用β型糖原合酶激酶3抑制剂治疗特发性肺纤维化

本申请要求2018年5月17日提交的美国临时申请No.62/672,864的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。

本发明是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的政府支持(NIH HL130133)下完成的。美国政府在本发明中具有一定的权利。

技术领域

属于生物化学和医学领域的本发明涉及使用β型糖原合酶激酶3(glycogensynthase kinase 3，form β，GSK-3β)抑制剂(最优选9-ING-41)来抑制体内纤维化肺重塑(fibrotic pulmonary remodeling)并由此治疗特发性肺纤维化(idiopathic pulmonaryfibrosis，IPF)的方法和组合物。

背景技术

特发性肺纤维化(IPF)是一种知之甚少的进行性且致命性的肺病，针对该疾病，除肺移植之外，如果有的话也是存在很少的治疗。用于肺纤维化的目前可用治疗已知不是治愈性的且仅减慢疾病进展。中位生存期(median survival time，MST)为诊断之后3年(以及在诊断之后5年的中位生存小于20％)。大多数间质性肺病形式以及其他肺纤维化形式的特征在于：纤维化病变、发生肺泡结构的进行性扭曲以及被具有过量胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积的纤维化组织或瘢痕组织替代，导致进行性呼吸困难和肺功能丧失。

GSK-3β是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，并且是两种GSK-3同种型(α和β)之一。GSK-3β可调节多种靶标(包括转录因子)的功能。GSK-3β还调节许多信号传导途径，这继而影响许多炎性介质的转录活性。

由于目前的治疗仅减慢疾病的进展，因此需要鉴定新的更有效的靶标，同样需要可显著逆转IPF、或降低来自IPF的死亡率和治愈IPF的更好治疗方式。

发明内容

本公开内容涉及胸膜纤维化和肺纤维化二者的治疗。在一些优选实施方案中，这些方法通过施用即使在高剂量下也良好耐受的9-ING-41来实现。其还在胸膜纤维化和如本文中所述的肺纤维化的小鼠模型中限制瘢痕形成。不存在用于治疗与胸膜纤维化相关的瘢痕化和组织重组的有效治疗，并且可用于肺纤维化的现有方法仅减慢其进展而不具有治愈性。9-ING-41减轻体内纤维化肺重塑，解决了用于肺纤维化的有效治疗的迫切需求。

目前尚不存在使肺纤维化逆转的有效治疗。本发明解决了这个重要的缺口，并且提供了用于靶向纤维化肺(fibrotic lung，“FL”)成纤维细胞(或肌成纤维细胞(myofibroblast))以有效治疗IPF的新的化合物和方法。

本发明涉及抑制在向IPF进展中有助于肌成纤维细胞扩增的居留型胸膜间皮细胞(pleural mesothelial cell，PMC)的间皮间充质转化(mesomesenchymal transition，MesoMT)的方法。

本发明涉及在哺乳动物对象中治疗特发性肺纤维化(IPF)的方法，其通过向有此需要的哺乳动物对象施用有效量的式I化合物或者其可药用的盐或溶剂合物来进行，

其中：

X独立地是-H、卤素、5，6-亚甲二氧基、-CN、-OMe、-OH、-OBn、-CF

R

R

Y独立地是-H、卤素、-OMe、-OH、-OBn、-CF

本发明还涉及通过以下来在哺乳动物对象中治疗IPF的方法：向有此需要的哺乳动物对象施用包含以下的药物组合物：i)有效量的式I化合物或者其可药用的盐或溶剂合物；以及ii)可药用的载体或赋形剂。

本发明还涉及用于治疗患有或发生以肺纤维化为特征的疾病或病症的哺乳动物对象，最优选人中IPF的方法，其包括向该对象施用有效量的上述药物组合物。化合物或组合物优选地包含9-ING-41或其在如体外或体内测定中具有9-ING-41的生物活性或生物化学活性的至少20％的类似物。最优选的化合物是9-ING-41。

在哺乳动物对象中治疗IPF的方法的一些优选实施方案中，式I化合物是9-ING-41或者其可药用的盐或溶剂合物。

在哺乳动物对象中治疗PF的方法的一些优选实施方案中，哺乳动物对象是人。

在哺乳动物对象中治疗IPF的方法的一些优选实施方案中，施用通过吸入进行。

还提供了用于抑制肺肌成纤维细胞增殖和/或分化为纤维化肺(FL)成纤维细胞以及降低FL成纤维细胞增殖的方法，其包括使有此需要的哺乳动物对象中的肌成纤维细胞和FL成纤维细胞与抗纤维化有效量的式I化合物或者包含有效量的式I化合物或其可药用盐、以及可药用赋形剂或载体的药物组合物接触。

在用于抑制肺肌成纤维细胞增殖和/或分化为FL成纤维细胞以及降低FL成纤维细胞增殖的方法的一些优选实施方案中，化合物或式I优选地是9-ING-41或者其可药用的盐或溶剂合物。

在用于抑制肺肌成纤维细胞增殖和/或分化为FL成纤维细胞以及降低FL成纤维细胞增殖的方法的一些优选实施方案中，哺乳动物对象是人。

在用于抑制肺肌成纤维细胞增殖和/或分化为FL成纤维细胞以及降低FL成纤维细胞增殖的方法的一些优选实施方案中，所述接触通过吸入进行。

本发明还提供了药物组合物，其包含：(i)抗纤维化有效量的式I化合物或者其可药用的盐或溶剂合物，以及(ii)可药用的载体或赋形剂。

在一些优选实施方案中，在本发明药物组合物中的式I是9-ING-41。

在一些优选实施方案中，本发明的药物组合物被配制用于通过吸入来施用。

在另一个实施方案中，本发明涉及上述组合物用于在哺乳动物对象中治疗IPF的用途，其中向患有IPF的哺乳动物对象施用有效量的所述组合物。

在一些优选实施方案中，所述组合物抑制GSK-3β，以及抑制肺肌成纤维细胞增殖和/或分化为FL成纤维细胞，以及降低所述FL成纤维细胞增殖。

在一些优选实施方案中，所述组合物包含有效量的9-ING-41或者其可药用的盐或溶剂合物。

在一些优选实施方案中，哺乳动物对象是人。

在一些优选实施方案中，所述组合物通过吸入来施用。

另一个实施方案涉及如上组合物用于制备用于在有此需要的哺乳动物对象，优选人中治疗IPF的药物的用途。

在一些优选实施方案中，所述组合物抑制GSK-3β活性，以及抑制肺肌成纤维细胞增殖和/或分化为FL成纤维细胞，以及降低所述FL成纤维细胞增殖。

在该用途中，化合物优选地是9-ING-41或者其可药用的盐或溶剂合物。在上述用途中，药物的制备是用于通过吸入施用于人来治疗IPF。

附图说明

图1A至1B是显示用9-ING-41进行的GSK-3β抑制减弱了肺纤维化的图。对C57Bl/6J小鼠气管内施用硫酸博来霉素(0.8U/kg)。14天之后，在接下来的14天中通过采用腹膜内注射用DMSO(载剂)或GSK-3β抑制剂9-ING-41(30mg/kg)处理小鼠。在28天时间进程完成时，使用Scireq flexivent确定肺顺应性(compliance)(图1A)。还通过门控CT扫描收集肺再现并将其用于确定肺容量(图1B)。

图2A至2B示出了来自经DMSO载剂(图2B)和经9-ING-41(图2A)处理的小鼠的肺组织切片(5μm)。对切片进行免疫染色以通过共焦显微术来使胶原沉积可视化(示出为灰色)。实心箭头指示胶原-1沉积提高的区域。图像是30个视野/载片/条件的代表。n＝6只小鼠。

图3是示出了气管内施用TGF-β腺病毒以诱导肺纤维化的小鼠的肺顺应性的图。在7天之后，使小鼠在接下来的7天每天接受9-ING-41(30mg/kg)的腹膜内注射。在14天时间进程完成时，确定肺顺应性。将数据表示为平均值±SEM。n＝6只小鼠/条件。*指示通过曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)与对照GFP-腺病毒和DMSO处理相比的p＜0.05统计学显著性。$表示与GFP腺病毒9-ING-41处理相比的p＜0.05。

图4A至4B示出了来自其中TGF-β腺病毒诱导肺纤维化的小鼠的肺组织切片。将小鼠用DMSO(图4A)或9-ING-41(图4B)处理(参见图3的描述)。对切片进行三色染色以显示损伤和胶原区域。实心箭头指示损伤且胶原沉积提高的区域。图像是30个视野/载片/条件的代表。n＝6只小鼠。

图5A至5F示出了来自经载剂(图5A至5C)和经9-ING-41(图5D至5F)处理的小鼠的肺组织切片(5μm)。将切片脱石蜡并进行三色染色以检测肺结构和胶原沉积(蓝色染色)的变化。图像在20X下采集并且代表30个视野/载片/小鼠，n＝6只动物/处理。纤维化病灶由实心黄色箭头指示。

图6A至6B示出了针对胶原1(collagen 1，Col-1)沉积进行免疫染色并通过共焦显微术在40X下成像的来自经载剂(图6B)和经9-ING-41(图6A)处理的小鼠的肺切片。实心箭头指示损伤肺内胶原沉积的区域。这些数据表明，用9ING41进行的GSK-3β抑制降低了纤维化肺损伤中的胶原沉积。

图7A至7B示出了针对α-SMA(肌成纤维细胞分化的一种标志物)进行免疫染色的来自经载剂(图7B)和经9-ING-41(图7A)处理的小鼠的肺切片。图像通过共焦显微术在40X下采集。实心箭头指示胶原α-SMA表达的区域。图像是30个视野/小鼠的代表并且n＝3只小鼠/处理。

具体实施方式

可用于本发明方法中的化合物包括9-ING-41，其描述于美国专利8,207,216(Kozikowski et al.)中，该专利通过引用以其整体并入。

还可用于本发明中的是共有GSK-3β抑制特性的苯并呋喃-3-基-(吲哚-3-基)马来酰亚胺家族的更广泛的一类。这样的化合物被式I涵盖：

其中：

X独立地是-H、卤素、5，6-亚甲二氧基、-CN、-OMe、-OH、-OBn、-CF

R

R

Y独立地是-H、卤素、-OMe、-OH、-OBn、-CF

在式I化合物中，X独立地是-H、卤素、5，6-亚甲二氧基、-CN、-OMe、-OH、-OBn、-CF

在一些实施方案中，X是H。

在另一些实施方案中，X是卤素(即，-F、-Cl、-Br、-I)。在一些实施方案中，X是5-F。在另一些实施方案中，X是5-Br。在另一些实施方案中，X是5-I。

在一些实施方案中，X是5-F，6-Cl。在另一些实施方案中，X是5，7-二溴。

在一些实施方案中，X是5，6-亚甲二氧基。

在一些实施方案中，X是-CN。

在一些实施方案中，X是-OMe(即，-O-CH

在一些实施方案中，X是-OH。

在一些实施方案中，X是-OBn(即，-O-苄基)。

在一些实施方案中，X是-CF

在一些实施方案中，X是-CH

在一些实施方案中，X是-CH

在一些实施方案中，X是-CH

在一些实施方案中，X是-CH

在式I化合物中，R

在一些实施方案中，R

在另一些实施方案中，R

在另一些实施方案中，R

在另一些实施方案中，R

在式I化合物中，R

在一些实施方案中，R

在另一些实施方案中，R

在另一些实施方案中，R

在另一些实施方案中，R

在式I化合物中，Y独立地是-H、卤素、-OMe、-OH、-OBn、-CF

在一些实施方案中，Y是H。

在另一些实施方案中，Y是卤素(即，-F、-Cl、-Br、-I)。在一些实施方案中，Y是5-F。在另一些实施方案中，Y是5-Br。在另一些实施方案中，Y是5-I。

在一些实施方案中，Y是-CN。

在一些实施方案中，Y是-OMe(即，-O-CH

在一些实施方案中，Y是-OH。

在一些实施方案中，Y是-OBn(即，-O-苄基)。

在一些实施方案中，Y是-CF

在一些实施方案中，Y是-CH

在一些实施方案中，Y是-CH

在一些实施方案中，Y是-C＝CH

在一些实施方案中，Y是-NO

在式I化合物的一些实施方案中，X优选地是5，6-亚甲二氧基(9-ING-41中的取代基)，

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，Y选自5-或6-卤素基团、5-或6-NO

在式I化合物的一些实施方案中，X是5，6-亚甲二氧基；R

与9-ING-41相比在式I中具有不同取代基的以上化合物被认为是其类似物。

合成式I化合物的一般方法是本领域已知的，其中一些描述于‘216专利(同上)中。

使用本文中所述和/或例示的方法或测定或者本领域公知的其他方法或测定中的任一种测试本发明化合物的生物活性，例如抗纤维化活性、其抑制酶GSK-3β和/或抑制增殖和胶原产生成纤维细胞/肌成纤维细胞、或纤维化肺成纤维细胞的能力。

化合物在动物，优选用BLM或组成型活性TGF-β腺病毒载体处理的小鼠中抑制肺纤维化的能力(参见实施例VI)是用于评估化合物的功能/药物活性的一种优选测试。也可使用测量相同类型活性的本领域已知的其他测试。

将本文中所述的化合物和组合物用于抑制酶GSK-3β、在体外或体内抑制胶原产生成纤维细胞/肌成纤维细胞的增殖、以及治疗肺纤维化/IPF的方法中。

可用于本发明的药物组合物中的化合物包括上述化合物，优选9-ING-41，以及其类似物，以及这些化合物的可药用的盐或溶剂合物。“可药用盐”是指保留本发明化合物的生物有效性和特性并且由合适的无毒有机或无机酸或者有机或无机碱形成的常规的酸加成盐或碱加成盐。样品酸加成盐包括来源于无机酸的那些，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸；以及来源于有机酸的那些，所述有机酸例如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等。

样品碱加成盐包括来源于铵、钾、钠和季铵氢氧化物，例如如四甲基氢氧化铵的那些。将药物化合物(即，药物)化学修饰成盐是药物化学家公知的用于获得化合物的改善的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和溶解度的技术。参见，例如H.Ansel et al.，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(6

如上所述，本发明的化合物具有抑制酶GSK-3β的能力，并被用于治疗肺纤维化。

可将本发明的化合物及其可药用的盐或溶剂合物并入到合适的剂型，例如胶囊剂、浸渍晶片剂(impregnated wafer)、片剂或优选可注射制剂中。可使用固体或液体可药用载体。“可药用的”例如可药用的载体、赋形剂等意指是药理学上可接受且对施用特定化合物的对象基本上无毒的。

固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙二水合物、白土(terra alba)、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、盐水、水、右旋糖、甘油等。类似地，载体或稀释剂可包括任何延长释放物质，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，其单独地或与蜡一起。当使用液体载体时，制剂可以为以下形式：糖浆剂、酏剂、乳剂、软明胶胶囊剂、无菌可注射液体剂(例如，溶液剂)(例如安瓿剂(ampoule))，或者水性或非水性液体混悬剂。这样的药物组合物的概述可见于例如Gennaro，AR，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott Williams&Wilkins Publishers；第21版，2005(或最新版)中。

药物制剂按照药物化学的常规技术来制备，所述常规技术涉及例如以下步骤：混合、制粒和压制(对于片剂形式而言在需要时)，或者将成分混合、填充和溶解(视情况而定)，以得到用于经口、肠胃外、表面、经皮、阴道内、阴茎内、鼻内、支气管内、颅内、眼内、耳内和直肠施用的期望的产品。所述药物组合物还可包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。

本发明可用于治疗许多动物属和种中的任一种，并且同样可适用于人或兽医学的实践中。因此，药物组合物可用于治疗驯养动物和商业动物，包括鸟，并且更优选哺乳动物，最优选人。

本发明的组合物可通过任何合适的施用途径施用于对象，包括经口、口服、通过吸入、皮下、肌内、静脉内、经皮、经阴道、经直肠、或以其任意组合。

在一些实施方案中，本发明的组合物经口、口服、通过吸入、皮下、肌内或静脉内施用。

在一些实施方案中，本发明的组合物经口施用。

在另一些实施方案中，本发明的组合物口服施用。

在另一些实施方案中，本发明的组合物通过吸入来施用。

在另一些实施方案中，本发明的组合物皮下施用。

在另一些实施方案中，本发明的组合物肌内施用。

在另一些实施方案中，本发明的组合物静脉内施用。

术语“全身性施用”是指以导致化合物引入到对象的循环系统中或以其他方式允许化合物在全身扩散的方式，例如静脉内(i.v.)注射或输注施用治疗性化合物。“区域性”施用是指施用到特定且稍微更加局限的解剖空间中，例如滴注或吸入到肺中(优选途径)，或者胸膜内、腹膜内、鞘内、硬膜下施用，或者施用至特定器官。另一些实例包括：鼻内，其是对应于滴注或吸入到肺中的一种途径；支气管内、耳内或眼内，等等。术语“局部施用”是指将组合物或药物施用到局限或受限制的解剖空间中，例如皮下(s.c.)注射、肌内(i.m.)注射。本领域技术人员将理解，局部施用或区域性施用通常也导致组合物进入到循环系统中，因此s.c.或i.m.也是全身性施用的途径。可滴注、可注射或可输注的制剂可以以常规形式制备，如溶液剂或混悬剂、适合于在注射或输注之前溶解或混悬于液体中的固体形式、或者如乳剂。尽管优选的区域性施用途径是进入肺中，但可与滴注或吸入到肺中分开地或同步地全身性或表面或经皮施用药物组合物。

用于本发明的组合物的另一些可药用载体是脂质体，药物组合物中包含的活性多肽分散或以各种方式存在于由黏附至脂质层的水性同心层组成的小体中。活性化合物优选地存在于水层中和脂质层中，内部或外部，或者在任何情况下，存在于通常称为脂质体混悬液的非均相体系中。疏水层或脂质层通常(但非排他性地)包含磷脂(例如卵磷脂和鞘磷脂)、类固醇(例如胆固醇)、或多或少的离子表面活性物质(例如双十六烷基磷酸酯、硬脂胺或磷脂酸)和/或其他疏水性质的物质。本领域技术人员将理解本发明脂质体制剂的其他合适的实施方案。

施用的治疗剂量是如本领域技术人员已知的或可容易确定的治疗有效的量。该剂量还取决于接受者的年龄、健康和体重、同步治疗的种类(如果有的话)、治疗的频率以及期望效果的性质。

本发明的方法可用于在有此需要的对象中治疗肺纤维化(也称为IPF)。术语“治疗”被广泛地定义为包括至少以下：抑制、减轻、改善、预防所治疗或预防的疾病或病症、降低其发生或复发，包括复发的频率和/或时间或者其症状的严重程度。这可由于抑制上皮细胞死亡、抑制成纤维细胞增殖、本文中公开为与IPF相关或导致IPF的其他生物或生物化学机制中任一种而发生。

苯并呋喃-3-基-(吲哚-3-基)马来酰亚胺GSK-3β抑制剂(即，式I化合物)，最优选9-ING-41或者其可药用的盐或溶剂合物，优选地作为如上所述的药物组合物施用。

化合物的剂量优选地包括包含有效量的9-ING-41的药物剂量单位。剂量单位形式是指适合作为用于哺乳动物对象的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含与所需药用载体缔合的为了产生期望治疗作用而计算的预定量的活性物质。本发明的剂量单位形式的规格由以下指示并且直接取决于以下：(a)活性物质的独特特征和待实现的特定治疗作用，以及(b)对这样的活性化合物进行复配的领域中关于个体对象的治疗和敏感性的固有的局限性。

“有效量”意指足以在体内达到导致疾病的任何相关参数可测量降低的区域浓度或稳态浓度的量。

“抗纤维化有效量”意指足以抑制或降低肺肌成纤维细胞增殖和/或分化为纤维化肺(FL)成纤维细胞、或者足以以及降低FL成纤维细胞增殖的量。

施用的活性化合物的量取决于选择哪种化合物(例如9-ING-41)、确切的疾病或病症、施用途径、接受者的健康和体重、其他同步治疗的存在(如果有的话)、治疗的频率、期望效果的性质以及技术实践者的判断。

每天一次给予以由此治疗患有或易患IPF的对象，优选哺乳动物，更优选人的优选单剂量为约0.2mg/kg至约250mg/kg(例如0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245或250mg/kg的活性化合物)、约0.2mg/kg至约10mg/kg、约0.5mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约3mg/kg、或优选地约10mg/kg至约50mg/kg，例如通过吸入。这样的剂量可在约3天至一周或更多周的任何时间内每天施用。慢性施用也是可以的，但是如本领域公知的，可能需要向下调节剂量。然而，前述范围是建议性的，因为在个体治疗方案中变量的数目较大，并且预期与这些优选值有相当大的偏移。

对于连续施用、例如通过泵系统(例如在下述实验中的一些中使用的渗透泵)进行的连续施用，约1至2周的时间进程的总剂量优选地为1mg/kg至1g/kg(例如1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000mg/kg)，优选20至300mg/kg，更优选50至200mg/kg。在这样的连续给药方案之后，活性化合物的总浓度优选地为约0.5至约50μM(例如0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μM)，优选约1至约10μM。

用于抑制GSK-3β或防止肌成纤维细胞和纤维化肺成纤维细胞体外增殖的活性化合物的有效浓度为约0.5μM至约100μM(例如，0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100μM)，更优选约2μM至约20μM。有效浓度、剂量和最佳剂量范围可使用本文中所述的方法体外确定。

在本发明的方法中，化合物或组合物可通过任何合适的施用途径施用于对象，包括经口、口服、通过吸入、皮下、肌内、静脉内、经皮、经阴道、经直肠、或以其任意组合。

在一些实施方案中，化合物或组合物经口、口服、通过吸入、皮下、肌内或静脉内施用。

在一些实施方案中，化合物或组合物经口施用。

在另一些实施方案中，化合物或组合物口服施用。

在另一些实施方案中，化合物或组合物通过吸入来施用。

在另一些实施方案中，化合物或组合物皮下施用。

在另一些实施方案中，化合物或组合物肌内施用。

在另一些实施方案中，化合物或组合物静脉内施用。

现在已总体上描述了本发明，通过参照通过举例说明提供并且除非指明否则不旨在限制本发明的以下实施例将更容易理解本发明。所述实施例包括在内是为了示出本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表由本发明人发现在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所公开的一些具体实施方案作出许多改变，并且其仍获得相似或类似的结果。

实施例I

所有动物研究均由德克萨斯大学泰勒健康科学中心(University of TexasHealth Science Center at Tyler)的机构动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)批准。首先用甲苯噻嗪/氯胺酮通过腹膜内(IP)注射使C57BL/6小鼠(10至12周龄，约20g(来自Jackson Laboratory，Bar Harbor ME))麻醉。然后根据(Sisson TH et al.，Am J Pathol 2015，185：969-860)并进行一些修改引发肺损伤。经由气管内插管气管内施用硫酸博来霉素(Teva，0.8单位/kg)。每天监测动物的呼吸窘迫、显著体重损失或濒死状态的体征。对照组在相同条件下接受生理盐水。

在损伤引发之后14天开始处理。对于GSK-3β抑制剂研究，通过IP注射每天施用用30mg/kg的9-ING-41(由Actuate Therapeutics，Ft.Worth，TX赠予)或载剂对照二甲基亚砜/DMSO以40μl体积进行的处理，持续长至14天。

在28天时间进程完成时，通过flexivent(Tucker T et al.，Am J Respir CellMol Biol 2019(doi：10.1165/rcmb.2018-0121OC.印刷出版之前的电子版)；Kamata H etal.，Sci Rep 2017，7：4556；Boren J et al.，同上；Tucker TA et al.，2014，同上；TuckerTA et al.，Clin Transl Med 5：17，2016)评价小鼠的肺功能(包括弹回性和顺应性)的变化。简言之，用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物使小鼠麻醉。通过将无菌的20号静脉内插管通过声带插入到气管中对经麻醉的小鼠插管，并在肺功能测试期间使用异氟烷将其维持在麻醉状态下。使用flexiVent系统(SCIREQ，Tempe AZ)进行测量。使用“快照扰动法(snapshotperturbation method)”根据制造商的说明书确定肺顺应性。在第28天，使小鼠安乐死并整块(en bloc)收获肺。如上文引用的参考文献中所述，通过对5μm肺组织切片进行三色染色确定肺形态计量术。首先将所有组织切片进行脱石蜡，并在95℃下使用柠檬酸盐缓冲液对其进行抗原修复20分钟。首先通过三色染色评估组织分析物、胶原沉积和定位。使用免疫荧光使α-SMA(MAB1420，R&D)可视化，然后使用共焦显微术使标志物的免疫荧光和共定位可视化。如所述的使用LSM 510 Meta共焦系统(Carl Zeiss)在40×下以0.4μm z轴增量从视野中获取图像。

在第二模型中，如由(Mackinnon AC et al.，Am J Respir Crit Care Med 2012，185：537-46)报道的并进行一些修改通过气管内滴注携带C223 S/C225S突变的组成型活性TGF-β腺病毒载体(Ad-TGF-β)引发肺纤维化。简言之，将3×10

动物研究的所有统计学分析使用曼-惠特尼U检验进行(学生t检验用于体外研究)。小于0.05的p值被认为是显著的。

实施例II

如图1A至1B中所示，用9-ING-41进行的GSK-3β抑制使肺纤维化减弱。向C57Bl/6J小鼠气管内施用硫酸博来霉素(0.8U/kg)并在14天之后，用DMSO(载剂)或GSK-3β抑制剂9-ING-41(30mg/kg)进行处理。以40μl的体积通过腹膜内(ip)注射递送药物，持续长至14天。在28天进程完成时，使用Scireq flexivent确定肺顺应性。还通过门控CT扫描收集肺再现。然后，使用这些再现确定肺容量。9-ING-41处理显著改善了肺顺应性(p＝0.04)和容量(p＝0.026)的降低。

实施例III

由经载剂和经9-ING-41处理的制备肺组织切片(5μm)。将切片脱石蜡并对其进行三色染色以检测肺结构和胶原沉积的变化(三色图像未示出)。图像在20X下采集，并且代表30个视野/载片/小鼠，n＝6只动物/处理。

在整个受损的肺中均发现与博来霉素诱导的肺纤维化相一致的纤维化病灶。整个肺中容易且均匀地存在基质沉积区域。经9-ING-41处理的小鼠也显示出损伤区域；然而，这些区域与在经载剂处理的动物中发现的区域相比数目更少且更小。此外，与经DMSO处理的对照(图2B)相比，在经9-ING-41处理的小鼠中(图2A)，纤维化病灶内的胶原沉积整体上降低。还参见图5A至5F。

实施例IV

对来自经载剂和经9-ING-41处理的小鼠的肺切片针对α-SMA(肌成纤维细胞分化的一种标志物)进行免疫染色。通过共焦显微术在40X下采集图像(图6A和6B)。当与经载剂处理的对照(DMSO)相比时，在经9-ING-41处理的小鼠中9-ING-41处理使α-SMA表达降低。实心箭头指示胶原α-SMA表达的区域。图像是30个视野/小鼠的代表，并且n＝3只小鼠/处理。

对来自经载剂和经9-ING-41处理的小鼠的肺切片针对胶原1沉积进行免疫染色，并通过共焦显微术在40X下成像。与经载剂(DMSO)处理的对照相比，9-ING-41使博来霉素损伤肺中胶原1沉积降低。这些结果表明，用9-ING-41进行的GSK-3β抑制使纤维化肺损伤中的胶原沉积降低。

对来自经载剂和经9-ING-41处理的小鼠的肺切片针对α-SMA(肌成纤维细胞分化的一种标志物)进行免疫染色。通过共焦显微术在40X下采集图像(图7A和7B)。实心箭头指示胶原α-SMA表达的区域。图像是30个视野/小鼠的代表，并且n＝3只小鼠/处理。当与经载剂处理的对照相比时，在经药物处理的小鼠中9-ING-41处理使α-SMA表达降低。

如(Mackinnon AC et al.，Am J Respir Crit Care Med 2012，185：537-46)先前报道的并进行一些修改通过气管内滴注携带C223S/C225S突变的组成型活性TGF-β腺病毒载体(Ad-TGF-β)引发肺纤维化。简言之，将3×10

结果示于图3中。与各个经载剂处理或经假载体处理的对照相比，经9-ING-41处理的小鼠显示出显著改善的肺顺应性。图4A/4B显示与经DMSO处理的对照相比在经9-ING-41处理的小鼠中损伤且胶原沉积提高的区域减小。

IPF的特征在于：提高的肌成纤维细胞存在以及随后提高的胞外基质(ECM)蛋白(例如胶原和纤连蛋白)的沉积。在本发明的IPF模型中，硫酸博来霉素和TGF-β腺病毒通过气管内插管来引入，气管内插管是一种产生稳健且一致的损伤的方法(因此需要较少的动物就可产生统计学上显著的结果)。

博来霉素和TGF-β-腺病毒介导的纤维化的特征在于：存在包含胶原和促进肺瘢痕化、正常肺结构丧失和肺功能受损的其他ECM基质蛋白的纤维化病灶。此外，这些纤维化病灶还包含数目提高的肌成纤维细胞，其被认为是ECM沉积提高的主要来源。

为了评价优选的GSK-3β抑制性化合物9-ING-41的效力，在可检测到肺结构和功能的改变的时间点进行IPF干预。基于初步研究，选择14天时间点进行博来霉素损伤研究，以及选择7天进行TGF-β腺病毒研究。在时间进程(分别为28天和14天)完成时，两个模型中经9-ING-41处理的小鼠不仅表现出改善的肺功能而且还显示出提高的肺容量。

基于以上所讨论和例示的组织病理学分析，本发明人得出这样的结论：由于9-ING-41处理，与降低的瘢痕化组合的降低的纤维化病灶数目有助于肺功能的恢复。共焦显微术分析进一步显示，与在经载剂处理的对照动物中相比，在经9-ING-41处理的小鼠中发现的纤维化病灶数目更少、更小并且包含显著更少的胶原。在肺纤维化的两个独立模型中的这些类似发现表明9-ING-41处理显著改善了IPF结局。此外，该作用被认为至少部分地由成纤维细胞-肌成纤维细胞分化减弱引起。本发明结果表明，用9-ING-41进行的GSK-3β抑制代表了针对IPF的新治疗。

这些是表明GSK-3β信号传导途径对于诱导肌成纤维细胞分化至关重要的最早研究。这些研究还表明，对GSK-3β的治疗性靶向使肺纤维化的进展减弱；还预期该作用在人对象中发生。由于对GSK-3β的治疗性靶向减轻了体内纤维化肺重塑，这项工作为靶向GSK-3β信号传导途径以控制成纤维细胞-肌成纤维细胞分化和肺纤维化结局提供了基础。特别地由9-ING-41产生的显著改善的顺应性和容量也是其在小鼠模型中治疗IPF的有效性的重要指标，并且预期这也在人IPF患者中发生。

以上引用的参考文献全部均通过引用并入本文，无论是否具体地并人。

现在已完全描述了本发明，本领域技术人员将理解，本发明可在广泛多个等效的参数、浓度和条件内进行，而不脱离本发明的精神和范围，并且无需过多的实验。

本公开内容还涵盖以下方面：

方面1.被配制用于注射或肺滴注的抗纤维化药物组合物，其包含：

(i)抑制酶β型糖原合酶激酶3(GSK-3β)的苯并呋喃-3-基-(吲哚3-基)马来酰亚胺化合物，其在体外或体内测定中至少具有9-ING-41的生物活性或生物化学活性的至少20％；

(ii)可药用的载体或赋形剂。

方面2.方面1所述的药物组合物，其中所述化合物是9-ING-41或9-ING-41的类似物，其在体外或体内测定中具有9-ING-41的生物活性或生物化学活性的至少20％，9-ING-41的化学式为：

方面3.方面2所述的药物组合物，其中所述化合物是9-ING-41。

方面4.方面1至3中任一个所述的药物组合物，其配制成用于肺滴注。

方面5.用于抑制肺肌成纤维细胞增殖和/或分化为纤维化肺(FL)成纤维细胞以及降低所述FL成纤维细胞增殖的方法，其包括向所述肌成纤维细胞和FL成纤维细胞提供有效GSK-3β抑制量的方面1至4中任一个所述的化合物或组合物。

方面6.方面5所述的方法，其中所述化合物是9-ING-41或其所述类似物。

方面7.方面6所述的方法，其中所述化合物是9-ING-41。

方面8.方面7所述的方法，其中所述组合物被配制用于肺滴注。

方面9.方面5至8中任一个所述的方法，其中所述提供在体内进行。

方面10.方面9所述的方法，其中所述提供通过肺滴注进行。

方面11.方面9或10所述的方法，其中所述提供针对人。

方面12.用于治疗患有或发生以特发性肺纤维化(IPF)为特征的疾病或病症的哺乳动物对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的方面1至4中任一个所述的药物组合物。

方面13.方面12所述的方法，其中所述化合物或组合物包含9-ING-41或其在体外或体内测定中具有9-ING-41的生物活性或生物化学活性的至少20％的所述类似物。

方面14.方面13所述的方法，其中所述化合物是9-ING-41。

方面15.方面12至14中任一个所述的方法，其中所述对象是人。

方面16.方面1至4中任一个所述的组合物用于在哺乳动物对象中治疗IPF的用途，其中所述化合物抑制GSK-3β，以及抑制肺肌成纤维细胞增殖和/或分化为FL成纤维细胞，以及降低所述FL成纤维细胞增殖；以及向患有IPF的对象施用有效量的所述组合物。

方面17.根据方面16所述的用途，其中所述化合物是9-ING-41或其所述类似物。

方面18.根据方面17所述的用途，其中所述化合物是9-ING-41。

方面19.根据方面16至18中任一个所述的用途，其中所述组合物通过肺滴注来施用。

方面20.根据方面1至4中所述的组合物用于制备用于在有此需要的对象中治疗IPF的药物的用途，所述化合物抑制GSK3β活性，以及抑制肺肌成纤维细胞增殖和/或分化为FL成纤维细胞，以及降低所述FL成纤维细胞增殖。

方面21.根据方面20所述的用途，其中所述化合物是9-ING-41或其在体外或体内测定中具有9-ING-41的生物活性或生物化学活性的至少20％的类似物。

方面22.根据方面21所述的用途，其中所述化合物是9-ING-41。

方面23.根据方面20至22中任一个所述的用途，其用于制备在IPF治疗中用于肺滴注的药物。

方面24.根据方面20至24中任一个所述的用途，其中所述对象是人。