具有增强稳定性的猿猴腺病毒载体的制剂

发明领域

本发明涉及猿猴腺病毒载体配制于液体组合物中、其制剂和使用所述组合物的方法。

背景

腺病毒载体代表借此将编码预防性或治疗性蛋白的核酸序列并入腺病毒基因组中的预防性或治疗性蛋白递送平台，当将腺病毒颗粒施用于治疗的受试者时，使所述预防性或治疗性蛋白表达。在本领域中已经存在开发腺病毒载体的稳定制剂的挑战，所述稳定制剂允许在可接受的储存温度以相当长的保质期储存。

已经报道了通过冻干来稳定猿猴腺病毒(WO 2017/013169;

发明概述

发明人令人惊讶地发现，生育酚和重组人血清白蛋白当并入包含无定形糖的组合物中时大大增加猿猴腺病毒的稳定性。因此，本发明提供了用于猿猴腺病毒的稳定的水性液体制剂，其包含生育酚、重组人血清白蛋白和至少一种无定形糖。如本文所述配制的腺病毒是热稳定的。本发明进一步提供了使用稳定的重组猿猴腺病毒，通过将转基因递送至人受试者来赋予预防性免疫和充当治疗载体的方法。

附图简述

图1：重量摩尔渗透压浓度和糖组成对稳定性的影响。将病毒暴露于4℃的温度两个半月或暴露于30℃的温度一个月后，通过PICOGREEN测量稳定性。

图2：海藻糖、蔗糖、VES和rHSA对稳定性的影响。“BDS-ADVAR”是指10 mM Tris pH8.5、5 mM NaCl、10 mM组氨酸、0.025%聚山梨醇酯80 (w/v)和1 mM MgCl

图3A：在4℃的实时稳定性。通过两次独立的分析型HPLC方法(实线和虚线)测量的经六个月时段的10 mM Tris pH 8.5、5 mM NaCl、10 mM组氨酸、0.024%聚山梨醇酯80 (w/v)、1 mM MgCl

图3B：在4℃的实时稳定性。通过两次独立的分析型HPLC方法(实线和虚线)测量的经六个月时段的10 mM Tris pH 8.5、5 mM NaCl、10 mM组氨酸、0.024%聚山梨醇酯80 (w/v)、1 mM MgCl

图3C：在4℃的实时稳定性。通过两次独立的分析型HPLC方法(实线和虚线)测量的经六个月时段的10 mM Tris pH 8.5、5 mM NaCl、10 mM组氨酸、0.024%聚山梨醇酯80 (w/v)、1 mM MgCl

图4：通过IFNγ ELIspot测定的小鼠的免疫原性，并与冻干的猿猴腺病毒进行比较。

图5：经由金属和光氧化的猿猴腺病毒的强制降解。在加速氧化测试(AOT)条件下将病毒暴露于金属和光氧化后，通过分析型高效液相色谱(HPLC)测量稳定性。

详述

发明人发现，为了稳定人腺病毒载体而开发的制剂不能成功地应用于所有腺病毒载体，例如猿腺病毒载体，使其稳定，因此可用于预防或治疗。例如，用于稳定人腺病毒的A195缓冲液(10 mM Tris pH 7.4、10 mM组氨酸、75 mM NaCl、5%蔗糖、0.02%聚山梨醇酯80、0.1mM EDTA、1 mM MgCl

腺病毒是含有双链DNA基因组的具有二十面体衣壳的无包膜病毒。所述衣壳包含三种主要蛋白：六邻体(II)、五邻体基质(III)和有节纤突(IV)，连同许多其他次要蛋白VI、VIII、IX、IIIa和IVa2，其介导腺病毒感染的早期阶段。所述六邻体占所述衣壳的结构组分的大部分，所述衣壳由240个三聚的六邻体壳粒和12个五邻体基质组成。所述六邻体具有三个保守双桶(barrel)，而顶部具有三个塔(tower)，每个塔含有来自每个亚基的环，所述亚基形成衣壳的大部分。六邻体的基质在腺病毒血清型之间是高度保守的，而表面环是可变的。所述五邻体是另一种腺病毒衣壳蛋白，其形成纤突所附接的五聚的基质。三聚的纤突蛋白从在衣壳的12个顶点中的每一个处的五邻体基质伸出且是有节的杆状结构。所述纤突蛋白的主要作用是经由节区域与细胞受体的相互作用而将病毒衣壳拴系至细胞表面，并且纤突的柔性轴以及节区域中的变异是不同血清型特征性的。

“猿猴”意指类人猿下目(infraorder Simiiformes)的任何成员。其包括阔鼻类(新世界猴)和狭鼻类(旧世界猴和猿)。其包括倭黑猩猩、卷尾猴、黑猩猩、长臂猿、大猩猩、大猿猴、吼猴、狨猴、猩猩(orangutan)、枭猴、粗尾猴(sakis)、蜘蛛猴、松鼠猴、tamarinds、伶猴(titis)、秃猴和绒毛猴。已经从猿猴、诸如黑猩猩、倭黑猩猩、恒河猴和大猩猩分离许多腺病毒。已经显示源自这些腺病毒的载体诱导对编码的转基因的强免疫应答(

腺病毒可用作用于递送期望的RNA或蛋白序列、例如异源序列、用于在体内表达的载体。腺病毒载体可以包括任何遗传元件，包括裸露DNA、噬菌体、转座子、粘粒、附加体、质粒或病毒。此类载体含有猿猴腺病毒的DNA和表达盒。“表达盒”(或“微基因”)意指选择的异源基因(“转基因”或“目标基因”)和驱动宿主细胞中的基因产物的翻译、转录和/或表达所必需的其他调节元件的组合。在本发明的实施方案中，所述猿猴腺病毒载体可以包含启动子、增强子和报告基因中的一种或多种。

本发明的腺病毒载体可以含有猿猴腺病毒DNA。在一个实施方案中，本发明的腺病毒载体源自非人猿猴腺病毒，也称为“猿猴腺病毒”。许多腺病毒已分离自非人猿猴，诸如黑猩猩、倭黑猩猩、猕猴、猩猩和大猩猩。源自这些腺病毒的载体可以诱导针对由这些载体编码的转基因的强烈免疫应答。基于非人猿猴腺病毒的载体的某些优点包括在人靶标群体中相对缺乏针对这些腺病毒的交叉中和抗体，因此其使用克服了预先存在的对人腺病毒的免疫力。

本发明的腺病毒载体可以源自非人猿猴腺病毒，例如，源自黑猩猩(黑猩猩(

除了转基因以外，所述表达盒还可以包括以特定方式与所述转基因可操作地连接的常规控制元件，所述方式允许所述转基因在用腺病毒载体转染的细胞中的转录、翻译和/或表达。如本文所用，“可操作地连接的”序列包括与目标基因邻接的表达控制序列和以反式或在一定距离处起作用以控制目标基因的表达控制序列两者。

调节元件，即，表达控制序列，包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，诸如剪接和聚腺苷酸化(聚A)信号，包括兔β-珠蛋白聚A；四环素可调节系统、微RNA、转录后调节元件(例如WPRE、土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件)；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和当期望时，增强编码的产物的分泌的序列。

“启动子”是允许RNA聚合酶的结合并指导基因的转录的核苷酸序列。通常，启动子位于靠近转录起始位点的基因的非编码区域中。在转录的起始中发挥功能的启动子内的序列元件经常通过共有核苷酸序列表征。启动子的实例包括但不限于来自细菌、酵母、植物、病毒和哺乳动物(包括猿猴和人)的启动子。大量表达控制序列(包括内部的、天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子)是本领域中已知的，并且可以被利用。

如本文所用的“转录后调节元件”是这样的DNA序列，其在转录时增强通过本发明的病毒载体递送的一种或多种转基因或其片段的表达。转录后调节元件包括但不限于乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)和土拨鼠肝炎转录后调节元件(WPRE)。WPRE是三部分顺式作用元件，其已被证明增强由某些(但不是全部)启动子驱动的转基因表达。

由所述腺病毒载体编码的转基因将通常编码在生物学或医学中有用的产物(诸如治疗性的或免疫原性的蛋白、酶或RNA)。期望的RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化RNA、RNA适体和反义RNA。有用的RNA序列的一个实例是消除治疗的受试者中的靶向核酸序列的表达的序列。所述转基因可以编码多肽或蛋白，其用于治疗例如遗传缺陷，用作癌症治疗剂或疫苗，用于诱导免疫应答，和/或用于预防性疫苗目的。具体地，所述多肽或蛋白是抗原。

如本文所用，免疫应答的诱导是指蛋白(也被称作“抗原”或“免疫原”)诱导对所述蛋白的T细胞和/或体液免疫应答的能力。除非另有指示，否则“疗法”或“治疗性”可能涉及预防性和治愈性疗法中的任一种或两种。

所述转基因可用于预防或治疗，例如，作为用于诱导免疫应答的疫苗，以通过校正或替换缺陷或缺失的基因来校正遗传缺陷，或作为癌症治疗剂。具体地，所述免疫应答是保护性免疫应答。

本发明的组合物可以是免疫原性组合物。任选地，可以将本发明的混合物或组合物配制成含有其他组分，包括、例如，另外的一种或多种免疫原，例如，一种或多种多肽抗原和/或佐剂。在一个实施方案中，本发明提供了包含佐剂的疫苗。这种佐剂可以与编码抗原的引发DNA疫苗一起施用，以与用仅编码抗原的DNA疫苗引发后生成的免疫应答相比增强抗原特异性的免疫应答。或者，这种佐剂可以与多肽抗原一起施用，所述多肽抗原在涉及本发明的腺病毒载体的方案中施用。

由转基因引发的免疫应答可以是抗原特异性B细胞应答，其产生中和抗体。引发的免疫应答可以是抗原特异性T细胞应答，其可以是全身性应答和/或局部应答。抗原特异性T细胞应答可以包括CD4+ T细胞应答，诸如涉及表达细胞因子(例如干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和/或白介素2(IL2))的CD4+ T细胞的应答。可替代地或另外地，所述抗原特异性T细胞应答包括CD8+ T细胞应答，诸如涉及表达细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD8+ T细胞的应答。

因此，由于由腺病毒载体编码的转基因的作用，本发明的组合物用于受试者的预防性(即，免疫原性或预防性)或治疗性治疗。本发明的组合物适合于肌内注射。

本发明的方法可以诱导对疾病的保护性或治疗性免疫应答。在一个实施方案中，所述疾病是感染性或致癌性疾病。在一个实施方案中，通过将受试者针对病原体免疫或接种疫苗来实现保护性免疫应答。因此，本发明可应用于预防、治疗或改善由于感染人和非人脊椎动物的病原体(例如，病毒、细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生虫)的感染或由于癌细胞或肿瘤细胞导致的疾病。免疫原可以选自各种病毒、细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生虫。

“热稳定的”腺病毒制剂是其中腺病毒可以在中等高相对温度下抵抗其物理或化学结构的不可逆变化而不失去其特征性特性的制剂。

术语“复制缺陷的”或“不能复制的”腺病毒是指这样的腺病毒，其不能复制，因为其已经被工程改造以至少包含功能缺失(或“功能丧失”突变)，即在不将基因完全除去的情况下损害该基因的功能的缺失或突变，例如人工终止密码子的引入，活性位点或相互作用结构域的缺失或突变，基因的调节序列的突变或缺失等，或编码对于病毒复制必需的基因产物的基因的完全除去，诸如选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4 (诸如E3 ORF1、E3 ORF2、E3ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2和/或E4 ORF1)的腺病毒基因中的一个或多个的完全除去。合适地，E1和任选地E3和/或E4被缺失。如果缺失，当确定相对于另一个序列的百分比同一性时，合适地将在比对中不考虑前面提及的缺失的基因区域。

为了比较两个密切相关的多核苷酸或多肽序列的目的，使用比对程序诸如BLAST®(可在blast.ncbi.nlm.nih.gov得到，在2015年3月09日最后一次登录)使用标准设置，可以计算第一序列和第二序列之间的“%同一性”。%同一性是相同残基的数目除以参考序列中的残基的数目，乘以100。在上面和在权利要求中提及的%同一性数字是通过该方法计算的百分比。%同一性的一个替代定义是相同残基的数目除以比对的残基的数目，乘以100。

替代方法包括使用缺口方法，其中在评分参数中的缺口评分或缺口成本中考虑在比对中的缺口，例如在一个序列中相对于其他序列的缺失。关于更多信息，参见可在ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/factsheets/HowTo_BLASTGuide.pdf得到的BLAST®文本说明，在2015年3月09日最后一次登录。

保留多核苷酸或由其编码的多肽的功能性的序列可能是更密切相同的。如果多肽或多核苷酸序列在它们的整个长度上共有100%序列同一性，则所述多肽或多核苷酸序列被称为与其他多肽或多核苷酸序列是相同的或同一的。

序列之间的“差异”是指与第一序列相比，在第二序列的位置中的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代。两个多肽序列可以含有1个、2个或更多个此类氨基酸差异。在否则与第一序列同一(100%序列同一性)的第二序列中的插入、缺失或取代导致百分比序列同一性降低。例如，如果同一序列是9个氨基酸残基长，则第二序列中的一个取代导致88.9%的序列同一性。如果同一序列是17个氨基酸残基长，则第二序列中的两个取代导致88.2%的序列同一性。如果同一序列是7个氨基酸残基长，则第二序列中的三个取代导致57.1%的序列同一性。如果第一和第二多肽序列是9个氨基酸残基长且共有6个相同残基，则所述第一和第二多肽序列共有大于66%同一性(所述第一和第二多肽序列共有66.7%同一性)。如果第一和第二多肽序列是17个氨基酸残基长且共有16个相同残基，则所述第一和第二多肽序列共有大于94%同一性(所述第一和第二多肽序列共有94.1%同一性)。如果第一和第二多肽序列是7个氨基酸残基长且共有3个相同残基，则所述第一和第二多肽序列共有大于42%同一性(所述第一和第二多肽序列共有42.9%同一性)。

或者，为了将第一参考多肽序列与第二比较多肽序列进行比较的目的，可以确定为了产生第二序列向第一序列做出的添加、取代和/或缺失的数目。添加是将一个氨基酸残基添加至第一多肽的序列中(包括添加在第一多肽的任一个末端处)。

取代是用一个不同的氨基酸残基取代第一多肽的序列中的一个氨基酸残基。缺失是从第一多肽的序列缺失一个氨基酸残基(包括在第一多肽的任一个末端处的缺失)。为了将第一参考多核苷酸序列与第二比较多核苷酸序列进行比较的目的，可以确定为了产生第二序列向第一序列做出的添加、取代和/或缺失的数目。添加是将一个核苷酸残基添加至第一多核苷酸的序列中(包括添加在第一多核苷酸的任一个末端处)。取代是用一个不同的核苷酸残基取代第一多核苷酸的序列中的一个核苷酸残基。缺失是从第一多核苷酸的序列缺失一个核苷酸残基(包括在第一多核苷酸的任一个末端处的缺失)。合适地，本发明的序列中的取代可以是保守取代。保守取代包含将一个氨基酸用另一个氨基酸取代，所述另一个氨基酸具有与被取代的氨基酸类似的化学特性(参见，例如，Stryer等人,

酸性氨基酸优选地是天冬氨酸或谷氨酸。芳族氨基酸优选地选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。非极性脂族氨基酸优选地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸。极性的、不带电荷的氨基酸优选地选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。与保守的氨基酸取代不同，非保守的氨基酸取代是用没有落入上述保守取代(i)至(v)下的任一氨基酸对一个氨基酸的交换。

可替代地或另外地，疫苗构建体的交叉保护宽度可以通过包含抗原的medoid序列来增加。“medoid”意指与其他序列具有最小差异的序列。可替代地或另外地，本发明的载体包含蛋白或其免疫原性片段的medoid序列。可替代地或另外地，所述medoid序列源自在NCBI数据库中注释的所有相关蛋白序列间具有最高平均氨基酸同一性百分比的天然病毒毒株。

作为遗传密码中的冗余的结果，多肽可以由各种不同的核酸序列编码。编码偏向于与其他相比更多地使用一些同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)。“密码子优化的”意指在不改变氨基酸序列的情况下对重组核酸的密码子组成进行修饰。密码子优化已用于通过使用生物体特异性的密码子使用频率来提高不同生物体中的mRNA表达。

除了密码子偏爱之外，且与密码子偏爱无关，开放阅读框中的密码子的毗邻不是随机的，并且比其他更频繁地使用一些密码子对。此密码子对偏爱意味着一些密码子对被代表过多，而其他被代表不足。“密码子对优化的”意指在不改变个别密码子的氨基酸序列的情况下在密码子配对中进行修饰。本发明的构建体可以包含密码子优化的核酸序列和/或密码子对优化的核酸序列。

术语“能够复制的”腺病毒是指在没有宿主细胞中包含的任何重组辅助蛋白存在的情况下可以在所述细胞中复制的腺病毒。合适地，“能够复制的”腺病毒包含完整的结构基因和以下完整的或功能性的必需早期基因：E1A、E1B、E2A、E2B和E4。

在本发明的一个实施方案中，所述载体是腺病毒载体的功能性或免疫原性衍生物。“腺病毒载体的衍生物”意指载体的修饰形式，例如，所述载体的一个或多个核苷酸被缺失、插入、修饰或取代。

可以使用本领域技术人员已知的技术来生成本发明的猿猴腺病毒。它们可以在宿主细胞系、即其中病毒能够复制的任何合适的细胞系中产生。可以例如在互补细胞系中产生复制缺陷的病毒，所述互补细胞系提供了这样的因子，其从所述病毒载体缺失，导致其复制特征受损(诸如E1)。

使用本文提供的技术和序列，结合本领域技术人员已知的技术，生成本发明的载体。此类技术包括cDNA的常规克隆技术(诸如在教科书中描述的那些)、腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列的使用、聚合酶链式反应、和提供期望的核苷酸序列的任何合适方法。

本发明的赋形剂可以包括缓冲剂、盐、表面活性剂、糖、有机化合物、螯合剂和蛋白。当本发明的赋形剂在水性制剂中时，其起作用以稳定猿猴腺病毒。

“缓冲剂”是指能够中和酸和碱两者、由此维持溶液的pH的物质。本发明的合适的缓冲剂包括Tris、琥珀酸盐、硼酸盐、Tris-马来酸盐、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、柠檬酸盐、碳酸盐或其组合。

“水性”是指水。水性组合物是其中溶剂是水的组合物。

“盐”是指由酸和碱的中和反应产生的离子化合物，其由相关数目的阳离子和阴离子构成，使得所述产物不具有净电荷，例如氯化钠。组分离子可以是无机的或有机的，且可以是单原子的或多原子的。

“无定形糖”是指其中组成颗粒以无规方式排列的糖。

“螯合剂”是指与金属离子反应以形成稳定的水溶性络合物的化学物质。本发明的赋形剂可以包括选自乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇-双(β-氨基乙基醚) -N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)的螯合剂。

“表面活性剂”是指减少其中溶解该物质的液体的表面张力的物质。本发明的赋形剂可以包括表面活性剂，其选自聚山梨醇酯表面活性剂(例如聚山梨醇酯80和/或聚山梨醇酯20)、泊洛沙姆表面活性剂(例如泊洛沙姆188)、octoxinal表面活性剂、聚多卡醇表面活性剂、聚氧乙烯硬脂酸酯表面活性剂、聚氧乙烯蓖麻油表面活性剂、N-辛基-葡萄糖苷表面活性剂、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯和它们的组合。在一个实施方案中，所述表面活性剂选自泊洛沙姆表面活性剂(例如泊洛沙姆188)、聚山梨醇酯表面活性剂(例如聚山梨醇酯80和/或聚山梨醇酯20)，尤其是聚山梨醇酯表面活性剂，诸如聚山梨醇酯80。表面活性剂也可用于配制生育酚。

“维生素E”，即生育酚，是指一系列手性有机分子，其在其色原烷醇环的苯酚部分的甲基化程度方面不同。生育酚充当脂溶性抗氧化剂。该术语包括α、β、γ和δ生育酚。各种生育酚盐包括琥珀酸生育酚、乙酸生育酚、烟酸生育酚和其他酯化形式。

“琥珀酸维生素E”或“VES”意指任何琥珀酸α生育酚，包括但不限于4-氧代-4-[[2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基十三烷基)-3,4-二氢色烯-6-基]氧基]丁酸、D-α-生育酚琥珀酸盐、半合成D-α-生育酚琥珀酸盐、α生育酚酸琥珀酸盐、RRR-α-生育酚琥珀酸氢盐、D-α-生育酚琥珀酸盐、(+)-α-生育酚、(+)-δ生育酚、生育酚半琥珀酸盐和生育酚酸琥珀酸盐。通常，经验式将是C

“重组人血清白蛋白”、“rHSA”或“人白蛋白”意指由人ALB基因编码且通过本领域已知的重组方法产生的蛋白。

TRAVASOL是pH 5.0-7.0的必需和非必需氨基酸与乙酸根和氯阴离子的溶液，所述氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸。

腺病毒在冷冻时是稳定的，但除非适当配制，否则在较高温度下迅速降解。降解可能由诸如但不限于以下的因素引起：热；氧化，例如由于光、过氧化物或金属导致的氧化；剪切应力；空气界面对液体制剂的影响；冻融循环；或这些因素的组合。腺病毒经历降解的途径包括衣壳破坏、聚集、氧化和脱酰胺。

“稳定性”是指对降解的抗性。腺病毒稳定性可以通过病毒衣壳的完整性来测量。例如，PICOGREEN测定法利用对双链DNA选择性的荧光核酸染色剂。HPLC可以定量完整的病毒颗粒；释放的DNA的百分比基于包含新鲜解冻的对照组和完全降解的对照的回归曲线。定量PCR可用于定量病毒DNA (gE/ml =每ml基因组当量)。

“感染性”是指载体进入易感宿主、即细胞并递送其遗传物质以用于由宿主表达的能力。感染性可以通过测量病毒颗粒进入细胞、例如通过免疫染色病毒蛋白来测定。感染性测定是本领域已知的，且包括“50%细胞培养物感染剂量(CCID

CCID

感染单位(“IFU”)提供了感染性病毒颗粒的数目的量度，例如每ml或每剂，并提供了病毒进入细胞和复制的量度。IFU是基于噬斑的测定，读出值是六邻体蛋白的免疫染色，其通过显微镜检查确定，并且可以表示为每毫升感染单位(IFU/ml)。定量基于感染颗粒的数目，其中每个噬斑代表一个感染性颗粒。

六邻体或转基因的感染性是指在给定时间点感染细胞的能力，并且可用于测量病毒复制。读出值可以是例如转基因或六邻体蛋白的免疫染色，例如通过FACS分析确定，其中定量基于阳性细胞的数目。

在具体实施方案中，所述腺病毒载体源自猿猴腺病毒。例如，所述猿猴腺病毒可以是来自新世界猴、旧世界猴或猿的腺病毒。它可能是来自黑猩猩，倭黑猩猩，大猩猩，猩猩(orangutan)或猕猴的腺病毒。本发明的黑猩猩腺病毒包括但不限于ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、ChAdOx1和ChAdOx2。此类毒株的实例描述于WO03/000283、WO2010/086189和WO 2016/198621中。本发明的倭黑猩猩腺病毒包括但不限于PanAd1、PanAd2或PanAd3、Pan 5、Pan 6、Pan 7(也称为C7)和Pan9。倭黑猩猩载体可见于例如WO2005/071093和WO2010/086189。本发明的大猩猩腺病毒包括但不限于GADNOU19、GADNOU20、GADNOU21、GADNOU25、GADNOU26、GADNOU27、GADNOU28、GADNOU29、GADNOU30和GADNOU31。大猩猩载体可见于例如WO2013/52799、WO2013/52811、WO2013/52832和WO2019/008111。

本发明的组合物包含选自Tris、琥珀酸盐、硼酸盐、Tris-马来酸盐、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、柠檬酸盐、碳酸盐或其组合的缓冲剂。在一个实施方案中，所述缓冲剂是Tris、琥珀酸盐或硼酸盐。在一个进一步实施方案中，所述缓冲剂是Tris。所述缓冲剂可以以至少1mM、至少2.5mM或至少5mM的量存在。所述缓冲剂可以以小于25mM、小于20mM或小于15mM的量存在。例如，所述缓冲剂可以以1至25mM、2.5至20mM或5至15mM的量存在。在一个实施方案中，所述缓冲剂以约10mM的量存在。

在一个实施方案中，本发明的组合物还包含最高达约20mM的量、例如约10mM的浓度的组氨酸。

在一个实施方案中，本发明的组合物还包含最高达约50mM的量、例如约5mM的浓度的NaCl。

在一个实施方案中，本发明的组合物还包含二价金属离子，诸如Mg

在一个实施方案中，本发明的组合物还包含泊洛沙姆表面活性剂或聚山梨醇酯表面活性剂。在一个实施方案中，所述泊洛沙姆表面活性剂是泊洛沙姆188。在一个实施方案中，所述聚山梨醇酯表面活性剂是聚山梨醇酯80和/或聚山梨醇酯20。所述表面活性剂可以以约0.01至0.05% (w/v)、诸如约0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%或0.045%的量存在。在一个实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80，并且以约0.020至0.030%或约0.025%(w/v)的量存在。

在一个实施方案中，本发明的组合物还包含α生育酚琥珀酸盐。在一个实施方案中，所述α生育酚琥珀酸盐是琥珀酸维生素E。所述α生育酚琥珀酸盐可以以最多达约0.5mM、诸如约0.01至0.25mM、诸如0.05mM、0.10mM、0.15mM或0.20mM的量存在。在一个实施方案中，所述α生育酚琥珀酸盐是琥珀酸维生素E，并且以约0.05mM的量存在。

在一个实施方案中，本发明的组合物还包含重组人血清白蛋白，其量最高达约1%(w/v)，例如其量为约0.01%、0.025%、0.05%. 0.075%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%或约0.9%。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含至少一种无定形糖，诸如蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、棉子糖、乳糖醇、山梨糖醇和乳糖酸、葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、乳酮糖、麦芽糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖醇、异麦芽酮糖醇(palatinit)、水苏糖、松三糖、葡聚糖或其组合。在一个实施方案中，所述无定形糖是海藻糖、蔗糖或蔗糖和海藻糖的组合。在一个实施方案中，所述无定形糖是蔗糖。在一个实施方案中，所述无定形糖是蔗糖和海藻糖的组合。在一个实施方案中，所述无定形糖是海藻糖。

在一个实施方案中，所述无定形糖以约0%至30%(w/v)的量存在。在一个实施方案中，所述无定形糖是最高达约30%(w/v)的量的蔗糖。在一个实施方案中，蔗糖以约0至10%或0至5%(w/v)的量、例如约2%的量存在。在另一个实施方案中，蔗糖以约10%至30%(w/v)的量、例如约16%的量存在。

在一个实施方案中，所述无定形糖是最高达约30%(w/v)的量的海藻糖。在一个实施方案中，海藻糖以约10至20%(w/v)的量、例如约15%的量存在。

在一个实施方案中，所述无定形糖是蔗糖和海藻糖的组合，其量为约0至10%蔗糖(w/v)和约10至30%海藻糖(w/v)；其量为约0至5%蔗糖和10至20%海藻糖，例如其量为约2%蔗糖和15%海藻糖。

在一个具体实施方案中，本发明的组合物包含约1至25 mM Tris pH 6-10，约0至15 mM组氨酸，约0至50 mM NaCl，约0.1至10 mM MgCl

在一个具体实施方案中，本发明的组合物包含约1至25 mM Tris pH 6-10，约0至15 mM组氨酸，约0至50 mM NaCl，约0.1至10 mM MgCl

在一个更具体实施方案中，本发明的组合物包含约2.5至20 mM Tris pH 7.5至9.5，约5至15 mM组氨酸，约0至10 mM NaCl，约0.5至5 mM MgCl

在另一个更具体实施方案中，本发明的组合物包含约2.5至20 mM Tris pH 7.5至9.5，约5至15 mM组氨酸，约0至10 mM NaCl，约0.5至5 mM MgCl

在一个进一步更具体实施方案中，本发明的组合物包含约5至15 mM Tris pH 7.5至9.5，约8至12 mM组氨酸，约0.5至2.5 mM NaCl，约0.5至5 mM MgCl

在又一个进一步更具体实施方案中，本发明的组合物包含约5至15 mM Tris pH7.5至9.5，约8至12 mM组氨酸，约0.5至2.5 mM NaCl，约0.5至5 mM MgCl

在又一个进一步更具体实施方案中，本发明的组合物包含约5至15 mM Tris pH7.5至9.5，约8至12 mM组氨酸，约0.5至2.5 mM NaCl，约0.5至5 mM MgCl

在一个最具体实施方案中，本发明的组合物包含约10 mM Tris pH 8.5，约10 mM组氨酸，约5 mM NaCl，约1 mM MgCl

在另一个最具体实施方案中，本发明的组合物包含约10 mM Tris pH 8.5，约10mM组氨酸，约5 mM NaCl，约1 mM MgCl

在一个进一步最具体实施方案中，本发明的组合物包含约10 mM Tris pH 8.5，约10 mM组氨酸，约5 mM NaCl，约1 mM MgCl

在一个实施方案中，本发明提供了通过在宿主细胞中产生猿猴腺病毒并将腺病毒与一种或多种赋形剂组合来制备本文所述的水性液体组合物的方法，其中所述腺病毒在+2-+ 8℃下稳定至少两年。

在另一个实施方案中，本发明提供了通过在宿主细胞中产生猿猴腺病毒并将腺病毒与一种或多种赋形剂组合来制备本文所述的水性液体组合物的方法，其中所述腺病毒在25℃下稳定至少30天。

在一个进一步实施方案中，本发明提供了通过在宿主细胞中产生猿猴腺病毒并将腺病毒与一种或多种赋形剂组合来制备本文所述的水性液体组合物的方法，其中所述腺病毒在30℃下稳定至少七天。

本发明的水性组合物可以包含在玻璃瓶中，所述玻璃瓶可以是硅化的或非硅化的。它们可以包含在预填充的注射器、用或不用吹瓶-灌装-密封(blow-fill-seal)的塑料容器、用于皮内施用的微针装置以及用于容纳病毒的其他容器中。

除非另有解释，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。单数术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有清楚指出。类似地，词语“或”意欲包括“和”，除非上下文另有清楚指示。

关于物质的浓度或水平(诸如溶液组分浓度或其比率)和反应条件(诸如温度、压力和循环时间)给出的数值限值，意欲是近似值。本文使用的术语“约”意指量±10%。

术语“包含”意指“包括”。因此，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprises)”和变体诸如“包含(comprise)”和“包含(comprising)”被理解为暗示包括所述化合物或组合物(例如，核酸，多肽，抗原)或步骤，或一组化合物或步骤，但不排除其他化合物、组合物、步骤或其组。缩写“例如(

术语“基本上”不排除“完全”。例如，基本上不含X的组合物可以完全不含X。

现在将借助于以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1：赋形剂对稳定性的影响的析因测试

将ChAd155-RSV (WO 2016/198599)以1 x 10

PICOGREEN分析显示，VES贡献约30%的影响，并且对病毒的稳定性具有积极影响。Travasol贡献约18%，并且具有负面影响。单独或与其他因素组合，测试的其他因素在本分析中的影响可忽略不计。

考虑到如通过PICOGREEN和分析型HPLC所测量的稳定性；和如通过六邻体蛋白所测量的感染性，所述五种赋形剂的总体排序为VES> rHSA>乙醇> MgSO4> TRAVASOL。VES对腺病毒承受热处理的能力具有积极影响。VES占对热稳定性的变异性贡献的50%和对感染性的变异性贡献的20%。重组HSA增加病毒的热稳定性，而VES既增加热稳定性，又防止光暴露后金属催化的氧化。TRAVASOL和MgSO

发明人发现rHSA防止腺病毒在溶液中聚集。在rHSA存在和不存在的情况下，比较具有呼吸道合胞病毒(RSV)转基因的猿猴腺病毒。凝胶电泳实验的结果表明，rHSA显著减少高分子量腺病毒多聚体的形成。重组HSA也具有抗氧化作用。

实施例2：糖组成、重量摩尔渗透压浓度、VES和rHSA对稳定性和感染性的影响

对于前十二种组合物，将ChAd155-RSV以1 x 10

在暴露于4℃的温度三个月或暴露于30℃的温度一个月后，针对稳定性测试每种上述组合物，以检查高重量摩尔渗透压浓度和糖组成对稳定性和感染性的影响。重量摩尔渗透压浓度对稳定性或感染性几乎没有影响或没有影响。

如图1中所示，大多数病毒组合物在4℃下稳定至少两个半月(左小图)，且在30℃下稳定一周(右小图)。在4℃下三个月后，组合物1-12保持稳定。在30℃下两周或一个月(分别为右小图虚线空心点和虚线实心点)后，向含有低、中或高浓度海藻糖的组合物中添加VES表明，与在不存在VES的组合物相比病毒稳定性增加，如通过游离DNA的量的减少所测量。在向含有低、中或高浓度海藻糖的组合物中添加VES和rHSA两者的情况下均观察到相同的对稳定性的积极影响。用蔗糖替代海藻糖降低VES和VES + rHSA的有益影响，使糖浓度加倍以产生糖浆也是如此。

实施例3：海藻糖、蔗糖、VES和rHSA对4℃或25℃下的稳定性的影响

如下表中所示配制ChAd155-RSV。在暴露于4℃或25℃的温度三周后，通过分析型HPLC针对稳定性测试每种制剂，以检查海藻糖、蔗糖、VES和rHSA对稳定性的影响。

在每种测试制剂中，将病毒在4℃下维持三周(左小图)，并将病毒在25℃下维持至少一周(右小图)(图2)。在25℃下一周后，未观察到降解。在25℃下三周后，开始发生一些降解，并且能够观察到制剂组分的不同作用。当包含在基于蔗糖或基于海藻糖的制剂中时，VES增加病毒稳定性。在存在和不存在添加的糖的情况下，rHSA的添加进一步增加稳定性。

实施例4：海藻糖、蔗糖、VES和rHSA对4℃下的稳定性和感染性的影响

将ChAd155-RSV以1.1 x 10

如图3A中所示，在4℃下经186天的时段观察的以1.1 x 10

在4℃下经186天的时段观察的以1.1 x 10

在4℃下经186天的时段观察的以1.1 x 10

实施例5：加速稳定性评估

下面显示的两次实验进一步表明，包含VES和rHSA的猿猴腺病毒的制剂是热稳定的，并保留其感染特性。

将腺病毒以7.5 x 10

这些结果表明，所有三种组合物都提供了热稳定的猿猴腺病毒制剂。如上表中所示，如通过分析型HPLC所测量，在25℃下30天后，在7.5 x 10

在7.5 x 10

如通过PICOGREEN所测量，在7.5 x 10

将腺病毒以7.5 x 10

通过经由FACS分析测量感染单位来确定感染性。在7.5 x 10

将腺病毒以7.5 x 10

猿猴腺病毒载体在所有三种制剂中在30℃下保持稳定7天，尽管病毒颗粒损失4-10%，如通过分析型HPLC所测量。如所预期，在25℃下30天后，病毒颗粒损失更明显。蔗糖 +VES + rHSA中的病毒颗粒损失少于其他两种制剂。

如通过PICOGREEN所测量，在所有三种制剂中，与在4℃下相比，从病毒衣壳释放的DNA的归一化平均值在30℃下7天后有点更高，且在25℃下30天后显著更高，如所预期。释放的DNA的百分比基于新鲜解冻的对照组和暴露于60℃ 30 min的对照(其完全降解病毒衣壳)之间的回归。

如通过qPCR所测量，所有三种制剂也支持可接受的热稳定性概况。如所预期，在所有三种制剂中，在25℃下30天后(benzo (+))，以及在蔗糖 + VES和海藻糖+ VES + rHSA中在30℃下7天后，每ml的基因组当量数有点降低。再次，用蔗糖 + VES + rHSA获得最佳结果，其中在30℃下7天后仅损失2%，且在25℃下30天后仅损失7%。

将腺病毒以7.5 x 10

如所预期，在30℃下7天后和在25℃下30天后，在所有三种制剂中都观察到病毒感染性的一些损失。该损失是适度的，在30℃下7天后所有三种制剂中的IU损失约3%，且在25℃下30天后损失约7-9%。通过计算分析型HPLC与IU结果的比率确定感染性比率，即感染性病毒颗粒的数目与总病毒颗粒的数目的比率。

实施例6：稳定性数据的外推

用外推病毒颗粒随时间损失的统计模型，分析来自外推稳定性研究的数据，以估算病毒颗粒稳定性随时间的损失。使用线性和一阶衰减模型两者，且结果显示于下表中。

在线性模型(也称为零阶衰减)中，产物特征(即稳定性)随时间线性降低，并计算为Y = α

在37℃下在一定范围的浓度下针对其对感染性的影响筛选以下赋形剂，如下表中所示。

影响感染性的主要变量是VES和MgCl

实施例7：免疫原性

Balb/c小鼠用3 x 10

在免疫后三周，通过使用RSV-M2免疫显性CD8表位的离体IFN-γ酶联免疫斑点(ELISpot)测量T-细胞应答，并且结果显示于图4中。每个点代表单个小鼠中的应答。结果表示为每百万个脾细胞的IFNγ斑点形成细胞数。水平线代表每个剂量组的IFN-γSFC/百万脾细胞的平均数目“几何平均值”。

图4表明在用3 x 10

实施例8：通过暴露于金属和光氧化的强制降解

将ChAd155-RSV以3 x 10