一种鉴定水稻粗杆大穗位点ipa1-2D和ipa1-1D的引物及方法

技术领域

本发明属于水稻品种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定水稻粗杆大穗位点ipa1-2D和ipa1-1D的引物及方法。

背景技术

近些年，我国培育了许多超高产杂交稻品种，包括甬优12、嘉优中科1号等，这些品种亩产都高达1000公斤，是我国粮食生产安全的重要保障，其培育过程采用了理想株型的育种策略，表现为培育出的品种茎秆粗壮、穗一级枝梗数增多，可同时兼顾抗倒及高产两种育种需求。我们前期的研究显示ipa1-2D是决定这些高产品种株型特征的主效位点，能够解释约50％的茎粗和穗枝梗数表型变异，在育种中利用分子标记对ipa1-2D进行高效筛选能够加速类似超高产水稻品种的培育。ipa1-2D的关键序列变异是一段三元序列重复，其上同时包含三个SNP，我们之前针对三元重复序列设计了特异扩增引物，并将三个SNP转化成基于酶切的dCAPS标记。在实际育种筛选及基因分型过程中，我们发现上述标记仍存在缺陷：三元重复特异引物为显性标记，无法区分杂合和ipa1-2D纯合基因型；而酶切标记在鉴定大量分离群体时需消耗大量内切酶，极大地增加了鉴定成本，仅适用于少量品种及群体的鉴定。因此亟需设计一种能够同时区分杂合和纯合基因型且鉴定成本低的新型标记系统，本发明采用竞争性等位基因扩增特异性PCR方法针对其中两个SNP位点进行了优化引物设计，得到了一系列兼容引物，其不同组合能够实现对ipa1-2D位点的高效鉴定。ipa1-1D是李家洋等人发现的另一个影响粗杆大穗性状的优异等位，其在编码区存在一个SNP位点导致其无法被miR156识别，该SNP是ipa1-1D表型产生的核心变异。针对该位点我们也设计了一系列引物，可与ipa1-2D引物系列组成试剂盒，用于不同研究或育种目的的快速分子鉴定。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种鉴定水稻粗杆大穗位点ipa1-2D和ipa1-1D的引物。

本发明还要解决的技术问题是提供鉴定水稻粗杆大穗位点ipa1-2D和ipa1-1D的方法。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的如下技术方案：

一种鉴定水稻粗杆大穗位点ipa1-2D和ipa1-1D的引物，包括鉴定水稻pa1-2D基因型的引物和鉴定水稻pa1-1D基因型的引物；

所述鉴定水稻pa1-2D基因型的引物为如下三种引物组合中的一种：

鉴定ipa1-2D位点的三引物组合1：

2DSNP1-C：GCCTATCCACATACCAGGATTTGTC，

2DSNP2-T：GGGATCAGGGTTACTACACT，

2DCom_R：ATGTGGCAGGGTAGAGTAGTA；

鉴定ipa1-2D位点的三引物组合2：

2DSNP1-T：GCCTATCCACATACCAGGATTTGTT，

2DSNP2-C：GGGATCAGGGTTACTACACC，

2DCom_R：ATGTGGCAGGGTAGAGTAGTA；

鉴定ipa1-2D位点的四引物组合：

2DSNP2-C：GGGATCAGGGTTACTACACC，

2DCom_R：ATGTGGCAGGGTAGAGTAGTA，

2DCom_F：CCTTGCCGCTGCTCCTCCATC，

2DSNP2-A：CGTGGGAACCGTGCTTACCGCCTGA；

最优选：鉴定ipa1-2D位点的三引物组合1；

所述鉴定水稻pa1-1D基因型的引物为如下两种引物组合中的一种；

鉴定ipa1-1D位点的四引物组合1：

1DSNP-G：TGGGTTGACAGAAGAGAAAG；

1DSNP-A：CACCGACTCGAGCTGTGATA；

1DCom-F：AAGTGGGCATGATGGCTAGGA；

1DCom-R：AGGGTTCCAAGCAGCGTAAGG；

鉴定ipa1-1D位点的四引物组合2：

1DSNP-T：TGGGTTGACAGAAGAGAAAT；

1DSNP-C：CACCGACTCGAGCTGTGATC；

1DCom-F：AAGTGGGCATGATGGCTAGGA；

1DCom-R：AGGGTTCCAAGCAGCGTAAGG。

最优选：鉴定ipa1-1D位点的四引物组合2。

一种鉴定水稻粗杆大穗位点ipa1-2D和ipa1-1D的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测水稻的基因组；

(2)以步骤(1)提取的基因组为模板，利用权利要求1中所述的鉴定水稻pa1-2D基因型的引物和鉴定水稻pa1-1D基因型的引物分别进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)PCR得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳条带。

步骤(2)中，PCR扩增体系如下：

DNA模板2μl、PCR缓冲液2μL、各引物0.5μL、Taq聚合酶0.3μL，最终用水补齐至20μL。

步骤(2)中，PCR反应条件为：94℃变性3分钟，随后进行35个循环的“94℃变性20秒-40～55℃退火30秒-72℃延伸20秒”，最后72℃延伸5分钟。

进一步地：以鉴定ipa1-2D位点的三引物组合1进行扩增时，退火温度为52-57℃，优选55℃；

以鉴定ipa1-2D位点的三引物组合2进行扩增时，退火温度为48-57℃，优选55℃；

以鉴定ipa1-2D位点的四引物组合进行扩增时，退火温度为48-56℃，优选50℃；

以鉴定ipa1-1D位点的四引物组合1进行扩增时，退火温度为50.6-51.9℃，优选51℃；

以鉴定ipa1-1D位点的四引物组合2进行扩增时，退火温度为48-50.6℃，优选50℃。

利用上述引物进行鉴定时的判定方法：

当利用鉴定ipa1-2D位点的三引物组合1进行PCR扩增，电泳条带大小为231bp时，该水稻为ipa1-2D基因型；电泳条带大小为265bp时，该水稻为IPA1基因型；231bp和265bp两种条带都有时，该水稻为杂合基因型；

当利用鉴定ipa1-2D位点的三引物组合2进行PCR扩增，电泳条带大小为231bp时，该水稻为IPA1基因型；电泳条带大小为265bp时，该水稻为ipa1-2D基因型；231bp和265bp两种条带都有时，该水稻为杂合基因型；

当利用鉴定ipa1-2D四引物组合进行PCR扩增，电泳条带包括322bp和134bp时，该水稻为ipa1-2D基因型；电泳条带包括322bp和265bp时，该水稻为IPA1基因型；电泳条带包括322bp、265bp、134bp时，该水稻为杂合基因型；

当利用鉴定ipa1-1D四引物组合1进行PCR扩增，电泳条带包括508bp和266bp时，该水稻为IPA1基因型；电泳条带包括508bp和282bp时，该水稻为ipa1-1D基因型；电泳条带包括508bp、282bp、266bp时，该水稻为杂合基因型；

当利用鉴定ipa1-1D四引物组合2进行PCR扩增，电泳条带包括508bp和266bp时，该水稻为ipa1-1D基因型；电泳条带包括508bp和282bp时，该水稻为IPA1基因型；电泳条带包括508bp、282bp、266bp时，该水稻为杂合基因型。

有益效果：

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明采用的三引物基因分型策略可实现在一轮PCR中同时扩增并通过琼脂糖凝胶电泳区分两种等位类型，而已有的KASP技术需要进行两轮PCR扩增并分别进行凝胶电泳才可实现基因型的确定，本方法能够有效节省试剂、劳力及时间成本；

2.本发明针对ipa1-2D和ipa1-1D位点设计了多种引物组合模式，可满足不同育种群体的鉴定需要，相比之前的基于酶切的dCAPS标记，该系列引物组合扩增效率更高，且节省了酶切鉴定成本及时间，可以实现大量育种单株的鉴定和筛选需求。

附图说明

图1.ipa1-2D三引物及四引物设计示意图。

图2.ipa1-1D四引物设计示意图。

图3.ipa1-2D三引物温度梯度扩增YYP1和NIP凝胶电泳图。

图4.ipa1-2D四引物温度梯度扩增YYP1和NIP凝胶电泳图。

图5.ipa1-1D四引物温度梯度扩增SNJ和NIP凝胶电泳图。

图6.ipa1-2D三引物和四引物对12个分离单株鉴定效果及其与dCAPS标记对比。箭头指示杂合单株。

图7.ipa1-1D四引物对12个分离单株鉴定效果。箭头指示杂合单株。

图8.F

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：引物设计

pa1-2D的三元重复序列上有三个SNP，通过对比3000份水稻基因组SNP数据信息，我们发其中两个SNP(SNP1 C/T和SNP2 C/T)的组合能够代表ipa1-2D与野生型IPA1的差异，两个SNP的TT碱基组合为ipa1-2D型，CC碱基组合为大部分粳稻IPA1类型，而TC碱基组合为大部分籼稻IPA1类型，因此对这三种组合类型进行识别能够实现对水稻中大部分品种及育种组合后代的有效区分。基于降低成本的考虑，我们决定设计一种仅需要PCR扩增就可有效鉴定上述SNP的方法。常规的竞争性PCR扩增引物包括三条，其中两条为特异性扩增引物，除了在SNP处存在差异其余序列完全一致，第三条为通用引物。针对特定SNP，通用引物应分别与两条竞争性引物组合进行相同DNA模板的两轮独立PCR扩增，然后分别进行凝胶电泳，通过观察PCR扩增条带的有无来判断对应DNA样品的基因型，增加了时间和劳力成本，且对DNA样品、PCR反应试剂及电泳试剂的消耗量也加倍。

基于ipa1-2D的两个SNP位置特征以及TT和CC组合对比，我们采用了不同的策略进行引物设计，即一条竞争性引物结合SNP1处序列，而另一条竞争性引物结合SNP2处序列，同时我们在两个SNP下游设计了一条通用引物(图1三引物组合示意)。竞争性引物的设计方法为直接选择SNP及其左侧的序列(图1黑框中序列)，而通用引物则是将竞争性引物及其下游300bp序列复制到Primer Premier 5.0软件中，上游引物范围设置为竞争性引物所在位置，根据软件打分结果从下游300bp范围内找到最优的反向通用引物。我们在SNP1和SNP2处都设计了两条竞争性引物，引物末端对应C碱基或T碱基，其中SNP1-C引物和SNP2-T引物与通用引物构成ipa1-2D三引物1组合，SNP1-T引物和SNP2-C引物与通用引物构成ipa1-2D三引物2组合，可分别实现对两个SNP两种基因型的分别扩增。我们还同时替换了引物序列中SNP左侧第三位碱基类型(SNP1 T变为G，SNP2 G变为A)，用于增加引物对特定SNP碱基类型的扩增特异性。由于两条竞争性引物结合的区域不相同，其与通用引物组合扩增后得到的片段大小也不相同，其中SNP1特异性引物扩增大小为265bp，而SNP2特异性引物扩增大小为231bp，可通过凝胶电泳进行区分，实现三条引物在同一轮PCR中扩增即可区分两种SNP类型。此设计可以用于区分ipa1-2D和粳稻类型组配的组合(TT/CC)，但无法区分与籼稻类型组配的组合(TT/TC)。

SNP2在ipa1-2D和籼稻类型之间存在差异，单个SNP无法通过上述三引物方法实现一轮PCR凝胶电泳区分的目的，因此我们采用了四引物的引物设计策略。其原理是在SNP左右两侧各设计一条特异性扩增SNP两种碱基类型的正向和反向引物，然后设计与两种引物配对的通用引物，若两组引物条带扩增大小存在差异，可通过凝胶电泳方法进行区分。由于两个通用引物组合也可扩增出条带，可能会竞争特异性引物的扩增，该方法的有效性取决于引物的序列特征。基于上述引物设计策略，我们保留了三引物2组合中的SNP2-C竞争性扩增引物(共用引物1)和通用引物(共用引物2)，引入了一条反向识别SNP2-A的竞争性引物，并对其第三位碱基进行了G到T的替换，以提高竞争性扩增特异性，随后通过PrimerPremier5.0软件筛选其配对的最优通用引物，其条带扩增大小与公用引物1和2扩增大小不同，SNP2-C引物组合扩增大小为134bp，SNP2-A引物组合扩增大小为231bp，而两个通用引物扩增大小为322bp，都可通过凝胶电泳实现区分。ipa1-1D位点仅包含一个SNP，为G到T的碱基替换，因此我们也采用了四引物的策略进行引物设计。在SNP左右两侧选择一段序列作为特异性扩增引物，分别识别SNP的G和T碱基类型，若正向引物识别G(1DSNP-G)，则反向引物识别T(1DSNP-A)，若正向引物识别T(1DSNP-T)，则反向引物识别G(1DSNP-C)，再分别利用Primer Premier 5.0软件设计上述正向引物和反向引物的通用配对引物，形成四引物1和四引物2两套四引物组合，其特异性引物和通用引物扩增的条带大小分别为266bp、282bp和508bp。至此，我们获得了识别ipa1-2D的7条引物序列，产生三种引物组合，获得识别ipa1-1D的6条引物序列，产生两种引物组合(表1)。

表1.ipa1-2D和ipa1-1D不同组合引物序列

注：带有相同组合名称的引物组成一组PCR扩增引物。

随后，我们对上述五种引物组合进行了PCR扩增验证。YYP1为包含ipa1-2D的粗杆大穗品种，少蘖粳(SNJ)为包含ipa1-1D的粗杆大穗品种，日本晴(NIP)为不包含上述两个位点的粳稻品种，我们将上述品种进行发苗提取DNA。DNA提取方法为TPS小量抽提法，具体步骤为：1、将叶片用球磨仪震荡破碎，加入500ul TPS缓冲液，65℃放置45分钟；2、12000转速离心10分钟，吸300ul上清液到新的离心管中，加入等体积异丙醇，室温放置45分钟；3、12000转速离心10分钟，获得DNA沉淀，倒掉上清液，加入500ul 75％乙醇；4、7500转速离心5分钟，倒掉上清液并吸干残液，室温放置30分钟后加入100ul双蒸水获得DNA溶液。获得的DNA用于不同引物组合的PCR扩增，PCR反应体系为20ul，包含DNA模板2ul、PCR buffer(北京鼎国生物)2ul、每条引物各0.5ul(三引物或四引物)、Taq聚合酶(北京鼎国生物)0.3ul，最终用水补齐至20ul。我们对不同引物组合的最佳退火温度进行了摸索，利用PCR仪设置了48-60度共计12个温度梯度，对应的温度分别为48.0、48.5、49.4、50.6、51.9、53.3、54.7、56.1、57.4、58.5、59.4、59.9，在上述退火温度下分别扩增不同水稻材料DNA，其中ipa1-2D系列的三组引物仅扩增YYP1和日本晴，ipa1-1D系列的两组引物仅扩增少蘖粳和日本晴。PCR反应条件为：94℃变性3分钟，随后进行35个循环的“94℃变性20秒-梯度温度退火30秒-72℃延伸20秒”，最后72℃延伸5分钟完成反应。反应结束后每个样品吸取10ul按温度梯度顺序进行连续点样，随后进行3％浓度的琼脂糖凝胶电泳，电泳20分钟后进行拍照，比较不同品种PCR带型。

结果显示，三引物1和2组合都能扩增出较亮条带，且扩增YYP1(Y)和NIP(N)的条带明显不同，可用于区分两种基因型(图3)。三引物1的最佳退火温度范围为52-57度，三引物2的最佳退火温度范围为48-57，因此我们最终选定55度作为这两组三引物的通用退火温度；四引物组合能扩增出三条带，最上条带为两条通用引物扩增的条带，可以发现随着退火温度的提高，该条带亮度也越亮，而特异性扩增IPA1基因型的条带则逐渐变暗，到58度时几乎消失，说明提高温度不利于IPA1特异性引物的扩增，而ipa1-2D特异性扩增引物几乎不受温度影响(图4)。两对特异性扩增引物条带大小明显不同，可显著区分两种基因型，最终我们选定50度作为该四引物的常用退火温度。ipa1-1D位点的两组四引物也都能扩增出目的条带，通用引物扩增的条带受温度影响较小，且条带很亮，而特异性引物扩增条带在较低温度下才能扩出预期条带差异，其中四引物1组合仅在50.6-51.9温度范围内才能产生明确区分SNJ(S)和NIP(N)的条带，低于该温度范围则在S类型中扩出杂带，高于该温度范围则无法扩增出N类型，四引物2组合在48-50.6范围能够扩增出区分两种基因型的条带，高于该温度范围条带差异变得不明显，整体来看该四引物组合的特异性条带扩增效率要高于四引物1组合，因此我们选定四引物2组合作为鉴定ipa1-1D位点的最优引物组合，其常用退火温度设置为50度。

我们进一步对上述引物组合在分离群体中的鉴定效果进行了分析，嘉优中科4号和嘉优中科6号为分别包含ipa1-2D和ipa1-1D位点的粗杆大穗杂交稻品种，我们前期对两个杂交稻品种进行连续自交，每代都进行ipa1-2D和ipa1-1D杂合位点筛选，得到了F

为了明确上述引物鉴定的基因型是否与粗杆大穗表型相关，我们在成熟期对1系列株系和3系列株系的所有单株进行了基因型鉴定，同时调查了茎粗和穗一级枝梗表型，茎粗测量方法为选取单株主茎，拨开第三节节间，采用游标卡尺分别测量节间中间部位长径和短径，其平均值作为第三节茎粗数据，而穗一级枝梗数则是直接数着生在穗轴上的所有穗枝梗数。利用ipa1-2D三引物1组合鉴定了19个1系列单株(一个单株成熟期已干枯)，其中包含7个IPA1基因型、5个ipa1-2D基因型和7个杂合基因型，可以发现IPA1基因型对应的茎粗和穗一级枝梗数都较小，茎粗范围在4.7-5.9之间，一级枝梗数范围在13-17之间；ipa1-2D对应的数值最大，茎粗范围在8.2-9.6之间，一级枝梗数范围在31-47之间；杂合型性状表现居中，茎粗范围在7-9.5之间，一级枝梗数范围在19-28之间(表2)。利用ipa1-1D四引物2组合鉴定了20个3系列单株，其中包含4个IPA1基因型，8个ipa1-1D基因型和8个杂合基因型，三种基因型间比较发现其茎粗和穗一级枝梗数差异没有ipa1-2D三种基因型间差异明显，IPA1基因型对应茎粗范围在5.7-7.1之间，一级枝梗数范围在14-18之间；ipa1-1D基因型对应茎粗范围在8.5-9.9之间，一级枝梗数范围在18-22之间；杂合基因型对应茎粗范围在6.9-8.3之间，一级枝梗数范围在16-20之间(表3)；整体看来ipa1-1D对茎粗的促进效应大于对穗一级枝梗数的促进效应。至此，我们证明了本发明设计的不同引物组合能够有效区分ipa1-2D和ipa1-1D的杂合和纯合基因型，可有效用于追踪两个位点决定的茎粗和穗一级枝梗数表型。

表2.1系列分离株系ipa1-2D基因型鉴定结果及其与茎粗和穗一级枝梗表型的相关性。

表3.3系列分离株系ipa1-1D基因型鉴定结果及其与茎粗和穗一级枝梗表型的相关性。

水稻育种需要对大量单株进行表型筛选，而分子标记可以在苗期开始对育种分离群体进行鉴定，因此我们进一步开展了对一个F

表4.F

至此，我们证实了几组引物能够高效识别ipa1-2D和ipa1-1D的核心SNP，相比之前设计的dCAPS标记，这些引物标记的区分效果更好，能够将分离群体中的三种基因型进行准确区分，且无需进行酶切鉴定，在进行大群体基因型鉴定时可以极大地降低分析成本。针对ipa1-2D位点的两个SNP，我们巧妙地设计了一种分别识别两个SNP的三引物组合设计，这种引物组合在一轮PCR中即可完成基因型鉴定，降低了时间、劳力及试剂成本，且比四引物节省了引物合成费用，其中七条引物的不同组合可获得三套ipa1-2D鉴定模块，满足不同类型群体的鉴定需求。这些引物在进行大量群体鉴定方面具有巨大优势，在今后水稻超级杂交稻的分子设计育种中具有良好的应用前景。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种鉴定水稻粗杆大穗位点ipa1-2D和ipa1-1D的引物及方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcctatccac ataccaggat ttgtc 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggatcaggg ttactacact 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcctatccac ataccaggat ttgtt 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggatcaggg ttactacacc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtggcagg gtagagtagt a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccttgccgct gctcctccat c 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgtgggaacc gtgcttaccg cctga 25

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgggttgaca gaagagaaag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caccgactcg agctgtgata 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgggttgaca gaagagaaat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caccgactcg agctgtgatc 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aagtgggcat gatggctagg a 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agggttccaa gcagcgtaag g 21