施方式中，必须工程化异源二聚化变体(包括偏斜和纯化异源二聚化变体)。另外，在一些实施方式中，通过导入来自不同IgG同型的pI变体以便在不引入显著免疫原性的情况下改变pI，从而显著降低pI变体导致免疫原性的可能性。因此，要解决的另一个问题是阐明具有高人类序列含量的低pI恒定结构域，例如在任何特定位置最小化或避免非人类残基。作为同种型取代的另选或补充，通过利用等位性取代(例如，从Asn到 Asp；和从Gln到Glu)，显著降低了由pI变体产生的免疫原性的可能性。

这种pI工程化可以得到的额外益处也是血清半衰期延长和FcRn结合增加。即，如美国公开申请US 2012/0028304(通过引用整体并入，特别是为了公开提供额外功能的pI变体)所述，降低抗体恒定结构域(包括在Fc融合蛋白中发现的那些)的pI可导致更长的体内血清滞留。这些用于增加血清半衰期的pI变体也促进用于纯化的pI变化。

另外，应该注意的是，异源二聚化变体的pI变体为Fc融合蛋白的分析和质量控制方法提供额外的益处，因为消除同源二聚体、最小化同源二聚体和区分同源二聚体何时存在的能力是显著的。类似地，可靠地测试异源二聚体Fc 融合蛋白产生的再现性的能力是重要的。

pI变体的示例性组合显示在美国公开申请2016/0355608号的图4和5以及图30中，其全部内容通过引用整体并入本文，并且特别是pI变体的公开。如本文所概述且如图中所示，这些变化是相对于IgG1展示，但所有同型以及同型杂合体均可以按此方式改变。在重链恒定结构域是来自IgG2-4的情况下，还可以使用R133E和R133Q。

在一些实施方式中，在Fc结构域的铰链中进行修饰，包括基于EU编号的 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229 和230位。因此，pI突变和特别是取代可以在位置216-230中的一个或多个中进行，其中1、2、3、4或5个突变可用。同样，单独或与其它结构域中的其它 pI变体一起考虑所有可能的组合。

可用于降低铰链结构域的pI的特定取代包括但不限于位置221处的缺失、位置222处的非天然缬氨酸或苏氨酸、位置223处的缺失、位置224处的非天然谷氨酸、位置225处的缺失、位置235处的缺失和位置236处的缺失或非天然丙氨酸。在一些情况下，仅在铰链结构域中进行pI取代，并且在其它情况下，这些取代以任何组合添加到其它结构域中的其它pI变体。

在一些实施方式中，可以在CH2区域中进行突变，包括基于EU编号的 233、234、235、236、274、296、300、309、320、322、326、327、334和 339位。应该注意，可以进行233-236中的改变以增加IgG2主链中的效应功能 (以及327A)。同样，可以对这14个位置进行所有可能的组合；例如，异源二聚体融合蛋白可包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CH2 pI取代的变体Fc结构域。

可用于降低CH2结构域的pI的特定取代包括但不限于位置274处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置296处的非天然苯丙氨酸、位置300处的非天然苯丙氨酸、位置309处的非天然缬氨酸、位置320处的非天然谷氨酸、位置322 处的非天然谷氨酸、位置326处的非天然谷氨酸、位置327处的非天然甘氨酸、位置334处的非天然谷氨酸、位置339处的非天然苏氨酸以及CH2和其它结构域内的所有可能组合。

在这个实施方式中，突变可以独立地和可选地选自CH3区域的位355、 359、362、384、389、392、397、418、419、444和447位(EU编号)。可用于降低CH3结构域的pI的特定取代包括但不限于位置355处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置384处的非天然丝氨酸、位置392处的非天然天冬酰胺或谷氨酸、位置397处的非天然蛋氨酸、位置419处的非天然谷氨酸、位置359处的非天然谷氨酸、位置362处的非天然谷氨酸、位置389处的非天然谷氨酸、位置418处的非天然谷氨酸、位置444处的非天然谷氨酸和位置447处的缺失或非天然天冬氨酸。图5中提供pI变体的例示性实施方式。

在一个实施方式中，异源二聚体融合蛋白包括：具有包含pI变体修饰 295E/384D/418E/421D(相对于人IgG1而言，为Q295E/N384D/Q418E/N421D)的变体Fc结构域的单体。在一个实施方式中，异源二聚体融合蛋白包括：具有包含pI变体修饰208D/295E/384D/418E/421D(相对于人IgG1而言为 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)的变体Fc结构域的单体。在一些实施方式中，异源二聚体融合蛋白包括：具有包含pI变体修饰295E/384D/418E/421D(相对于人IgG1时的Q295E/N384D/Q418E/N421D)的变体Fc结构域的单体。在一个实施方式中，异源二聚体融合蛋白包括：具有包含pI变体修饰 196K/199T/217R/228R/276K(相对于人IgG1而言，为 Q196K/I199T/P217R/P228R/N276K)的变体Fc结构域的单体。

在一个实施方式中，异源二聚体融合蛋白包括：具有包含pI变体修饰 217R/228R/276K(当相对于人IgG1时为P217R/P228R/N276K)的变体Fc结构域的单体。可掺入受试者的Fc结构域的其他示例性pI变体修饰在图5中描绘。

2.用于额外功能的额外Fc变体

除pI氨基酸变体之外，可以出于多种原因(包括但不限于改变与一种或多种FcγR受体的结合、改变与FcRn受体的结合等)而产生多个适用的Fc氨基酸修饰。

相应地，本发明的蛋白可以包括氨基酸修饰，包括本文所概述的异二聚化变体，包括pI变体和空间变体。每组变体可以独立地且可选地包括于任何特定异源二聚体蛋白中或从任何特定异源二聚体蛋白中排除。

a.FcγR变体

相应地，可以产生多个适用的Fc取代来改变与一种或多种FcγR受体的结合。导致结合增加以及结合减少的取代可能是有用的。举例来说，已知与 FcγRIIIa的结合增加引起ADCC增加(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别目标细胞上的所结合抗体且随后促使目标细胞溶解)。类似地，在一些情况下，与FcγRIIb的结合减弱(抑制性受体)也可能是有利的。可以用于本发明中的氨基酸取代包括USSN 11/124,620(尤其是图41)、11/174,287、11/396,495、11/538,406中列出的氨基酸取代，所有这些文献全文以及尤其是针对其中所揭露的变体所述内容特此并入本文中供参考。可以使用的特定变体包括但不限于236A、239D、239E、332E、 332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、 239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V和299T。

另外，增加对FcγRIIc的亲和力的氨基酸取代也可包括在本文概述的Fc结构域变体中。例如，USSN 11/124,620和14/578,305中描述的取代是有用的。

另外，存在额外的Fc取代，其可用于增加与FcRn受体的结合和增加血清半衰期，如USSN 12/341,769中具体公开的，其通过引用整体并入本文，包括但不限于434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、 436I or V/434S、436V/428L和259I/308F/428L。

b.消除变体

类似地，另一类功能变体是“FcγR消除变体”或“Fc敲除(FcKO或KO)”变体。在这些实施方式中，对于一些治疗应用，期望减少或去除Fc结构域与一种或多种或所有Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合，以避免其他作用机制。即，例如，在许多实施方式中，特别是在使用双特异性免疫调节抗体时，需要消除FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性，使得一个Fc结构域包含一个或多个Fcγ受体消除变体。这些消除变体在USSN 15/141,350的图31中描绘，并且每一个都可以独立地和可选地被包括或不包括，其中优选的方面利用选自下述的消除变体：G236R/L328R、 E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、 E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。应注意本文中提及的消除变体消除FcγR结合，但是通常不消除FcRn结合。

示例性的消除变体在图5中提供。

c.异源二聚体与Fc变体的组合

如所属领域的技术人员将了解，所述异二聚化变体(包括歪斜和/或pI变体) 全部可以可选地且独立地按任何方式组合，只要其保持其“链型”或“单体分区”。另外，所有这些变体可以按任一种异二聚化形式组合。

在pI变体的情况下，虽然图中展示了可以特别使用的实施例，但是可以根据改变两种单体之间的pI差异以辅助纯化的基本规则来产生其它组合。

此外，任何异二聚化变体，偏斜和pI，也独立地和可选地与Fc消除变体、 Fc变体、FcRn变体组合，如本文一般概述。

另外，单体Fc结构域可包含一组氨基酸取代，其包括 C220S/S267K/L368D/K370S或C220S/S267K/S364K/E357Q。

此外，异源二聚体融合蛋白可包含偏斜变体(例如，USSN 15/141,350的图 1A-1C中所示的一组氨基酸取代，所有这些取代均以引用的方式整体并入本文)，特别有用的偏斜变体选自S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K； L368E/K370S:S364K；T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S: S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C，可选的消除变体，可选带电的结构域连接子和重链包含pI变体。

在一些实施方式中，Fc域包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：236R、 239D、239E、243L、M252Y、V259I、267D、267E、298A、V308F、328F、 328R、330L、332D、332E、M428L、N434A、N434S、236R/328R、 239D/332E、M428L、236R/328F、V259I/V308F、267E/328F、M428L/N434S、 Y436I/M428L、Y436V/M428L、Y436I/N434S、Y436V/N434S、 239D/332E/330L、M252Y/S254T/T256E、V259I/V308F/M428L、 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、G236R/L328R和PVA/S267K。在一些情况下，Fc结构域包含氨基酸取代239D/332E。在其他情况下，Fc结构域包含氨基酸取代G236R/L328R或PVA/S267K。

在一个实施方式中，可用于本发明的偏斜和pI变体的特定组合是 T366S/L368A/Y407V：T366W(可选地包括桥连二硫化物， T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)，其中一种单体包含 Q295E/N384D/Q418E/N481D和另一个带正电荷的结构域连接子。如所属领域所理解，“孔中的旋钮”型变体不改变pI，并且因此可用于任一单体。可以在本发明的特定格式中使用的变体的有用组合包括在图7A-7F中。

III.靶向的IL-15/IL-15RαFc融合蛋白x TIM-3ABD异源二聚体蛋白

本文提供了异源二聚体融合蛋白，其可以与检查点抑制剂TIM-3抗原结合并且可以与共同的γ链(γc；CD132)和/或IL-2受体β-链(IL-2Rβ；CD122)复合。异源二聚体融合蛋白可含有IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白和抗体融合蛋白。IL- 15/IL-15Rα-Fc融合蛋白可包括与IL-15Rα共价连接的IL-15蛋白(通常包括氨基酸取代)和Fc结构域。可选地，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白是非共价连接。

IV.本发明的有用形式

如图21所示，有许多本发明的靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体融合蛋白的有用的格式。通常，本发明的异源二聚体融合蛋白具有三种功能组分：IL- 15/IL-15Rα(sushi)组分，抗TIM-3组分和Fc组分，它们各自可以采用如本文所概述的不同的形式，并且它们各自可以与其他组分以任何配置组合。

根据EU编号，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域可具有选自由以下组成的组：a)S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；b)S364K/E357Q: L368D/K370S；c)L368D/K370S:S364K；和d)L368E/K370S:S364K；e) T411E/K360E/Q362E:D401K；f)L368D/K370S:S364K/E357L和g)K370S: S364K/E357Q。在示例性实施方式中，偏斜变体是S364K/E357Q：L368D/K370S。

在一些实施方式中，第一和/或第二Fc结构域具有选自以下pI变体的另一组pI氨基酸取代：Q295E/N384D/Q418E/N421D、 N208/Q295E/N384D/Q418E/N421D或Q196K/I199T/P217R/P228R/N276K，根据 EU编号。

可选地，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有选自以下 FcKO变体的另一组消除(“FcKO”)氨基酸取代：G236R/L328R、 E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、 E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。

可选地，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有用于半衰期延长的 428L/434S变体。

在使用铰链或部分铰链将Fc结构域连接至scFv、IL-15或IL-15Rα结构域的实施方式中，铰链可可选地包括C220S取代，以防止铰链与任何轻链形成不期望的二硫键。

下文提供了主题异源二聚体融合蛋白的示例性形式。

A.scIL-15/RαXscFv

一个实施方式示于图21A，并且包括两个单体。第一单体由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2- CH3(其中第二结构域连接子通常为铰链结构域)，并且第二单体包含VH-scFv 连接子-VL-铰链-CH2-CH3或VL-scFv连接子-VH-铰链-CH2-CH3，不过在任一个方向上，结构域连接子可以取代铰链。这通常被称为“scIL-15/Rα×scFv”，其中“sc”代表“单链”，是指IL-15和IL-15Rα(sushi)结构域使用共价连接子连接。对于本实施方式的变体的优选组合在图21A和B中。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL-15/Rα XscFv”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含抗TIM-3 scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域。任何有用的结构域连接子都可用于连接异源二聚体蛋白的各种成分，包括但不限于图8和 9A-C中的那些。在示例性实施方式中，将IL-15变体连接至第一Fc结构域并且将抗TIM-3scFv连接至第二Fc结构域的结构域连接子各自是抗体铰链结构域。

在一些实施方式中，抗TIM-3scFv包括通过scFv连接子共价连接可变轻结构域(VL)的可变重结构域(VH)(例如，图9A-C)。在一个实施方式中，抗 TIM-3scFv是从N端到C端的VH-scFv连接子-VL。在另一个实施方式中，抗TIM-3scFv是从N端到C端的VL-scFv连接子-VH。抗TIM-3scFv的C端通过结构域连接子(例如抗体铰链结构域)连接至第一Fc结构域的N端。

在scIL-15/RαX scFv格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12和13A-C所示的任何可变的重和轻结构域对。

在scIL-15/RαX scFv格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12和13A-C所示的任何可变的重和轻结构域对3H3[TIM- 3]_H1_L2.1。在一个实施方式中，“scIL-15/RαX scFv”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含抗-TIM-3scFv-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，并且其中抗TIM-3scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在scIL-15/RαX scFv格式中，一个优选的实施方式利用IL-15变体，其包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在一个实施方式中，“scIL-15/RαX scFv”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其由N 端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(铰链)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含抗 TIM-3scFv-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，并且其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和 VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中， TIM-3scFv包括图12和13A-C中的任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15 变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一个示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在scIL-15/RαX scFv格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在一个实施方式中，“scIL-15/RαX scFv”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(铰链)- CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；和b)第二单体，其由N端到C 端包含抗TIM-3scFv-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，其中抗TIM-3scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，并且其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D。

在scIL-15/RαXscFv格式中，一个优选实施例利用偏斜变体对 S364K/E357Q：L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL-15/RαXscFv”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；和b)第二单体，其由N端到C端包含抗TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对 S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL-15/Rα XscFv”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含抗 TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，其中 IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D\D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。在示例性实施方式中，TIM-3 scFv包括图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和 13A-C中的任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/N65D。在又一个示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D。

在scIL-15/RαX scFv格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的任何可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1和偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。在一个实施方式中，“scIL-15/RαX scFv”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi) 结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含抗TIM-3scFv-(铰链)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，其中抗TIM-3scFv包括3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。

在scIL-15/RαX scFv格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在一个实施方式中，“scIL-15/RαX scFv”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(铰链)- CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C 端包含抗TIM-3scFv-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，其中抗TIM-3scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q： L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体 L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。在一个特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、并且scFv包括 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在又一个实施方式中，IL-15变体是IL-15D30N/E64Q/N65D变体，并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。

在scIL-15/RαX scFv格式中，一个优选实施方式利用了在同时存在于第一和第二单体上的偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S，pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D，消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，并且可选地在第一单体和第二单体上都存在428L/434S变体。

在一个实施方式中，“scIL-15/RαX scFv”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；和b)第二单体，其由N端到C端包含抗TIM-3scFv-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3 是第二Fc结构域；其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K,其中变体Fc结构域包括pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且其中所述编号根据EU编号。在一些实施方式中，第一和第二单体的铰链也各自包含氨基酸取代C220S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、 D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图 12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中的任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一个示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中任何TIM-3ABD 的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在scIL-15/RαX scFv格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12与图21A格式所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S，同时存在于第一和第二单体上的pI 变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，消除变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及同时存在于第一和第二单体上的可选428L/434S变体。

在一个实施方式中，“scIL-15/RαX scFv”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；和b)第二单体，其由N端到C端包含抗TIM-3scFv-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3 是第二变体Fc结构域；其中抗TIM-3scFv包含3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一变体Fc结构域包括pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且其中所示编号根据 EU编号。在一些实施方式中，第一和第二单体的铰链也各自包含氨基酸取代 C220S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在一个特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且scFv包括 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在又一个实施方式中，IL-15变体是IL-15D30N/E64Q/N65D变体，并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。

B.scFv X ncIL-15/Rα

此实施方式示于图21B，并且包括三个单体。第一单体由N端到C端包含 IL-15Rα(sushi)结构域-结构域连接子-CH2-CH3，并且第二单体包含VH-scFv连接子-VL-铰链-CH2-CH3或VL-scFv连接子-VH-铰链-CH2-CH3，不过在任一定向上，结构域连接子可以取代铰链。第三单体是变体IL-15结构域。这通常被称为“ncIL-15/Rα×scFv”或“scFv×ncIL-15/Rα”，其中“nc”代表“非共价”，是指 IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域的自组装非共价连接。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X ncIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含抗- TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)IL-15变体，其中IL-15变体和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物。任何有用的结构域连接子都可用于连接异源二聚体蛋白的各种成分，包括但不限于图8和9A-C中的那些。在示例性实施方式中，将抗TIM-3scFv连接至第一Fc结构域和将IL-15Rα(sushi)结构域连接至第二Fc结构域的结构域连接子各自是抗体铰链结构域。

在一些实施方式中，抗TIM-3scFv包括通过scFv连接子共价连接可变轻结构域(VL)的可变重结构域(VH)(例如，图9A-C)。在一个实施方式中，抗 TIM-3scFv从N端到C端是VH-scFv连接子-VL。在另一个实施方式中，抗TIM-3scFv是从N端到C端的VL-scFv连接子-VH。抗TIM-3scFv的C端通过结构域连接子(例如抗体铰链结构域)连接至第一Fc结构域的N端。

在scIL-15/RαX scFv格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的任何可变的重和轻结构域对。

在scIL-15/RαX scFv格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的任何可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X ncIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含抗- TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)IL-15变体，其中IL-15变体和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，并且其中抗TIM-3scFv包括可变重结构域和可变轻结构域3H3[TIM-3]_H1_L2.1。

在ncIL-15/RαX scFv形式中，一个优选的实施方式利用IL-15变体，其包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含抗-TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3 是第二Fc结构域；和c)IL-15变体，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，并且其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、 D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图 12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中的任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一个示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中任何TIM-3ABD 的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在ncIL-15/RαX scFv格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含抗-TIM-3 scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)IL-15变体，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi) 结构域形成IL-15复合物，其中抗TIM-3scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，并且其中IL-15变体包含氨基酸取代N4D/N65D、 D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在一个特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且 scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在又一个实施方式中， IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且scFv包括3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。

在ncIL-15/RαXscFv格式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对 S364K/E357Q：L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含抗-TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2- CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi) 结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和 c)IL-15变体，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，并且第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X ncIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含抗- TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域； b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)IL-15变体，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，并且其中第一和第二变体Fc 结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。在示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A- C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中的任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一个示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中任何TIM-3ABD 的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在ncIL-15/RαX scFv格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的任何可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1和偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL- 15Rα异源二聚体蛋白是“scFv XncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括： a)第一单体，其由N端到C端包含抗-TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)IL-15变体，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中抗TIM-3scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q： L368D/K370S。

在ncIL-15/RαX scFv格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL- 15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含抗-TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)IL-15变体，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中抗TIM-3scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对 S364K/E357Q：L368D/K370S。在一个特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在又一个实施方式中，IL-15 变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1 的可变重和轻结构域对。

在ncIL-15/RαX scFv格式中，一个优选实施方式利用了在同时存在于第一和第二单体上的偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D、消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，和可选地在同时存在于第一和第二单体上的428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X ncIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含抗- TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域； b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)IL-15变体，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一变体Fc结构域包括pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D，且编号依据EU编号。在一些实施方式中，第一和第二单体的铰链也各自包含氨基酸取代C220S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中的任何TIM-3ABD 的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一个示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在scIL-15/RαX scFv格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12与图21B格式所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S，同时存在于第一和第二单体上的pI 变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及同时存在于第一和第二单体上的可选428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X ncIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含抗- TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域； b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)IL-15变体，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中抗TIM-3scFv包括3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一变体Fc结构域包括pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且所示编号根据EU编号。在一些实施方式中，第一和第二单体的铰链也各自包含氨基酸取代C220S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在一个特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、并且scFv包括 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D，并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。

C.scFv X dsIL-15/Rα

此实施方式示于图21C，并且包括三个单体。第一单体由N端到C端包含 IL-15Rα(sushi)结构域-结构域连接子-CH2-CH3，其中IL-15Rα(sushi)结构域具有工程化的半胱氨酸残基，并且第二单体包含VH-scFv连接子-VL-铰链-CH2- CH3或VL-scFv连接子-VH-铰链-CH2-CH3，不过在任一定向上，结构域连接子可以取代铰链。第三单体是IL-15结构域，也被工程化成具有半胱氨酸变体氨基酸，因此允许在IL-15Rα(sushi)结构域与变体IL-15结构域之间形成二硫桥键。这通常称为“scFv×dsIL-15/Rα”或dsIL-15/Rα×scFv，其中“ds”代表“二硫键”。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X dsIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其从N端至C端包含抗- TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，并且IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和c)IL-15变体，其包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键。任何有用的结构域连接子都可用于连接异源二聚体蛋白的各种成分，包括但不限于图8和9A-C中的那些。在示例性实施方式中，将抗TIM-3scFv 连接至第一Fc结构域和将IL-15Rα(sushi)结构域连接至第二Fc结构域的结构域连接子分别是抗体铰链结构域。

任何有用的结构域连接子都可用于连接异源二聚体蛋白的各种成分，包括但不限于图8和9A-C中的那些。在示例性的实施方式中，将抗TIM-3scFv连接至第一Fc结构域并将IL-15Rα(sushi)结构域连接至第二Fc结构域的结构域连接子，并且各自是抗体铰链结构域(例如，抗体铰链结构域)。

在一些实施方式中，抗TIM-3scFv包括通过scFv连接子共价连接可变轻结构域(VL)的可变重结构域(VH)(例如，图9A-C)。在一个实施方式中，抗 TIM-3scFv是从N端到C端的VH-scFv连接子-VL。在另一个实施方式中，抗 TIM-3scFv是从N端到C端的VL-scFv连接子-VH。抗TIM-3scFv的C端通过结构域连接子(例如抗体铰链结构域)连接至第一Fc结构域的N端。

在dsIL-15/RαX scFv格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12和13A-C所示的任何可变的重和轻结构域对。

在dsIL-15/RαX scFv格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的任何可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X dsIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其从N端至C端包含抗- TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，而IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；c)一种IL-15变体，包括一个半胱氨酸残基的氨基酸取代物，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成一个二硫键，并且抗TIM-3scFv包含3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在dsIL-15/RαX scFv格式中，一个优选实施方式利用IL-15N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体，以及适当的半胱氨酸取代。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X dsIL-15/Reα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C 端包含抗-TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，而IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；c)一个IL-15变体，其中包括一个半胱氨酸残基的氨基酸取代基，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成一个二硫键，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、 D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图 12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中的任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一个示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中任何TIM-3ABD 的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在dsIL-15/RαX scFv格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体,以及适当的半胱氨酸取代。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X dsIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其从 N端至C端包含抗-TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，而IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；c)一个IL-15变体，包括一个半胱氨酸残基的氨基酸取代物，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成一个二硫键，其中抗-TIM-3scFv包含3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体包含氨基酸取代 N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在一个特定的实施方式中，IL- 15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/N65D，并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且scFv 包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。

在dsIL-15/RαXscFv格式中，一个优选实施例利用偏斜变体对 S364K/E357Q：L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X dsIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含抗-TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2- CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi) 结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域，而 IL-15Rα(Sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和c)一个IL-15变体，其中包括一个半胱氨酸残基的氨基酸取代基，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成一个二硫键，并且第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc 结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X dsIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含抗 -TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域； b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域，并且IL-15Rα(Sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；c)IL-15变体，其中包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对 S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。在示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中任何TIM-3ABD的 VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中的任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一个示例性实施方式中，TIM- 3scFv包括图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在dsIL-15/RαX scFv格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的任何可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1和偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL- 15Rα异源二聚体蛋白是“scFv XdsIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括： a)第一单体，其由N端到C端包含抗-TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域，并且IL-15Rα(Sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和c)IL-15 变体，包括一个半胱氨酸残基的氨基酸取代物，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键，其中抗-TIM-3 scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。

在dsIL-15/RαX scFv格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体,以及适当的半胱氨酸取代。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X dsIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含抗 -TIM-3scFv-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域； b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域，并且IL-15Rα(Sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和c)IL-15变体，包括一个半胱氨酸残基的氨基酸取代物，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键，其中抗-TIM-3scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、 D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc 结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体 S364K/E357Q。在一个特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D、并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且scFv包括 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。

在dsIL-15/RαX scFv格式中，一个优选实施方式利用在同时存在于第一和第二单体上的偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D、消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，和可选地在第一单体和第二单体上都存在428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X dsIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其从N端至C端包含抗- TIM-3scFv-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域，而IL-15Rα(Sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和c)IL-15变体，其中包括半胱氨酸残基的氨基酸取代物，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键，其中变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc 结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括 FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一变体Fc结构域包括pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且所示编号根据EU编号进行。在一些实施方式中，第一单体和第二单体的铰链也各自包含氨基酸取代C220S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体 M428L/N434S。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、 D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图 12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中的任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一个示例性实施方式中，TIM-3scFv包括图12和13A-C中任何TIM-3ABD 的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在dsIL-15/RαX scFv格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12与图21C格式所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM- 3]_H1_L2.1，偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S，pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D，同时存在于第一和第二单体上的消除变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及同时存在于第一和第二单体上的可选428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scFv X dsIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其从N端至C端包含抗- TIM-3scFv-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域，而IL-15Rα(Sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和c)IL-15变体，其中包括半胱氨酸残基的氨基酸取代物，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键，其中抗-TIM-3scFv包含3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一变体Fc结构域包括pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且所示编号根据EU编号进行。在一些实施方式中，第一单体和第二单体的铰链也各自包含氨基酸取代C220S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在一个特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D、并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且scFv包括 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在又一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。

D.scIL-15/RαXFab

此实施方式示于图21D，并且包括三个单体。第一单体由N端到C端包含 IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-变体IL-15-结构域连接子-CH2-CH3，并且第二单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第三单体是轻链VL-CL。这通常称为“scIL-15/Rα×Fab”，其中“sc”代表“单链”。scIL-15/RαX Fab格式(请参阅图21D)包含IL-15Rα(sushi)，IL-15Rα(sushi)通过可变长度连接子与变体IL- 15融合(称为“scIL-15/Rα”)，然后将其与异源二聚体Fc区的N端融合(包括铰链)。第二单体是重链，VH-CH1-铰链-CH2-CH3，而相应的轻链(第三单体)被分别转染以与VH形成Fab。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL-15/Rα XFab”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-CH1- 铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域，和c)轻链,其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变轻结构域，其中VH 和VL形成TIM-3结合结构域。任何有用的结构域连接子都可用于连接异源二聚体蛋白的各种成分，包括但不限于图8和9A-C中的那些。在示例性实施方式中，将IL-15变体连接至第一Fc结构域的结构域连接子是抗体铰链结构域 (例如，抗体铰链结构域)。

在scIL-15/RαX Fab格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12和13A-C所示的任何可变的重和轻结构域对。

在scIL-15/RαX Fab格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1。

在一个实施方式中、2A11_H1.144_L2.142靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL-15/RαX Fab”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到 C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，CH2-CH3是第二Fc结构域，和c)轻链,其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变轻结构域，并且其中VH和VL分别是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在scIL-15/RαX Fab形式中，一个优选的实施方式利用IL-15变体，其包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL-15/RαX Fab”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域- (结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一 Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中 VH是可变重结构域，CH2-CH3是第二Fc结构域，和c)轻链,其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变轻结构域，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，并且其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何 TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和 VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中， VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在scIL-15/RαX Fab格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL-15/RαX Fab”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中 CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-CH1-铰链 -CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域，和c) 轻链,其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变轻结构域，其中VH和VL 是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，并且其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在scIL-15/RαXFab格式中，一个优选实施方式使用偏斜变体对 S364K/E357Q：L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL-15/RαXFab”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由 N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，而CH2- CH3是第二变体Fc结构域，和c)轻链，其由N端到C端包含VL-VC，其中 VL是可变轻结构域，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，并且其中第一和第二变异Fc结构域包括偏斜变异对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体 Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。在示例性实施方式中，VH和VL是图 12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何 TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和 VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL-15/Rα XFab”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH- CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，而CH2-CH3是第二变体Fc 结构域，和c)轻链，其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变轻结构域，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。

在scIL-15/RαX Fab格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的任何可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1和偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL- 15Rα异源二聚体蛋白是“scIL-15/RαXFab”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a) 第一单体，其包括从N-至C端，IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15 变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，而CH2-CH3是第二变体Fc结构域，和c)轻链，其由N端到C端包含VL- VC，其中VL是可变轻结构域，其中VH和VL分别是3H3[TIM-3]_H1_L2.1 的可变重结构域和可变轻结构域，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。

在scIL-15/RαX Fab格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL-15/RαX Fab”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中 CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-CH1- 铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，而CH2-CH3是第二变体Fc结构域，和c)轻链，其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变轻结构域，其中VH 和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，而其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在scIL-15/RαX Fab格式中，一个优选的实施方式利用了在同时存在于第一和第二单体上的偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D、消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，并且可选地在第一单体和第二单体上都存在428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL-15/Rα XFab”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH- CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，而CH2-CH3是第二变体Fc 结构域，和c)轻链，其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变轻结构域，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一变体Fc结构域包括pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且所示编号根据EU编号进行。在一些实施方式中，第一单体的铰链还包括氨基酸取代 C220S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和 VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C 中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的 VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在scIL-15/RαX Fab格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12与图21D格式所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S，pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D，同时存在于第一和第二单体上的消除变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及同时存在于第一和第二单体上的可选428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL-15/Rα XFab”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH- CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，而CH2-CH3是第二变体Fc 结构域，和c)轻链，其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变轻结构域，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域分别包括FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第一变体Fc结构域包括pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且其中所述编号根据EU编号。在一些实施方式中，第一单体的铰链还包括氨基酸取代C220S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在一个特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、并且scFv包括 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。在又一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且scFv包括3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。

E.Fab X ncIL-15/Rα

此实施方式示于图21E，并且包括四种单体。第一单体由N端到C端包含 IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，并且第二单体包含重链VH- CH1-铰链-CH2-CH3。第三单体是轻链，其由N端到C端包含可变轻区(VL)和轻恒定区(CL)。第四单体是变体IL-15结构域。这通常被称为“Fab X ncIL- 15/Rα”，其中“nc”代表“非共价”，是指IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域的自组装非共价连接。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X ncIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- CH1-铰链-CH2-CH3，其中V H为可变重结构域，并且CH2-CH3为第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其由N端到C 端包含VL-VC，其中VL是可变的轻结构域，和d)第四单体，其包含IL-15变体，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物。任何有用的结构域连接子都可用于连接异源二聚体蛋白的各种成分，包括但不限于图8和9A-C中的那些。在示例性实施方式中，将 IL-15Rα(sushi)结构域连接至第二Fc结构域的结构域连接子是抗体铰链结构域 (例如，抗体铰链结构域)。

在Fab X ncIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的任何可变的重和轻结构域对。

在Fab X ncIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变的重和轻结构域对。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X ncIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中V H是可变重结构域，并且CH2-CH3是第一 Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变的轻结构域，和d)第四单体，其包含IL-15变体，其中VH和VL分别为3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，并且其中IL-15和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物。

在Fab X ncIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用IL-15变体，其包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2- CH3，其中V H是可变重结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变的轻结构域，和d)第四单体，其包含IL-15变体，其中VH和VL 形成TIM-3结合结构域，其中IL-15和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，并且其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何 TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中， VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在Fab X ncIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其由N端到C端包含 VL-VC，其中VL是可变的轻结构域，和d)第四单体，其包含IL-15变体，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15和IL-15Rα(sushi)结构域形成 IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且 VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在Fab X ncIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用歪斜变体对 S364K/E357Q：L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X ncIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中V H是可变重结构域，而CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)第三单体，其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变的轻结构域，和d)第四单体，其包含IL-15变体，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，并且第一和第二变异Fc 结构域包括偏斜变异对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X ncIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- CH1-铰链-CH2-CH3，其中V H是可变重结构域，而CH2-CH3是第一变体Fc 结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)第三单体，其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变的轻结构域，和d)第四单体，其包含IL- 15变体，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15和IL-15Rα(sushi) 结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、 D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc 结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体 S364K/E357Q。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM- 3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH 和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在Fab X ncIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变的重和轻结构域对和偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中V H是可变重结构域，而CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)第三单体，其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变的轻结构域，和d)第四单体，其包含IL-15变体，其中VH和VL分别为3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，并且其中第一和第二变异Fc结构域包括偏斜变异对 S364K/E357Q：L368D/K370S。

在Fab X ncIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X ncIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中V H是可变重结构域，而CH2-CH3是第一变体 Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)第三单体，其由 N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变的轻结构域，和d)第四单体，其包含 IL-15变体，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1 的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、 D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc 结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体 S364K/E357Q。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中， IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在Fab X ncIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了在同时存在于第一和第二单体上的偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D、消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，并且可选地在同时存在于第一和第二单体上的428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X ncIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，而CH2-CH3是第一变体 Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)第三单体，其由 N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变的轻结构域，和d)第四单体，其包含 IL-15变体，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体 L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链-第一变体Fc结构域包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且其中所示编号根据 EU编号。在一些实施方式中，第二单体的铰链还包括氨基酸取代C220S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体 M428L/N434S。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、 D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和 13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何 TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和 VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在Fab X ncIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12与图21E格式所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S，pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D，同时存在于第一和第二单体上的消除变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及同时存在于第一和第二单体上的可选428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X ncIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中V H是可变重结构域，而CH2-CH3是第一变体 Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)第三单体，其由 N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变的轻结构域，和d)第四单体，其包含 IL-15变体，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1 的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体 L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域分别包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第一单体的铰链-第一变体Fc结构域包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且其中所示编号根据EU编号。在一些实施方式中，第二单体的铰链还包括氨基酸取代C220S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体 M428L/N434S。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中， IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

F.Fab X dsIL-15/Rα

此实施方式示于图21F，并且包括四个单体。第一单体由N端到C端包含 IL-15Rα(sushi)结构域-结构域连接子-CH2-CH3，其中IL-15Rα(sushi)结构域被工程化成含有半胱氨酸残基，并且第二单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第三单体是轻链，其由N端到C端包含可变轻区(VL)和恒定轻区(CL)。第三单体是变体IL-15结构域，也被工程化成具有半胱氨酸残基，使得在天然细胞条件下形成二硫桥键。这通常被称为“Fab X dsIL-15/Rα”，其中“ds”代表“二硫键”。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X dsIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-铰链-CH2-CH3，其中V H为可变重结构域且CH2-CH3为第一Fc结构域； b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，并且IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；c)第三单体，其由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域；和d)IL-15变体，其包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，其中VH 和VL形成TIM-3结合结构域，并且其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL- 15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键。任何有用的结构域连接子都可用于连接异源二聚体蛋白的各种成分，包括但不限于图8和9A-C中的那些。在示例性实施方式中，将IL-15Rα(sushi)结构域连接至第二Fc结构域的结构域连接子是抗体铰链结构域(例如，抗体铰链结构域)。

在Fab X dsIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的任何可变的重和轻结构域对。

在Fab X dsIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变的重和轻结构域对。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X dsIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-铰链-CH2-CH3，其中VH为可变重结构域且CH2-CH3为第一Fc结构域； b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，而IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；c)第三单体，其由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域；和d)IL-15变体，其中包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，其中VH 和VL分别是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，并且其中 IL-15变体上的半胱氨酸残基与IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键。

在Fab X dsIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用IL-15变体，其包括具有氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，以及适当的半胱氨酸氨基酸取代。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X dsIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由 N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中V H为可变重结构域且CH2-CH3为第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，而IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；c)第三单体，其由N端到C端包含VL- CL，其中VL是可变轻结构域；和d)IL-15变体，其包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键，并且其中IL-15 变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和 VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C 中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D。

在Fab X dsIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有图12所示的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体，并带有适当的半胱氨酸氨基酸取代。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X dsIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中V H为可变重结构域且 CH2-CH3为第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi) 结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域，而IL- 15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；c)第三单体，其由N端到 C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域；和d)IL-15变体，其包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中 IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中， IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1 的可变重结构域和可变轻结构域。

在Fab X dsIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X dsIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，而CH2- CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi) 结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域，而IL-15Rα(Sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；c)第三单体，其由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域；和d)IL-15变体，其包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15 变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q： L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X dsIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，而CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域，而IL-15Rα(Sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；c)第三单体，其由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域；和d)IL-15变体，其包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和 IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，并且第一和第二变体 Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的 VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL- 15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在Fab X dsIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变的重和轻结构域对和偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X dsIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中V H是可变重结构域，而 CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域的变体，而IL-15Rα(Sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；c)第三单体，其由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域；和d)IL-15变体，其中包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，其中VH和VL分别是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。

在Fab X dsIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X dsIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链- CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，而CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b) 第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域，而IL-15Rα(Sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；c)第三单体，其由N端到C端包含VL-CL，其中 VL是可变轻结构域；和d)IL-15变体，其包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL- 15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键，其中VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，其中第一和第二变异Fc结构域包括偏斜变异对S364K/E357Q：L368D/K370S。在特定的实施方式中，IL-15 变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在Fab X dsIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了在同时存在于第一和第二单体上的偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D、消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，和可选地在同时存在于第一和第二单体上的428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X dsIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-铰链-CH2-CH3，其中V H是可变重结构域，而CH2-CH3是第一变体Fc 结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域，而IL-15Rα(Sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；c)第三单体，其由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域；和d)IL-15变体，其包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和 IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且所示编号根据EU编号。在一些实施方式中，第二单体的铰链还包括氨基酸取代C220S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体 M428L/N434S。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、 D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和 13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何 TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和 VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在Fab X dsIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12与图21F格式所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S，pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，同时存在于第一和第二单体上的消除变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及同时存在于第一和第二单体上的可选428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“Fab X dsIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，而CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域，而IL-15Rα(Sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；c)第三单体，其由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域；和d)IL-15变体，其包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和 IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键，其中VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变异Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体 S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域分别包括FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且所示编号根据EU编号进行。在一些实施方式中，第二单体的铰链还包括氨基酸取代C220S。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中， IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1 的可变重结构域和可变轻结构域。

G.mAb-scIL-15/Rα

此实施方式示于图21G，并且包括三种单体(不过融合蛋白是四聚体)。第一单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第二单体包含具有scIL-15复合物的重链、VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域连接子-IL-15Rα(sushi)结构域-结构域连接子-IL-15变体。第三(和第四)单体是轻链VL-CL。这通常被称为“mAb-scIL- 15/Rα”，其中“sc”代表“单链”。其与TIM-3分子二价结合。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C 端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的 VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物。任何有用的结构域连接子都可用于连接异源二聚体蛋白的各种成分，包括但不限于图8和9A-C中的那些。

在mAb-scIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用具有如图12所示的任何可变的重和轻结构域对的抗TIM-3ABD。

在mAb-scIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变的重和轻结构域对。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL- 15/Rα"格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C 端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)第三和第四单体，其每一个都由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物。

在mAb-scIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用IL-15变体，该变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链 -CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二Fc结构域和；c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的 VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，并且其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何 TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和 VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中， VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在mAb-scIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL-15/Rα“格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链- CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)- IL-15变体，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH 和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体包含氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且 VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在mAb-scIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对 S364K/E357Q：L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc 结构域；和c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D和K370S，并且第二变体 Fc结构域包括偏斜变体S364K和E357Q。在示例性实施方式中，第一变体Fc 结构域包括偏斜变体S364K和E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体 E357Q L368D和K370S。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N 端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的 VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D和K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K和E357Q。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K和E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D和K370S。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和 VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中， VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和 13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D。

在mAb-scIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变的重和轻结构域对和偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc 结构域；和c)第三和第四单体，其每一个都由N端到C端包含VL-CL，其中 VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL分别是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi) 结构域形成IL-15复合物，第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对 S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D和K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K和 E357Q。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K和 E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D和K370S。

在mAb-scIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，和偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S，以及IL-15N4D/N65D变体或IL-15 D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在一个实施方式中，靶向的 IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3- (结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2- CH3是第二变体Fc结构域；和c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含 VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二 TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中 IL-15变体包含氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q： L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D 和K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K和E357Q。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中， IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1 的可变重结构域和可变轻结构域。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D和K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K 和E357Q。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K和 E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D和K370S。

在mAb-scIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用偏斜变体组 S364K/E357Q：L368D/K370S，pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D和/ 或Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，同时存在于第一和第二单体上的消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及同时存在于第一和第二单体上的 428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N 端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的 VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体 L368D/K370S，第二变体Fc结构域包含偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代 N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且第二单体的铰链第二变体Fc结构域包括pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，和其中所述编号根据EU编号进行。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N 端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的 VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体 L368D/K370S，第二变体Fc结构域包含偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代 N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)第三和第四单体，其各自由N 端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的 VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成 IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，第二变体 Fc结构域包含偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第二单体的铰链-第二变体Fc结构域包括pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，并且所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C 端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域 -(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和 IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体 S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包含偏斜变体对L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链-第一变体Fc结构域包括pI取代 Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，并且第二单体的铰链-第二变体Fc结构域包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，和其中所示编号根据EU编号进行。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb- scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由 N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体 S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包含偏斜变体对L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代 Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，并且所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)第三和第四单体，其各自由N 端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的 VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成 IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，第二变体 Fc结构域包含偏斜变体对L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链-第一变体Fc结构域包括pI取代Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，并且第二单体的铰链-第二变体Fc结构域包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，和其中所示编号根据EU编号进行。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在示例性实施方式中， IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和 VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中， VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D。

在mAb-scIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12与图21G格式所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S，pI变体 N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D和/或Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，同时存在于第一和第二单体上的消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及同时存在于第一和第二单体上的可选428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N 端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的 VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1 的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体 L368D/K370S，第二变体Fc结构域包含偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代 N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且第二单体的铰链第二变体Fc结构域包括pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，和其中所述编号根据EU编号进行。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N 端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的 VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1 的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体 L368D/K370S，第二变体Fc结构域包含偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代 N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，其中所述编号根据EU编号进行。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)- IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的 VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包含偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第二单体的铰链-第二变体Fc结构域包括pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，并且所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N 端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b) 第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc 结构域；和c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对 L368D/K370S，其中第一和第二变异Fc结构域各自包含FcKO变异 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链-第一变异Fc结构域包含pI取代Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，第二单体的铰链第二变体 Fc结构域包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，其中所述编号根据EU编号进行。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C 端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域 -(结构域连接子)-IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1 的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体 S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包含偏斜变体对L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代 Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，其中所述编号根据EU编号进行。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-scIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)- IL-15变体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对L368D/K370S，其中第一和第二变异Fc结构域各自包含FcKO变异E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第二单体的铰链-第一变异Fc结构域包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，其中所述编号根据EU编号进行。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在特定的实施方式中，IL-15 变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

H.mab-ncIL-15/Rα

此实施方式示于图21H，并且包括四种单体(不过异源二聚体融合蛋白是五聚体)。第一单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第二单体包含具有IL- 15Rα(sushi)结构域的重链：例如VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域连接子-IL- 15Rα(sushi)结构域。第三单体是变体IL-15结构域。第四(和第五)单体是轻链 VL-CL。这通常称为“mAb-ncIL-15/Rα”，其中“nc”代表“非共价”。其也与TIM- 3二价结合。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C 端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和 IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物。任何有用的结构域连接子都可用于连接异源二聚体蛋白的各种成分，包括但不限于图8和9A-C中的那些。

在mAb-ncIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的任何可变的重和轻结构域对。

在mAb-ncIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变的重和轻结构域对。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C 端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL是可变的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的重结构域和可变轻结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL分别是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物。

在mAb-ncIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用IL-15变体，该变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链- CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2- CH3是第二Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的 VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何 TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在mAb-ncIL-15/Rα中，一个优选实施方式利用抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链- CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，并且其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D 或D30N/E64Q/N65D。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且 VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在mAb-nc-IL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对 S364K/E357Q：L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含 VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM- 3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q： L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体 L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。在另一示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N 端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15 变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。在另一示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和 VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中， VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和 13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D。

在mAb-ncIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变的重和轻结构域对和偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c) 包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含 VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL分别为3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第二单体的 VH和第五单体的VL分别为3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中第一和第二Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。

在mAb-ncIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，和偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S，以及IL-15N4D/N65D变体或IL-15 D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3- (结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域、IL- 15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。在一个示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且 VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在mAb-ncIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用偏斜变体组 S364K/E357Q：L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D和/ 或Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K、在第一和第二单体上都存在的消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及可选的在第一和第二单体上都存在的 428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由 N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中 IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体 L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代 N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D和第二单体的第二变体Fc结构域包括pI 变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，并且所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并在其中所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c) 包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含 VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM- 3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对 S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第二单体的铰链第二变体Fc结构域包括pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，其中所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链 -CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C 端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和 d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi) 结构域形成IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链-第一变体Fc结构域包括pI取代Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K并且第二单体的铰链-第二变体Fc结构域包括pI变体 N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和 IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，其中所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由 N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b) 第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c) 包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM- 3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对 L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域各自包含FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第二单体的铰链第二变体Fc结构域包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，其中所示编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C 中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的 VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在mAb-ncIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12与图21H格式所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S，pI变体 N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D和/或Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，同时存在于第一和第二单体上的消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及同时存在于第一和第二单体上的可选428L/434S变体。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由 N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中 IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1 的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体 L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代 N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D和第二单体的第二变体Fc结构域包括pI 变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，并且所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和 IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由 N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b) 第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c) 包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含 VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM- 3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对 S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第二单体的第二变体Fc结构域包括 pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，并且所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链- CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C 端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和 d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi) 结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K和第二单体的第二变体Fc结构域包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c) 包含IL-15变体的第三单体；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含 VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM- 3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对 L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，并且所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-ncIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链 -CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C 端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)包含IL-15变体的第三单体；和 d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi) 结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第二单体的第二变体Fc结构域包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且所示编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

I.mAb-dsIL-15/Rα

此实施方式示于图21I，并且包括四种单体(不过异源二聚体融合蛋白是五聚体)。第一单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第二单体包含具有IL- 15Rα(sushi)结构域的重链：例如VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域连接子-IL- 15Rα(sushi)结构域，其中IL-15Rα(sushi)结构域被工程化成含有半胱氨酸残基。第三单体是变体IL-15结构域，其已被工程化成含有半胱氨酸残基，使得IL-15 复合物在生理条件下形成。第四(和第五)单体是轻链VL-CL。这通常称为“mAb-dsIL-15/Rα”，“ds”代表“二硫键”，它与TIM-3双价结合。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL- 15/Rα格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其包括从N端到C端的 VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其包括从 N端到C端的VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且 CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；d)第四和第五单体，其各自从N端到C端包括VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM- 3结合结构域，并且IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα上的半胱氨酸残基 (sushi)结构域形成二硫键。任何有用的结构域连接子都可用于连接异源二聚体蛋白的各种成分，包括但不限于图8和9A-C中的那些。

在mAb-dsIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的任何可变的重和轻结构域对。

在mAb-ds IL-15/Rα中，一个优选实施方式利用抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C 端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2- CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL是可变的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的重结构域和可变轻结构域，其中第二单体的VH 和第五单体的VL分别是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键。

在mAb-ds IL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了IL-15变体，其包括具有适当的半胱氨酸氨基酸取代的氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到 C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域 -(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C 端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的 VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和 13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何 TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和 VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在mAb-dsIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有图12所示的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体，并带有适当的半胱氨酸氨基酸取代。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15 变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的 VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在特定的实施方式中， IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在mAb-dsIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对 S364K/E357Q：L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)第三单体，其包括 IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH 和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体 Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。在另一示例性实施方式中，第一变体 Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体 L368D/K370S。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N 端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且 CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的 VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，并且第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体 S364K/E357Q。在另一示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体 S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和 VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C 中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D。

在mAb-dsIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变的重和轻结构域对和偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)第三单体，其包括 IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变的轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL是可变的分别为3H3[TIM-3]_H1_L2.1的重结构域和可变轻结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL分别为3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中半胱氨酸IL-15变体上的残基与IL-15Rα(sushi)结构域上的半胱氨酸残基形成二硫键，其中第一和第二Fc 结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。

在mAb-dsIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体和适当的半胱氨酸取代。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该 IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由 N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的 VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL- 15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D、D30N/N65D，或D30N/E64Q/N65D，并且其中第一和第二变体Fc 结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。在一个示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL 是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中， IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1 的可变重结构域和可变轻结构域。

在mAb-ds中IL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用偏斜变体组 S364K/E357Q：L368D/K370S，pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D和/ 或Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，同时存在于第一和第二单体上的消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及可选的同时存在于第一和第二单体上的428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C 端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2- CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM- 3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体 L368D/K370S，第二变体Fc结构域包含偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代 N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，第二单体的铰链第二变体Fc结构域包括 pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，其中所述编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含 VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一 TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N 端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi) 结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL- 15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第二单体的铰链-第二变体Fc结构域包括pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，并且所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链- CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一 TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，第二单体的铰链第二变体Fc结构域包括pI变体 N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且其中所述编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含 VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且所示编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N 端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL- 15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域分别包括FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第二单体的铰链第二变体Fc结构域包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且所示编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，IL-15 变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和 VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C 中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D。

在mAb-dsIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12与图21I格式所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S，pI变体 N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D和/或Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，同时存在于第一和第二单体上的消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及同时存在于第一和第二单体上的可选428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL- 15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH- 铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C 端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2- CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM- 3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包含偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，第二单体的铰链第二变体Fc结构域包括pI变体 Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，并且其中所述编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含 VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一 TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包含偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且其中所述编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b) 第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15 变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包含偏斜变体对 S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第二单体的铰链第二变体Fc结构域包括 pI变体Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，并且其中所述编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链- CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包含偏斜变体对L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，第二单体的铰链第二变体Fc结构域包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且其中所述编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL-15/Rα”格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b) 第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15 变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；和d)第四和第五单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的 VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基结构域形成二硫键，其中VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包含偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包含偏斜变体对 L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域分别包含FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一单体的铰链第一变体Fc结构域包括pI取代Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K，并且其中所述编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“mAb-dsIL- 15/Rα格式异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其包括从N端到C端的 VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其包括从 N端到C端的VH-铰链-CH2-CH3-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)，其中IL-15Rα(sushi)结构域包括半胱氨酸残基的氨基酸取代，并且 CH2-CH3是第二Fc结构域；c)第三单体，其包括IL-15变体，该IL-15变体包括半胱氨酸残基的氨基酸取代；d)第四和第五单体，其各自从N端到C端包括 VL-CL，其中VL是可变轻结构域，其中第一单体的VH和第四单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第五单体的VL形成第二TIM- 3结合结构域，其中IL-15变体上的半胱氨酸残基和IL-15Rα(sushi)上的半胱氨酸残基)结构域形成二硫键，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域、其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第二单体的铰链-第二变体Fc结构域包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和 VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

J.中央-IL-15/Rα

此实施方式示于图21J中，并且包含四种单体形成的四聚体。第一单体包含VH-CH1-[可选的结构域连接子]-IL-15变体-[可选的结构域连接子]-CH2-CH3，其中第二可选的结构域连接子有时是铰链结构域。第二单体包含VH-CH1-[可选的结构域连接子]-IL-15Rα(sushi)结构域-[可选的结构域连接子]-CH2-CH3，其中第二可选的结构域连接子有时是铰链结构域。第三(和第四)单体是轻链VL- CL。其通常被称为“中央-IL-15/Rα”。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央IL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH 和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的V1和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，并且其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物。任何有用的结构域连接子都可用于连接异源二聚体蛋白的各种成分，包括但不限于图8和9A-C中的那些。在示例性实施方式中，将IL-15变体连接至第一Fc结构域和将IL-15Rα(sushi)结构域连接至第二Fc结构域的结构域连接子各自是抗体铰链结构域。

在中央IL-15/Rα形式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的任何可变的重和轻结构域对。

在中央IL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央IL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自包含从N-至C端的VL-CL，其中第一单体的VH 和第三单体的VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL分别是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，并且IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物。

在“中央IL-15/Rα”格式中，一个优选的实施方式利用IL-15变体，其包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央IL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由 N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)- CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由 N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM- 3结合结构域，其中第二单体的Vβ和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，并且其中IL-15 变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和 VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C 中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D。

在中央IL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央IL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域； b)第二单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域- (结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的 VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL分别是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重链结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和 VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在中心-IL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用偏斜变体对S364K/E357Q: L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央IL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C 端包含VH-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2- CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc 结构域；和d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的 VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL- 15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K和E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D 和K370S。在另一示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体 L368D和K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K和E357Q。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央IL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH 和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体包括氨基氨基酸取代N4D/N65D、 D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc 结构域包括偏斜变体S364K和E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体 L368D和K370S。在另一示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D和K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K和E357Q。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和 VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中， VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和 13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/E64Q/N65D。

在中央IL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变的重和轻结构域对和偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央IL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL分别为3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL分别为3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL- 15变体和IL-15Rα(sushi(Sushi)结构域形成IL-15复合物，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。

在中央IL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体和合适的半胱氨酸取代。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央IL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和d) 第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的 VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成 IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D，其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对 S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K和E357Q，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体L368D和 K370S。在另一示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D 和K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K和E357Q。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体 M428L/N434S。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在中央IL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了偏斜变体组 S364K/E357Q：L368D/K370S，pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，在同时存在于第一和第二单体上的消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，并且可选地在第一单体和第二单体上都存在428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央IL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-(结构域连接子)-IL-15变体-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体 Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域；和 d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体和第四单体的VL 形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL- 15复合物，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc 结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第一变体Fc结构域包括pI 取代Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且其中所述编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央IL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15变体-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM- 3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域分别包括FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第二单体的第二变体Fc结构域包括 pI取代Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且所示编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体 M428L/N434S。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、 D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中， VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和 13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何 TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在中央IL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12与图21K所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S，pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，同时存在于第一和第二单体上的消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及同时存在于第一和第二单体上的可选428L/434S变体。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央IL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15变体-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(铰链)-CH2-CH3，其中 CH2-CH3是第二变异Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中 IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是可变重链3H3[TIM-3]_H1_L2.1的轻结构域和可变轻结构域、其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对 S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括FcKO变体 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第一变体Fc结构域包括pI取代 Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且其中所述编号根据EU编号。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央IL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL- 15变体-(铰链)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(铰链)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由 N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM- 3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和 VL是可变重链3H3[TIM-3]_H1_L2.1的轻结构域和可变轻结构域、其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，第二变体Fc结构域包括偏斜变体对 L368D/K370S，其中第一和第二变体Fc结构域分别包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第二单体的第二变体Fc结构域包括 pI取代Q295E/N384D/Q418D/N421D，并且所示编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体 M428L/N434S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和 VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

K.中央-scIL-15/Rα

这个实施方式示于图21K中，并且包含形成四聚体的四种单体。第一单体包含VH-CH1-[可选的结构域连接子]-IL-15Rα(sushi)结构域-结构域连接子-IL-15 变体-[可选的结构域连接子]-CH2-CH3，其中第二可选的结构域连接子有时是铰链结构域。第二单体包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第三(和第四)单体是轻链 VL-CL。这通常被称为“中央-scIL-15/Rα”，其中“sc”代表“单链”。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央-scIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的V1和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，并且其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成 IL-15复合物。任何有用的结构域连接子都可用于连接异源二聚体蛋白的各种成分，包括但不限于图8和9A-C中的那些。在示例性实施方式中，将IL-15变体连接至第一Fc结构域的结构域连接子是抗体铰链结构域。

在中央IL-sc15/Rα形式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的任何可变的重和轻结构域对。

在中央scIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央-scIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自包含从N-至C端的VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL分别是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL分别是7G8_H3.30_L1.34的可变重结构域和可变轻结构域，并且其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物。

在中央-scIL-15/Rα形式中，一个优选的实施方式利用IL-15变体，其包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央-scIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL- 15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中 CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链- CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由 N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM- 3结合结构域，其中第二单体的Vβ和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，并且其中IL-15 变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和 VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C 中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在中央scIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重和轻结构域对，以及IL-15 N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央scIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)- CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL 形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二 TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL分别是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重链结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL 是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中， IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1 的可变重结构域和可变轻结构域。

在中央-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央-scIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和 IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D和K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K和E357Q。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央-scIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由 N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH 和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中IL-15变体包括氨基氨基酸取代N4D/N65D、 D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc 结构域包括偏斜变体L368D和K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体 S364K和E357Q。在示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何 TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和 VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在中央scIL-15/Rα格式中，一个优选的实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变的重和轻结构域对和偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央-scIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自包含从N-至C端的VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL分别是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体和IL- 15Rα(sushi(Sushi)结构域形成IL-15复合物，并且其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D和K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K和E357Q。

在中央-scIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，和偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S，以及IL-15N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D 变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL- 15Rα异源二聚体蛋白是“中央-scIL-15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a) 第一单体，其由N端到C端包含VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体 Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2- CH3是第二变体Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含 VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15 变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL-15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D，其中第一和第二变体Fc结构域包括偏斜变体对L368D/K370S：S364K/E357Q。在示例性实施方式中，第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且 VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。

在中央-scIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了偏斜变体组 S364K/E357Q：L368D/K370S，pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，在同时存在于第一和第二单体上的消除变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，并且可选地在第一单体和第二单体上都存在428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央-scIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(铰链)- CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C 端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL 形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL- 15复合物，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S和第二变体Fc 结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域各自包括 FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一变体Fc结构域包括 pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且所示编号根据EU编号进行。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代 N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，VH和 VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C 中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的 VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在中央scIL-15/Rα格式中，一个优选实施方式利用了抗TIM-3ABD，其具有如图12与图21K格式所示的可变的重和轻结构域对3H3[TIM-3]_H1_L2.1，偏斜变体组S364K/E357Q：L368D/K370S，pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D，同时存在于第一和第二单体上的消除变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及同时存在于第一和第二单体上的可选428L/434S变体。

在一个实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“中央-scIL- 15/Rα”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其由N端到C端包含 VH-(结构域连接子)-IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(铰链)- CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C 端包含VH-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和d)第三和第四单体，其各自由N端到C端包含VL-CL，其中第一单体的VH和第三单体的VL形成第一TIM-3结合结构域，其中第二单体的VH和第四单体的VL 形成第二TIM-3结合结构域，其中IL-15变体和IL-15Rα(sushi)结构域形成IL- 15复合物，其中VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc每个结构域都包括 FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一变体Fc结构域包括 pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且所示编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一单体的铰链还包括变体C220S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在特定的实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D，并且VH和VL是 3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施方式中， IL-15变体包括氨基酸取代D30N/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域。在另一个实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D，并且VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1 的可变重结构域和可变轻结构域。

V.本发明的特别有用的实施方式

本发明提供了靶向IL-15/IL-15Rα-Fc异源二聚体蛋白，其包含至少两个单体，其中一个包含抗TIM-3ABD，另一个包含IL-15/RA复合物，使用异源二聚体Fc结构域连接。

在一些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域具有一组选自 S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S； L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411E/K360E/Q362E:D401K； L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q的氨基酸取代，根据EU 编号。

在一些情况下，根据EU编号，第一和/或第二变体Fc结构域具有包含 Q295E/N384D/Q418E/N421D的另外一组氨基酸取代。在一些情况下，第一和/ 或第二Fc结构域具有另外一组氨基酸取代，其由G236R/L328R、 E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、 E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del组成，根据EU编号。

在一些实施方式中，IL-15蛋白具有选自SEQ ID NO：1(全长人IL-15)和 SEQ IDNO：2(截短的人IL-15)的多肽序列，并且IL-15Rα蛋白具有选自SEQ ID NO：3(全长人IL-15Rα)和SEQ ID NO：4(人IL-15Rα的IL-15Rα(sushi)结构域)的多肽序列。

在实施方式中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白可以分别具有选自E87C: D96/P97/C98；E87C:D96/C97/A98；V49C:S40C；L52C:S40C；E89C:K34C； Q48C:G38C；E53C:L42C；C42S:A37C；和L45C:A37C的一组氨基酸取代。

在一些实施方式中，IL-15蛋白是具有选自以下序列的变体蛋白：图19和图20，以降低效能。在一些实施方式中，IL-15蛋白是在IL-15：CD132界面具有一个或多个氨基酸取代的变体蛋白。

在一些实施方式中，TIM-3抗原结合结构域包含抗TIM-3scFv或抗TIM- 3Fab。在示例性实施方式中，TIM-3ABD包括图12和图13A-C中描绘的任何 TIM-3ABD的VH和VL。

在示例性实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL- 15/RαXFab”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其从N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，此处的变体VH是可变重结构域，而CH2-CH3是第二变体Fc结构域，和c)轻链，其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变轻结构域，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15变体是IL-15 N4D/N65D变体，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域均包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一变体Fc结构域包括pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且所示编号根据EU编号。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在某些实施方式中，第一单体的铰链还包括氨基酸取代C220S，并且第一和第二变体Fc结构域各自还包括半衰期延长变体M428L/N434S。在一些实施方式中，VH和VL是图12或13A-C中的任何TIM-3ABD的可变重结构域和可变轻结构域。在一些实施方式中，VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域(图12)。

在示例性实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL- 15/RαXFab”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其从N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，而CH2-CH3是第二变体Fc结构域，和c)轻链，其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变轻结构域，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15变体是IL-15 D30N/N65D变体，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域均包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一变体Fc结构域包括pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且所示编号根据EU编号。在一些实施方式中，第一单体的铰链还包括氨基酸取代C220S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体M428L/N434S。在某些实施方式中，第一单体的铰链还包括氨基酸取代C220S，并且第一和第二变体Fc结构域各自还包括半衰期延长变体M428L/N434S。在一些实施方式中， VH和VL是图12或13A-C中的任何TIM-3ABD的可变重结构域和可变轻结构域。在一些实施方式中，VH和VL是3H3[TIM-3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域(图12)。

在示例性实施方式中，靶向的IL-15/IL-15Rα异源二聚体蛋白是“scIL- 15/RαXFab”格式的异源二聚体蛋白，其包括：a)第一单体，其从N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(结构域连接子)-CH2- CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其由N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，而CH2-CH3是第二变体Fc结构域，和c)轻链，其由N端到C端包含VL-VC，其中VL是可变轻结构域，其中VH和VL形成TIM-3结合结构域，其中IL-15变体是IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，其中第一变体Fc结构域包括偏斜变体L368D/K370S，第二变体Fc结构域包括偏斜变体S364K/E357Q，其中第一和第二变体Fc结构域均包括FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第一变体Fc结构域包括pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D，并且所示编号根据EU编号。在一些实施方式中，第一单体的铰链还包括氨基酸取代C220S。在某些实施方式中，第一和第二变体Fc结构域各自进一步包括半衰期延长变体 M428L/N434S。在某些实施方式中，第一单体的铰链还包括氨基酸取代C220S，并且第一和第二变体Fc结构域各自还包括半衰期延长变体M428L/N434S。在一些实施方式中，VH和VL是图12或13A-C中的任何TIM-3ABD的可变重结构域和可变轻结构域。在一些实施方式中，VH和VL是3H3[TIM- 3]_H1_L2.1的可变重结构域和可变轻结构域(图12)。

可以包含在“scIL-15/RαX Fab”格式的异源二聚体蛋白中的有用“主链”序列如图10所示。在一些实施方式中，“scIL-15/RαX Fab”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(铰链)-CH2-CH3，其中铰链-CH2-CH3具有图10中“主链1”的链 2的氨基酸序列(SEQ ID NO：XXX)；b)第二单体，其由N端到C端包含VH- CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，并且CH1-铰链-CH2-CH3具有图10中“主链1”的链1的氨基酸序列(SEQ ID NO：XXX)，以及c)由N端到 C端包含VL-VC的轻链，其中VL是可变轻结构域，而VC具有图11中的“恒定轻链-κ”的序列(SEQ IDNO：XXX)。在某些实施方式中，“scIL-15/RαX Fab”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi) 结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(铰链)-CH2-CH3，其中铰链-CH2-CH3具有图10中“主链2”的链2的氨基酸序列(SEQ ID NO：XXX)；b)第二单体，其由 N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，CH1-铰链-CH2-CH3具有图10中“主链2”的链1的氨基酸序列(SEQ ID NO：XXX)，以及c)由N端到C端包含VL-VC的轻链，其中VL是可变轻结构域，而VC具有图11中的“恒定轻链-κ”的序列(SEQ ID NO：XXX)。在一些实施方式中，“scIL-15/RαX Fab”格式的异源二聚体蛋白包括：a)第一单体，其由N端到C端包含IL-15Rα(sushi)结构域-(结构域连接子)-IL-15变体-(铰链)-CH2-CH3，其中铰链-CH2-CH3具有图10中“主链3”的链2的氨基酸序列(SEQ ID NO：XXX)； b)第二单体，其由N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是可变重结构域，CH1-铰链-CH2-CH3具有图10(SEQ ID NO：XXX)中“主链3”的链1 的氨基酸序列(SEQ ID NO：XXX)，以及c)由N端到C端包含VL-VC的轻链，其中VL是可变轻结构域，而VC具有图11中的“恒定轻链-κ”的序列(SEQID NO：XXX)。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、 D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中，IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D。在示例性实施方式中， VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代N4D/N65D。在另一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代 D30N/N65D。在又一示例性实施方式中，VH和VL是图12和13A-C中任何 TIM-3ABD的VH和VL，并且IL-15变体包括氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

特别优选的靶向TIM-3的IL-15/IL-15Rα-Fc异源二聚体融合蛋白包括XENP27974、XENP27979、XENC1000、XENC1001、XENC1002和 XENC1003“scIL-15/RαX Fab”5/格式的异源二聚体蛋白。靶向TIM-3的IL- 15/IL-15Rα-Fc异源二聚体融合蛋白的示例性实施方式分别显示于图22和图29、图46、图47以及图48A和B。

VI.本发明的核酸

本发明进一步提供了编码本发明靶向的IL-15/IL-15Rα-Fc异源二聚体融合蛋白的核酸组合物(或者，在“单特异性”抗体的情况下，也是编码那些的核酸)。

如所属领域技术人员将理解，核酸组合物将取决于靶向IL-15/IL-15Rα-Fc 异源二聚体融合蛋白的格式。因此，例如，当形式需要三个氨基酸序列时，可以将三个核酸序列并入一个或多个表达载体中以用于表达。类似地，一些格式仅需要两个核酸；同样，它们可以被放入一个或两个表达载体中，或四或5。如本文所述，例如，一些构建体具有轻链的两个拷贝。

如所属领域已知，编码本发明组分的核酸可以如所属领域已知的那样并入表达载体中，并且取决于用于产生本发明的靶向IL-15/IL-15Rα-Fc异源二聚体融合蛋白的宿主细胞。一般来说，核酸可操作地连接到任何数目的调节元件(启动子、复制起点、可选标记、核糖体结合位点、诱导剂等)。表达载体可以是染色体外的或整合载体。

然后将本发明的核酸和/或表达载体转化到所属领域众所周知的任何数量的不同类型的宿主细胞中，包括哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞，其中哺乳动物细胞(例如CHO细胞)在许多实施例中使用。

在一些实施方式中，如果取决于格式适用的话，对每个单体进行编码的核酸通常在不同或相同的启动子对照条件下各自包含在单个表达载体内。在特别用于本发明的实施方式中，不同表达载体上均含有这两种或三种核酸中的每一种。

如本领域所熟知的，通过培养包含表达载体的宿主细胞制备本发明的靶向的IL-15/IL-15Rα-Fc异源二聚体融合蛋白。一旦产生，就进行传统的融合蛋白或抗体纯化步骤，包含离子交换色谱法步骤。如本文所论述，使两种单体的pI 相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电点聚焦或对等电点敏感的其它方法来实现分离。也就是说，包含改变每个单体的等电点(pI)的pI取代使得每个单体具有不同的pI并且异源二聚体也具有不同的pI，从而促进异源二聚体的等电纯化(例如，阴离子交换柱、阳离子交换柱)。这些取代还有助于确定和监测纯化后任何污染的同源二聚体(例如，IEF凝胶、cIEF和分析型IEX柱)。

VII.TIM-3抗体x IL-15/IL-15Rα异源二聚体免疫调节融合蛋白的生物学和生化功能

通常，将本发明的靶向IL-15/IL-15Rα-Fc免疫调节抗体给予患有癌症的患者，并且以本文所述的多种方式评估功效。因此，虽然可以进行标准的功效分析，如癌症负荷、肿瘤尺寸、转移的存在或程度的评估等，但是也可以基于免疫状况评估来评定免疫肿瘤学治疗。这可以通过多种方式完成，包括体外和体内测试。例如，可以进行免疫状态变化的评估以及“老式”测量，例如肿瘤负荷、大小、侵袭性、LN受累、转移等。因此，可以评估以下中的任一个或全部： PVRIG对CD4

在一些实施方式中，通过使用例如CFSE稀释法、免疫效应细胞的Ki67细胞内染色以及

在一些实施方式中，通过评估基因表达的增加或活化相关标志物的蛋白含量的增加来评定处理，所述标志物包括以下中的一个或多个：CD25、CD69、 CD137、ICOS、PD1、GITR、OX40以及通过CD107A的表面表达测量的细胞脱粒。

一般来说，如本领域中已知地进行基因表达分析。

一般来说，还如所属领域中已知地，类似地进行蛋白表达测量。

在一些实施方式中，通过估计许多细胞参数，例如酶活性(包括蛋白酶活性)、细胞膜渗透性、细胞粘附、ATP产生、辅酶产生和核苷酸摄取活性来评定由靶细胞活力检测测量的细胞毒活性，从而评定治疗。这些分析的具体实例包括但不限于台盼蓝(Trypan Blue)或PI染色、

在一些实施方式中，通过评定由细胞因子产生测量的T细胞活性，使用细胞因子，使用众所周知的技术，细胞内测量培养物上清液来评定治疗，所述细胞因子包括但不限于：IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL2、IL6、IL4、IL5、IL10、 IL13。

因此，可以使用评估以下中的一个或多个测试来评定治疗：(i)免疫反应的增加；(ii)αβ和/或γδT细胞活化的增加；(iii)细胞毒性T细胞活性的增加； (iv)NK和/或NKT细胞活性的增加；(v)αβ和/或γδT细胞抑制的缓解；(vi)促炎性细胞因子分泌的增加；(vii)IL-2分泌的增加；(viii)干扰素γ产生的增加；(ix)Th1反应的增加；(x)Th2反应的减少；(xi)减少或消除调节性T细胞(Treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性。

A.测量功效的测试

在一些实施方式中，使用如本领域已知的混合淋巴细胞反应(MLR)测试来评定T细胞活化。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径分析测量免疫反应的增加或减少，如例如通过不同因子的磷酸化或去磷酸化或通过测量其它翻译后修饰所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδT细胞活化的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、 PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测试测量细胞毒性T细胞活性的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量NK和/或NKT细胞活性的增加或减少，如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过如例如CD107a等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测试测量αβ和/或γδT细胞抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、 PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量促炎性细胞因子分泌的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测试测量IL-2分泌的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和 FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测试测量干扰素γ产生的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量Th1反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量Th2反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量调节性T细胞(Treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC 所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施例中，信号传导通路分析测量M2巨噬细胞细胞数量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量M2巨噬细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量N2嗜中性粒细胞增量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量N2嗜中性粒细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方式中，信号传导途径测试测量T细胞活化抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测试测量CTL活化抑制的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδT细胞耗竭的增加或减少，如例如通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方式中，信号传导途径测试测量αβ和/或γδT细胞反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、 PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测试测量抗原特异性记忆反应的刺激的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD45RA、 CCR7等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。。

在一个实施例中，信号传导途径分析测量癌细胞的细胞凋亡或裂解的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测试测量对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制作用的刺激的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、 Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等) 所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施例中，信号传导途径分析测量癌细胞的直接杀伤的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施例中，信号传导通路分析测量Th17活性的增加或减小，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测试测量补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的诱导的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE 稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或活化标志物(例如CD137、CD107a、PD1等)的表达变化来测量T细胞活化。对于T细胞，增殖、细胞表面活化标志物(例如CD25、 CD69、CD137、PD1)、细胞毒性(杀伤靶细胞的能力)和细胞因子产生(例如IL-2、 IL-4、IL-6、IFNγ、TNF-a、IL-10、IL-17A)的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。

在一个实施方式中，例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过活化标志物(例如CD107a等)的表达变化来测量NK细胞活化。对于NK细胞，增殖、细胞毒性(杀伤靶细胞并且增加CD107a、颗粒酶和穿孔素表达的能力)、细胞因子产生(例如IFNγ和TNF)和细胞表面受体表达(例如CD25) 的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。

在一个实施方式中，例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化来测量γδT细胞活化。

在一个实施方式中，例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化来测量Th1细胞活化。

相比参考样品或对照样本，例如不含本发明的异源二聚体蛋白的测试样品中的信号，活性或反应的适当增加(或如上所述适当减少)是10％、20％、30％、 40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％至99％的增加。类似地，与参考或对照样品相比，增加至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍显示出有功效。

VIII.治疗

一旦制备，通过治疗癌症，通常通过结合本发明的异源二聚体融合蛋白来促进T细胞活化(例如不再抑制T细胞)，本发明的组合物可用于许多肿瘤学应用。

因此，本发明的靶向IL-15/IL-15Rα-Fc异源二聚体组合物可用于治疗这些癌症。

A.用于体内施用的靶向IL-15/IL-15Rα-Fc异源二聚体蛋白组合物

通过将具有期望纯度的抗体与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol、A.Ed.[1980]概述的) 混合来以冻干制剂或水溶液的形式制备根据本发明使用的抗体的制剂用于储存。可接受的载体、缓冲剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如锌-蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN

B.组合疗法

在一些实施方式中，本发明的异源二聚体蛋白可以与结合不同检查点蛋白的抗体(例如不是TIM-3抗体)组合用于治疗。以这种方式，另外的抗体的靶向 IL-15/IL-15Rα-Fc结合结构域不竞争与靶向的IL-15/IL-15Rα-Fc异源二聚体蛋白的结合。以这种方式，由于三种受体被结合(两种来自靶向的IL-15/IL-15Rα-Fc 异源二聚体蛋白，一种来自附加抗体)，因此实现了一种“三联组合”疗法。如本文所述，异源二聚体蛋白可以具有如本文概述的不同的功效和特异性。

令人惊讶地，如本文所示，当共同施用时，这些组合可产生协同作用。在本文中，“共同施用”是指两个部分可以同时或顺序施用。也就是说，在某些情况下，药物可以同时给药，不过通常是通过使用两次独立的IV输注来完成的；也就是说，药物通常不合并为单个剂量单位。作为选择，共同给药包括在一天或不同天(包括相隔一段时间内的几天)中连续给药两种分开的药物。

1.用于共同施用疗法的抗PD-1抗体

如本领域中已知的，存在两种当前批准的抗PD-1抗体，并且还有更多的抗PD-1抗体处于临床测试。因此，用于本文概述的组合疗法的合适的抗PD-1 抗体包括但不限于目前FDA批准的两种抗体，派姆单抗(pembrolizumab)和尼古珠单抗(nivolizumab)，以及目前在临床测试中的那些，包括但不限于到 tislelizumab、Sym021、REGN2810(由Rengeneron开发)、JNJ-63723283(由J and J开发)、SHR-1210、pidilizumab、AMP-224、MEDIo680、PDR001和CT-001，以及在Liu等J.Hemat.&Oncol.(2017)10:136中概述的其他内容抗体，其中的抗体通过引用明确地并入。如上所述，当本发明的靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白不具有结合PD-1的抗原结合结构域时，组合使用抗PD-1抗体。

2.用于共施用疗法的抗PD-L1抗体

在一些实施方式中，组合使用抗PD-L1抗体。如本领域中已知的，存在三种当前批准的抗PD-L1抗体，并且还有更多处于临床测试中。因此，适用于本文概述的联合疗法的合适抗PD-L1抗体包括但不限于三种目前FDA批准的抗体：atezolizumab、avelumab、urvalumab，以及目前在临床测试中的那些抗体，包括但不限于LY33000054和CS1001，以及Liu等J.Hemat.&Oncol. (2017)10:136概述的其他抗体，其中的抗体通过引用明确地并入。如上所述，当本发明的靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白不具有结合PD-L1的抗原结合结构域时，组合使用抗PD-L1抗体。

3.用于共施用疗法的抗TIGIT抗体

在一些实施方式中，抗TIGIT抗体可以与本发明的靶向IL-15/IL-15Rα-Fc 蛋白组合使用。有几种TIGIT抗体正在临床开发中，分别是BMS-986207、 OMP-313M32和MTIG7192A。如上所述，当本发明的靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白不具有结合TIGIT的抗原结合结构域时，组合使用抗TIGIT抗体。

4.用于共施用疗法的的抗CTLA-4抗体

在一些实施方式中，抗CTLA-4抗体可以与本发明的靶向IL-15/IL-15Rα- Fc蛋白组合使用。伊匹木单抗已经获得批准，并且还有其他一些产品正在开发中，包括CP-675,206和AGEN-1884。如上所述，当本发明的靶向IL-15/IL- 15Rα-Fc融合蛋白不具有结合CTLA-4的抗原结合结构域时，组合使用抗 CTLA-4抗体。

5.用于共施用疗法的抗TIM-3抗体

在一些实施方式中，抗TIM-3抗体可以与本发明的靶向IL-15/IL-15Rα-Fc 蛋白组合使用。临床开发中有几种TIM-3抗体，包括BMS-986016、LAG525 和REGN3767。如上所述，当本发明的靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白不具有结合TIM-3的抗原结合结构域时，组合使用抗TIM-3抗体。

C.施用方式

根据已知方法将本发明的靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白和化学治疗剂施用于受试者，例如以推注或在一段时间内连续输注的形式静脉内施用。

D.治疗方式

在本发明的方法中，疗法用于提供关于疾病或病状的阳性治疗反应。“阳性治疗反应”旨在改善疾病或病况，和/或改善与疾病或病况相关的症状。举例来说，阳性治疗反应是指疾病中的一种或多种以下改善：(1)肿瘤细胞数量的减少；(2)肿瘤细胞死亡增加；(3)抑制肿瘤细胞存活；(5)肿瘤生长的抑制(即，在某种程度上减慢，优选停止)；(6)提高患者生存率；(7)与疾病或病况相关的一种或多种症状有所缓解。

在任何给定疾病或病况中的阳性治疗反应可以通过对所述疾病或病况特异的标准化反应标准来确定。可以使用筛选技术，例如磁共振成像(MRI)扫描、x 射线照相术、计算机断层摄影术(CT)扫描、骨扫描成像、内窥镜检查和肿瘤活检取样，包括骨髓穿刺(BMA)和对循环中的肿瘤细胞计数来评定针对肿瘤形态 (即总体肿瘤负荷、肿瘤大小等)变化的肿瘤应答。

除了这些阳性治疗反应之外，接受疗法的个体可以经历改善与疾病相关的症状的有益效果。

根据本发明的治疗包括所用药物的“治疗有效量”。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望治疗结果的量。

治疗有效量可根据诸如疾病状态、年龄、性别和个体体重等因素以及药物在个体中引发期望反应的能力而变化。治疗有效量也是其中抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用超过治疗有益效果的量。

用于肿瘤治疗的“治疗有效量”还可以通过其稳定疾病进展的能力来测量。可以在预测人肿瘤中功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。

替代性地，通过熟练的从业者已知的体外测试，组合物的这种特性可以通过检验化合物抑制肿瘤生长或诱导凋亡的能力来评估。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小，或以其他方式改善受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的大小、受试者症状的严重性和所选择的特定组合物或给药途径等因素来确定这样的量。

调整剂量方案以提供最佳的所期望反应(例如，治疗反应)。举例来说，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。肠胃外组合物可以单位剂型配制，以便于施用和使剂量均匀。如本文所用的单位剂型是指适合作为待治疗个体的单位剂量的物理离散单元；每个单元含有预定量的活性化合物，其经过计算可与所期我的药物载体一起产生所期望的治疗效果。

本发明的单位剂型的规格由以下各项指定并且直接取决于以下各项：(a)活性化合物的独特特征和欲实现的特定治疗效果；和(b)混配这类活性化合物用于治疗个体敏感性在所属领域中固有的限制。

本发明中所用的靶向的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白的高效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病况且可以由本领域的技术人员来确定。

用于本发明的治疗有效量的靶向的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白的示例性非限制性范围是约0.1-100mg/kg。

所有引用的参考文献以全文引用的方式明确地并入本文中。

尽管以上为了说明的目的描述本发明的特定实施方式，但是所属领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求中描述的本发明的情况下，可以进行细节的许多变化。

IX.实施例

以下提供实施例以说明本发明。这些实例并不意味着将本发明限制于任何特定的应用或操作理论。对于本发明中所论述的所有恒定区位置，根据如 Kabat中的EU编号(Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.,United States Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda，其以引用的方式整体并入本文中)。抗体领域中的技术人员将了解这个规约由以下组成：免疫球蛋白序列的特定区域的非顺序编号，其对免疫球蛋白家族中的保守位置实现标准化的称呼。因此，由EU编号定义的任何给定免疫球蛋白的位置不一定对应于其顺序序列。

在美国公开2015/0307629、2014/0288275和WO2014/145806中概述了一般和具体的科学技术，所有这些技术都通过引用明确地并入本文，特别是其中概述的技术。2016年11月1日提交的USSN 62,416、087的实施例1和2通过引用明确地并入本文，包括相应的附图。另外，USSN 62/408,655、62/443,465、 62/477,926、15/785,401、62/416,087和15/785,393明确地全文引入作为参考，并且特别是其中的所有序列、图和图例。

A.实施例1：抗TIM-3ABD

在WO2017/218707(通过引用并入本文)中描述了结合TIM-3的抗原结合结构域的实例，出于所有目的将其内容全文并入本文，特别是图13中的TIM-3 ABD、图21和图22中的数据、和序列表中的SEQ ID NO：20765-20884、SEQ ID NO:37587-37698和SEQ ID NO:36347-36706序列(可以格式化为scFv或 Fab，如此处所讨论)。抗TIM-3Fvs的额外说明性序列描绘于图12和图13中。图16和序列表中描述了可用于本发明的靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白中的额外非限制性TIM-3ABD实例。

B.实施例2：靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白

参考WO2018/071919，其描述了不包含ABD的IL-15/RA-Fc融合蛋白，如在图9和图39中通常描绘。WO2018/071919明确地通过引用并入本文，特别是其中的所有序列、格式、图和图例。

2A：靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的产生

通过标准基因合成构建编码IL-15、IL-15Rαsushi结构域或抗TIM-3可变区的质粒，然后将其亚克隆到含有Fc融合配偶体(例如，如图13所示的恒定区) 的pTT5表达载体中。靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的示意图卡通显示在图21。

“scIL-15/Rα×scFv”格式(图21A)包含通过可变长度的连接子与IL-15融合的IL-15Rα(sushi)(称为“scIL-15/Rα”)，其随后与异源二聚体Fc区的N端融合，而 scFv与异源二聚体Fc的另一侧融合。

“scFv×ncIL-15/Rα”格式(图21B)包含与异源二聚体Fc区的N端融合的 scFv，IL-15Rα(sushi)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。

“scFv×dsIL-15/Rα”格式(图21C)与“scFv×ncIL-15/Rα”格式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(sushi)和IL-15共价连接。

“scIL-15/Rα×Fab”格式(图21D)包含通过可变长度的连接子与IL-15融合的 IL-15Rα(sushi)(称为“scIL-15/Rα”)，其随后与异源二聚体Fc区的N端融合，可变重链(VH)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。61图中描绘了该格式的示例性靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。

“ncIL-15/Rα×Fab”格式(图21E)包含与异源二聚体Fc区的N端融合的VH， IL-15Rα(sushi)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。

“dsIL-15/Rα×Fab”格式(图21F)与“ncIL-15/Rα×Fab”格式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(sushi)和IL-15共价连接。

“mAb-scIL-15/Rα”格式(图21G)包含与第一和第二异源二聚体Fc的N端融合的VH，IL-15与随后与异源二聚体Fc区中的一个的C端进一步融合的IL- 15Rα(sushi)融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。

“mAb-ncIL-15/Rα”格式(图21H)包含与第一和第二异源二聚体Fc的N端融合的VH，IL-15Rα(sushi)与异源二聚体Fc区中的一个的C端融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。

“mAb-dsIL-15/Rα”格式(图21I)与“mAb-ncIL-15/Rα”格式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(sushi)和IL-15共价连接。

“中央-IL-15/Rα”格式(图21J)包含：以重组方式与随后与异源二聚体Fc的一侧进一步融合的IL-15的N端融合的VH，和以重组方式与随后与异源二聚体Fc的另一侧进一步融合的IL-15Rα(sushi)的N端融合的VH，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。

“中央-scIL-15/Rα”格式(图21K)包含与IL-15Rα(sushi)的N端融合的VH和与异源二聚体Fc的另一侧融合的VH，所述IL-15Rα(sushi)与随后与异源二聚体Fc的一侧进一步融合的IL-15融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH 的Fab。

2B：靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白可增强GVHD，并与抗 PD-1抗体协同组合

示例性的靶向TIM-3-的IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP27974单独或与(基于效应子功能消除的nivolumab的二价抗PD-1mAb结合；其序列在图23中描绘) 组合，在NSG(NOD-SCID-γ)免疫缺陷小鼠中进行的移植物抗宿主疾病(GVHD) 模型中进行了评估。当向NSG小鼠注射人PBMC时，人PBMC针对小鼠细胞发展出自身免疫应答。用人PBMC注射NSG小鼠，然后用靶向TIM-3的IL- 15/Rα-Fc融合蛋白注射，这样增殖了移植的T细胞并增强了植入。

在第-1天通过IV-OSP将1000万个人PBMC植入NSG小鼠中，然后在第 0、7、14和21天用指定浓度的指定测试品给药。在第6天和第10天对各种淋巴细胞群进行计数，其数据示于图24至图27。随时间测量小鼠的体重，并在图28中描绘为初始体重的百分比。数据显示，与单独植入PBMC相比， XENP27974给药后植入人PBMC可增强GVHD，如T细胞(CD8+和CD4+)、NK细胞和CD45+细胞计数增加以及体重降低所表明。值得注意的是，与单独使用XENP16432相比，XENP27974在更大程度上增强了GVHD。另外，数据显示，XENP27974与XENP16432协同结合以增强GVHD，如在用XENP27974 和XENP16432的组合给药后第19天时所有小鼠死亡。这表明，在免疫肿瘤学中，单独的或与检查点阻断抗体组合使用的靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白进行治疗将使肿瘤浸润淋巴细胞增生并增强抗肿瘤活性。

2C：靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的体外表征

在细胞增殖测定中进一步表征了靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白。人PBMC用500ng/ml的平板结合的抗CD3(OKT3)刺激48小时，然后用CFSE标记，并用以下的试验制品在37℃4天温育：XENP27974(靶向TIM-3的IL- 15/Rα-Fc融合蛋白，基于2A5B4并具有N4D/N65DIL-15变体)；XENP24306(具有D30N/E64Q/N65D IL-15变体的对照非靶向IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-Fc 融合蛋白)；和XENP26007(具有N4D/N65D IL-15变体的对照靶向RSV的IL-15/Rα-Fc融合蛋白)。使用以下抗体对细胞进行染色：抗CD8-PerCP- Cy5.5(SK1)，抗CD3-PE-Cy7(OKT3)，抗CD45RO-APC-Fire750(UCHL1)，抗 HLA-DR-Alexa700(L243)，抗CD16-BV605(3G6)，抗CD56-BV605(HCD56)，抗CD25-BV711(M-A251)，抗CD45RA-BV785(HI100)，抗CD4-BUV395(SK3) 和Zombie Aqua-BV510，并通过流动分析各种细胞群体。

研究了基于CFSE稀释(Zombie Aqua排除死细胞)的各种T细胞群体的增殖，其数据如图30-35所示。数据显示，与未靶向的IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα- Fc融合蛋白(以及对照靶向RSV的IL-15/Rα-Fc融合蛋白)相比，以靶向TIM-3 的IL-15/Rα-Fc融合蛋白在诱导CD8

还研究了基于CD25(晚期T细胞激活标记)和HLA-DR(另一种激活标记)表达的各种T细胞群体的激活，其数据描述在图36-38中。图36所示数据显示，与非靶向的IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-Fc融合蛋白(以及对照靶向RSV的IL- 15/Rα-Fc融合蛋白)相比，靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白表现出更强的诱导CD8 T细胞群体活化的作用。

C.实施例3：具有调节的IL-15功效的靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白

3A：IL-15(D30N/N65D)变体

在研究带有Xtend的IL-15-Fc效能变体的药代动力学的研究中，食蟹猕猴接受了各种浓度的第一单次静脉内(iv)剂量的XENP22853(带有Xtend的WT IL- 15/Rα-heteroFc；序列如图39所示)，XENP24306(带有Xtend的IL- 15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-heteroFc；序列如图42所示)，XENP24113(带有 Xtend的IL-15(N4D/N65D)/Rα-heteroFc；序列如图40所示)和XENP24294(带有 Xtend的scIL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc；序列如图所示41所示)。

图43描述了在第一剂之后随时间变化的测试物的血清浓度。如预期的那样，在Xtend取代之外并入功效变体(如XENP24306和XENP24113中)大大改善了IL-15-Fc融合蛋白的药代动力学(与XENP22583相比)。然而，出乎意料的是，与XENP24306相比，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白XENP24113和scIL- 15/Rα-Fc融合蛋白XENP24294(其具有相同的IL-15(N4D/N65D)功效变体)显示出降低的药代动力学。这表明降低的药代动力学是由于特定的IL-15功效变体而不是IL-15-Fc融合蛋白的格式。先前的发现表明具有IL-15(N4D/N65D)变体的IL-15-Fc融合蛋白比具有IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的IL-15-Fc融合蛋白具有更高的体外效能，尽管根据这种先前的发现预期XENP24113和XENP24294的药代动力学会降低，但是药代动力学的下降出乎意料地与药效的增加不成比例。因此，对于在本发明的靶向TIM-3的IL-15-Fc融合蛋白中使用的替代性IL-15功效变体进行了鉴定。

应当指出，IL-15(N4D/N65D)在负责与CD122结合的IL-15界面上同时有两个取代基，而IL-15(D30N/E64Q/N65D)在IL-15：CD122界面上有两个取代基(E64Q和N65D)；在负责与CD132结合的IL-15界面上具有一个取代基 (D30N)。因此，据信IL-15：CD132界面处的修饰可有助于针对XENP24306观察到的优异的药代动力学。值得注意的是，已观察到包含IL-15(N4D/N65D)变体和IL-15(D30N/N65D)变体的scIL-15/Rα-Fc融合蛋白如图45所示显示出非常相似的体外功效。鉴于以上内容，构思了包括IL-15(D30N/N65D)变体的示例性靶向TIM-3的IL-15-Fc融合蛋白，其序列在图46中示出。还产生了具有IL- 15(D30N/N65D)变体的对照靶向RSV的IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP29481，其序列如图49所示。

3B：IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体

尽管将靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白设计为旨在通过靶向TIM-3的臂而靶向肿瘤环境，但细胞因子部分仍能够在到达肿瘤部位之前进行信号传导，并可能会导致全身毒性。因此，进一步降低IL-15功效，构建了具有IL- 15(D30N/E64Q/N65D)变体的靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白，以进一步降低IL-15的功效，如实施例2C和图45所示，其活性大大降低。图47中描述了包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的示例性靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。另外，构建了XENP30432，它是一种包含IL-15(D30N/E64Q/N65D) 变体的靶向RSV的IL-15/Rα-Fc融合蛋白(序列如图49所示)，用作替代物研究包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的靶向TIM-3的IL-15/Rα-Fc融合蛋白在肿瘤环境之外的行为。