3-羟基丁酸及其衍生物在治疗或预防免疫系统介导疾病中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种3-羟基丁酸及其衍生物在治疗或预防免疫系统介导疾病（例如自身免疫性疾病、过敏性疾病、移植排斥反应，特别是过敏性疾病，例如过敏性哮喘）中的应用。

背景技术

人体免疫系统包括天然免疫和适应性免疫，在防御各种内外源因素导致的机体损伤中起重要作用。但是免疫功能过度激活也会导致严重的组织损伤。与免疫功能过度激活相关的疾病主要有炎症性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病（例如过敏性哮喘）、移植排斥反应（例如移植物抗宿主病）。天然免疫过度激活主要导致炎症性疾病。适应性免疫过度激活导致自身免疫性疾病、过敏性疾病、移植排斥反应（例如移植物抗宿主病）。

伴随工业的发展，近年来因生活环境遭受污染、饮食生活发生变化，多种多样的过敏性疾病正在增加，在这些过敏性疾病当中，尤其是哮喘的发病率大大增加。过敏性哮喘是由多种细胞和细胞成分参与的慢性炎症性疾病。（辅助型T细胞1）Th1/（辅助型T细胞2）Th2细胞免疫功能失衡在过敏性哮喘发病机制中一直占据主导地位，即过敏性哮喘是Th2细胞过度分化所导致的过敏性疾病。Th1和Th2细胞均从原始T细胞分化而来，Th1细胞可以分泌IFN-γ，Th2细胞可以分泌IL-4和IL-13。Th1/Th2比例失衡并不能完全解释过敏性哮喘的发病机制 [王艳妮,常小红.Th1／Th2功能失衡与支气管哮喘.

目前预防或治疗免疫系统疾病的药物主要有糖皮质激素和环氧化酶抑制剂为代表的非甾体抗炎药。虽然糖皮质激素和非甾体抗炎药具有较好的抗炎作用，但是药物不良反应严重限制了它们的应用。糖皮质激素长期应用会导致代谢功能紊乱，非甾体抗炎药长期应用会导致胃溃疡。例如，对于过敏性哮喘，目前临床上多使用激素类的药物（如地塞米松、布地奈德等）来控制和缓解哮喘的症状，但是疗效一般，副作用强，需要长期服药，患者依从性不佳。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供一种如下所示化合物及其药学上可接受的盐、酯、立体异构体在制备治疗和/或预防免疫系统介导疾病的药物中的应用，

（Ⅰ）

其中，R

R

n为1-20的整数（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20）；

R

在本发明的一个实施方式中，R

在本发明的一个实施方式中，R

在本发明另一实施方式中，R

具体地，n为1-10的整数，特别是1-6的整数。

在本发明的一个实施方式中，n=1。

在本发明的另一实施方式中，n=2-6。

具体地，上述化合物可以选自如下结构：

具体地，上述化合物也可以选自如下结构：

具体地，上述化合物可以选自如下结构中的一种或多种的组合：

在本发明的一个实施例中，上述应用为3-羟基丁酸（

具体地，上述化合物可以是D型或L型的，也可以是D型和L型的混合物。

具体地，上述化合物可通过各类聚羟基脂肪酸PHA的水解和醇解等多种方法得到，经过蒸馏纯化，通过GC分析确认纯度极高，没有双键等危害细胞生长的副产物（Chen GQ，WuQ. Microbial Production and Applications of Chiral Hydroxyalkanoates. ApplMicrobiol Biotechno l67(2005)592-599）。

具体地，上述免疫系统介导疾病可以为辅助型T细胞1（Th1）介导的疾病，或，由Th1相关的细胞因子（如γ-IFN）介导的疾病。

具体地，上述免疫系统介导疾病可以为辅助型T细胞17（Th17）介导的疾病，或，由Th17相关的细胞因子（如IL-17）介导的疾病。

具体地，上述免疫系统介导疾病可以为免疫球蛋白E（IgE）介导的过敏性疾病。

具体地，上述免疫系统介导疾病可以为适应性免疫过度激活导致的疾病，例如，但不限于，自身免疫性疾病、过敏性疾病、移植排斥反应。

具体地，上述自身免疫性疾病可以为，例如，但不限于，强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩病、糖尿病（1型）、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎、银屑病、葡萄膜炎、干燥综合征，等。

具体地，上述过敏性疾病可以为，例如，但不限于，过敏性哮喘、过敏性休克、过敏性紫癜、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物过敏。

具体地，上述移植可以为，例如，但不限于，肾移植、肝移植、心脏移植、小肠移植、造血干细胞移植、角膜移植、皮肤移植，等。

具体地，上述移植排斥反应包括宿主抗移植物反应（HVGR）和移植物抗宿主反应（GVHR）。

在本发明的一个实施例中，本发明上述应用中的免疫系统介导疾病为过敏性疾病，特别是过敏性哮喘。

具体地，上述药物中还可以包含用于相同或不同疾病的预防和/或治疗的其他活性成分。

具体地，上述药物中还可以包含一种或多种药学上可接受的辅料。

具体地，上述药物可以采用任意、合适的剂型或给药形式，本领域技术人员可以根据情况选用，包括，但不限于，片剂（例如糖衣片剂、膜包衣片剂、舌下片剂、口腔崩解片、口腔片剂等）、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂（包括软胶囊、微胶囊）、锭剂、糖浆剂、液体剂、乳剂、混悬剂、控制释放制剂（例如，瞬时释放制剂、缓释制剂、缓释微囊）、气雾剂、膜剂（例如，口服崩解膜剂、口腔粘膜-粘附膜剂）、注射剂（例如，皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射）、静脉滴注剂、透皮吸收制剂、软膏剂、洗剂、粘附制剂、栓剂（例如，直肠栓剂、阴道栓剂）、小药丸、鼻制剂、肺制剂（吸入剂）、眼睛滴剂等等，特别是经胃肠道给药的制剂形式。

本发明还提供一种上述化合物及其药学上可接受的盐、酯、立体异构体在制备功能性食品中的应用。

具体地，上述功能性食品为具有特定营养保健功能的食品，其能调节机体功能（例如增强体质、调节身体节律、延缓衰老，等），但不以治疗疾病为目的，有时也称为保健品。在本发明中，功能性食品可以采用任意、合适的形式，如，片剂、丸剂、胶囊剂（如软胶囊、微胶囊）、糖果（如压片糖果、凝胶糖果、胶基糖果等）、固体饮料（如粉剂、颗粒剂等）、液体饮料等。

本发明还提供一种预防和/或治疗疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防有效量或治疗有效量的本发明上述化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、或本发明上述药物的步骤。

具体地，上述方法中的疾病、化合物、产品具有本发明上述相应定义。

具体地，上述受试者为动物，特别是哺乳动物，例如，鼠、兔、猫、犬、猴、牛、马、羊、猪、人类，特别是人类。

具体地，上述方法中的施用方式可以为胃肠道给药或非胃肠道给药，特别是胃肠道给药。

在本发明的一个实施方式中，上述方法为治疗过敏性哮喘的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明上述化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、或本发明上述药物的步骤。

具体地，上述治疗作用包括改善以下病理状况中的一种或多种：疾病引起的IgE水平升高、气道增厚、肺泡结构不规则、气道粘液增加、嗜酸性粒细胞数量增加、炎症因子（如γ-IFN、IL-17）水平升高、促炎作用的免疫细胞（例如Th1、Th17）增加。

具体地，上述治疗作用包括改善以下症状中的一种或多种：打喷嚏、流眼泪、鼻痒、眼痒、咳嗽、胸闷、气流阻塞、反复喘息。

本发明开辟了3-羟基丁酸及其衍生物的新用途，提供了一种更加安全有效的适合长期服用的防治免疫系统介导疾病（例如Th1和/或Th17，或其相关的细胞因子介导的疾病，例如，自身免疫性疾病、过敏性疾病、移植排斥反应，特别是过敏性疾病，例如过敏性哮喘）的药物选择，具有很高的应用价值。

附图说明

图1所示为3-羟基丁酸（3-HB）及其衍生物3-羟基丁酸乙酯（3-HBE）对过敏性哮喘小鼠体重的影响的实验结果。

图2所示为3-羟基丁酸及其衍生物3-羟基丁酸乙酯对过敏性哮喘小鼠血清中免疫球蛋白E（IgE）水平的影响的实验结果。

图3所示为3-羟基丁酸及其衍生物3-羟基丁酸乙对过敏性哮喘小鼠的气管厚度的影响的实验结果：小鼠气道H&E染色代表性结果。

图4所示为3-羟基丁酸及其衍生物3-羟基丁酸乙对过敏性哮喘小鼠的气管厚度的影响的实验结果：小鼠气道H&E染色病理学评分结果。

图5所示为3-羟基丁酸及衍生物3-羟基丁酸乙酯对过敏性哮喘小鼠气管重塑的影响的实验结果：小鼠气道PAS染色代表性结果。

图6所示为3-羟基丁酸及衍生物3-羟基丁酸乙酯对过敏性哮喘小鼠气管重塑的影响的实验结果：小鼠气道PAS染色病理学染色结果。

图7所示为3-羟基丁酸和衍生物3-羟基丁酸乙酯对过敏性小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的比例的影响的实验结果。

图8所示为3-羟基丁酸及其衍生物3-羟基丁酸乙酯对过敏性哮喘小鼠血清中炎症因子的水平的影响的实验结果。

图9所示为3-羟基丁酸及其衍生物3-羟基丁酸乙酯对过敏性哮喘小鼠脾脏细胞中（辅助型T细胞1）Th1细胞、（辅助型T细胞2）Th2细胞比例的影响的实验结果。

图10所示为3-羟基丁酸及其衍生物3-羟基丁酸乙酯对过敏性哮喘小鼠脾脏细胞中（调节型T细胞）Treg细胞、（辅助型T细胞17）Th17比例的影响的实验结果。

图11所示为3-羟基丁酸及其衍生物3-羟基丁酸乙酯对过敏性哮喘小鼠脾脏细胞中Th1细胞、Th2细胞、Treg细胞比例统计分析结果。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

“免疫系统介导疾病”是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。

术语“烷基”指的是直链或支链的且不含不饱和键的烃链自由基，且该烃链自由基以单键与分子其它部分连接。典型的烷基基团含有1至12个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12）碳原子，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基、异己基等。如果烷基被环烷基取代，其相应为“环烷基烷基”自由基，如环丙基甲基、环丙基乙基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。如果烷基被芳基取代，那么其相应为“芳烷基”自由基，如苄基、二苯甲基或苯乙基。

术语“烷氧基”指的是羟基中的氢被烷基取代后形成的取代基，C1-C6的烷氧基指含有1-6个碳原子的烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。

术语“环烷基”指的是脂环烃，如含1至4个单环和/或稠环、含3-18个碳原子，优选3-10（例如3、4、5、6、7、8、9、10）个碳原子，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基或金刚烷基等。

术语“芳基”指的是单环或多环自由基，包括含单芳基基团和/或稠芳基基团的多环自由基，如包含1-3个单环或稠环及6-18（例如6、8、10、12、14、16、18）个碳环原子，如苯基、萘基、联苯基、茚基等。

术语“卤素”是指溴、氯、碘、氟。

术语“盐”应理解为本发明相应化合物的任意形式，其中该化合物为离子形式或者为带电荷的且与带相反电荷的离子（阳离子或阴离子）耦合或在溶液中。该定义特别地包括药学上可接受的盐。盐包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括但不限于来自无机酸诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸和膦酸的盐，以及来自有机酸如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、链烷二酸、芳香酸和脂肪族和芳香族磺酸的盐。因此，这些盐包括但不限于硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、碘酸盐、乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、乙二酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苦杏仁酸盐、苯甲酸盐、氯代苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、酞酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐和甲磺酸盐，还包含氨基酸的盐如精氨酸盐、葡糖酸盐、半乳糖醛酸盐等。酸加成盐可以通过以常规方式使游离碱形式与足够量的所需酸接触形成盐的方式制备。可通过使盐形式与碱接触重新生成游离碱形式，并且以常规方式分离该游离碱。碱加成盐是指与金属或者胺形成的盐，诸如碱金属和碱土金属的氢氧化物，或者与有机胺形成。用作阳离子的金属的例子包括但不限于钠、钾、镁、钙。适当的胺的例子包括但不限于N,N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺（乙烷-1,2-二胺）、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。碱加成盐可通过以常规方式使游离酸形式与足够量的所需碱接触形成盐的方式制备。可通过使盐形式与酸接触重新生成游离酸形式，并且以常规方式分离游离酸。

术语“酯”应理解为酸与本发明相应化合物的羟基（如果存在的话）反应生成的化合物。该定义特别地包括药学上可接受的酯。该定义特别地包括可水解的酯。

此外，本发明中所涉及的任何化合物可以互变异构体形式存在。特别地，术语互变异构体是指化合物的两个或多个结构异构体中的一个，这些异构体间存在平衡，可以相互转换。常见的互变异构体对为烯胺-亚胺、酰胺-亚胺酸、酮-烯醇、内酰胺-内酰亚胺等。

术语“药学上可接受的”，表示考虑到待治疗的疾病或病症以及相应的施用途径，所指出的材料不具有引起合理谨慎的医师避免将该材料施用于患者的性质，理论上无毒、刺激性及过敏反应的，并且能够实现或提供药物分子临床上可接受的药代动力学性质、吸收、分布及代谢性质，可达到预期目的材料。

术语“治疗”包括在疾病发作之后，根除、移除、逆转、缓解、改变或控制疾病。

术语“预防”指在疾病发作之前，通过治疗以避免、最小化或令疾病或状况难于发作或发展的能力。

因此，“治疗”和/或“预防”作为整体是指至少达到与受试者痛苦状况相关的症状的抑制或改善，其中抑制或改善为广义，指至少包括参数大小的下降，如与接受治疗的病况相关的症状，如此，本发明的方法还包括病况被完全抑制的情况，如发生的预防或停止，从而使受试者不再体验病况。

本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料

小鼠：C57BL/6J小鼠购买于清华大学实验动物中心，为正常饲养小鼠，8周龄，一共30只，小鼠生长过程处于同一环境，且喂养同样的食物。

模型建立：哮喘模型分为两个阶段，第一阶段为致敏阶段：模型组和给药组（2% 3-HB或2% 3-HBE 溶解在小鼠日常饮水中），在第0、14天皮下注射致敏，用10μg OVA及10mg 氢氧化铝佐剂制成混合乳剂（0.2ml/只）进行致敏，而正常对照组注射相同剂量的生理盐水作为对照。第二阶段为激发阶段：在21天到28天将模型组及给药组两组小鼠放置于雾化箱中，在雾化器的帮助下，将2% OVA溶液连续雾化7天，而正常组用生理盐水作为空白对照，每天雾化30min。

样本采集：

血液收集：最后一次激发后，小鼠禁食12-16h后，摘眼球取血放入采血管中，3000rpm 离心30min，取上清血液，放入-80℃冰箱中保存。

肺泡灌洗液（BALF）：小鼠取血后，小鼠安乐死后，将小鼠固定在泡沫板上，手术剪 剪开小鼠皮毛，分理出组织暴露出气管，气管插入气管插管连接的注射器，并将气管插管用 手术线固定，注射器吸入1ml预冷的PBS，将注射器中的PBS推入肺中，反复进行灌洗，将灌洗 液吸出得到肺泡灌洗液。取肺泡灌洗液，进行吉姆萨染色，对细胞进行分类计数。将肺部组 织取下，放入4%多聚甲醛中固定保存。进行H

实施例1：3-羟基丁酸及其衍生物3-羟基丁酸乙酯可以抑制OVA所引起的小鼠的体重降低

实验方法

小鼠按照上述方法造模，最后一次用2% OVA溶液进行雾化后第3天称量小鼠体重。

实验结果

哮喘小鼠体重的变化情况结果如图1所示，其中，模型组：OVA组，给药组OVA+3-HB及OVA+3-HBE，阳性参照组OVA+Dex（地塞米松）。

统计与数据分析：数值采用平均值±SD；统计比较采用one way ANOVA， ***，p＜0.001，结果具有明显的统计学差异。

图1结果显示：与对照组相比较，给鸡卵清蛋白（ovalbumin, OVA）组小鼠的体重明显降低，3-羟基丁酸（3-HB）及其衍生物3-羟基丁酸乙酯（3-HBE）给药组与OVA处理组小鼠相比较体重明显升高，这说明3-羟基丁酸（3-HB）及其衍生物3-羟基丁酸乙酯（3-HBE）可以抑制OVA所引起的小鼠的体重降低。

实施例2：3-羟基丁酸及其衍生物3-羟基丁酸乙酯可以降低血清中IgE水平

实验方法

按照上述样本采集方法收集血清，采用ELISA试剂盒（BioLegend），按照厂家提供的说明书检测血清中IgE的水平。

实验结果

哮喘小鼠血清中IgE含量结果如图2所示，其中，模型组：OVA组，给药组OVA+3-HB及OVA+3-HBE，阳性参照组OVA+Dex（地塞米松）。

统计与数据分析：数值采用平均值±SD；统计比较采用one way ANOVA；**，p＜0.01 ***，p＜0.001；**** p＜0.0001，表明结果具有明显的统计学差异。

IgE增高是过敏性哮喘主要的免疫学特征。图2结果显示：与空白对照组相比较，OVA组小鼠血清中IgE水平明显升高，3-羟基丁酸（3-HB）及其衍生物3-羟基丁酸乙酯（3-HBE）给药组与OVA处理组小鼠相比较血清中IgE水平明显降低，这说明3-羟基丁酸（3-HB）及其衍生物3-羟基丁酸乙酯（3-HBE）可以降低哮喘小鼠血清中IgE的水平。

实施例3：3-羟基丁酸及其衍生物3-羟基丁酸乙酯可以改善哮喘小鼠的病理特征

实验方法

小鼠造模成功后，取肺部组织，固定在4%多聚甲醛中，制作石蜡切片，采用H&E染色 观察3-HB及3-HBE处理后气道的厚度，从而判断3-HB及3-HBE对小鼠哮喘模型中气道重塑中 气道厚度的影响。H

1）石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 10min-二甲苯Ⅱ 10min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗；

2）苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗；

3）伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min；

4）脱水封片：将切片依次放入95%酒精I 5min -95%酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min -二甲苯Ⅰ 5min -二甲苯Ⅱ 5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；

5）显微镜镜检，图像采集分析。

实验结果

小鼠气道H&E染色代表性结果如图3所示；小鼠气道H

统计与数据分析：数值采用平均值±SD；统计比较采用one way ANOVA；**，p＜0.01，具有统计学意义。

图3结果显示，与对照组相比较，OVA组小鼠气道明显增厚，肺泡结构不规则，3-羟基丁酸（3-HB）及其衍生物3-羟基丁酸乙酯（3-HBE）给药组与OVA处理组小鼠相比较气道厚度降低，肺泡结构较为完整，病理学评分更低。这说明3-羟基丁酸（3-HB）及其衍生物3-羟基丁酸乙酯（3-HBE）可以改善哮喘。

实施例4：3-羟基丁酸及其衍生物3-羟基丁酸乙酯可以改善哮喘小鼠的病理特征

实验方法

小鼠造模成功后，取肺部组织，固定在4%多聚甲醛中，制作石蜡切片，采用PAS染色观察3-HB及3-HBE处理组及其对照组气道附近呈紫红色的糖类物质，进而判断3-HB及3-HBE对于小鼠哮喘模型气道重塑中气道粘液分泌的影响。PAS染色实验步骤如下：

1）石蜡切片脱蜡至水：依次将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ 20min-二甲苯Ⅱ 20min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min-75%酒精5min，自来水漂洗；

2）染色：切片入高碘酸染液中染色15min，自来水洗，然后蒸馏水漂洗两遍；

3）雪弗染色：切片入雪弗染液避光染色30min，流水冲洗五分钟，镜检；

4）苏木素染细胞核：切片入苏木素染色1-3min，自来水漂洗，盐酸水溶液分化数秒，自来水冲洗，氨水水溶液返蓝，流水冲洗；

5）脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min -无水乙醇II 5min-无水乙醇Ⅲ5min -正丁醇5min-二甲苯Ⅰ 5min -二甲苯Ⅱ 5min透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；

6）显微镜镜检，图像采集分析。

实验结果

小鼠气道PAS染色代表性结果如图5所示；小鼠气道PAS染色病理学染色结果如图6所示，其中，模型组：OVA组，给药组OVA+3-HB及OVA+3-HBE，阳性参照组OVA+ Dex（地塞米松）。

统计与数据分析：数值采用平均值±SD；统计比较采用one way ANOVA；**，p＜0.01。

图5-6结果显示，与对照组相比较，OVA组小鼠气道粘液明显增加，3-羟基丁酸（3-HB）及其衍生物3-羟基丁酸乙酯（3-HBE）给药组与OVA处理组小鼠相比较气道粘液明显降低。这说明3-羟基丁酸（3-HB）及其衍生物3-羟基丁酸乙酯（3-HBE）可以改善哮喘。

实施例5：3-羟基丁酸及其衍生物3-羟基丁酸乙酯可以减少肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的比例

实验方法

按照上述样品收集方法收集肺泡灌洗液，将肺泡灌洗液进行离心，收集细胞沉淀，用100μl PBS重悬后将细胞悬液均匀地涂在载玻片上，进行吉姆萨染色，记录玻片上粉红色（嗜酸性粒细胞）、紫蓝色（淋巴细胞）、淡紫色（中性粒细胞）细胞的数量。吉姆萨染色实验步骤如下：

1）涂片并固定：将细胞均匀地涂布在洁净的载玻片上，待其干燥后采用4%多聚甲醛固定10min；

2）染色：固定后再室温下痛风晾干，将吉姆萨染色覆盖在载玻片上，染色3min左右用流水洗去多余的染液，冲片后放在室温晾干；

3）封片：采用中性树脂进行封片，将干燥后的载玻片放在显微镜下观察。

实验结果

小鼠肺泡灌洗液中炎症细胞统计分析结果如图7所示，其中，统计与数据分析：数值采用平均值±SD；统计比较采用one way ANOVA。嗜酸性粒细胞：给药组（OVA+3-HB及3-HBE）vs模型组（OVA），**** p＜0.0001；巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞：给药组（OVA+3-HB及3-HBE）vs模型组（OVA）没有统计学意义。

图7结果显示，与对照组相比较，OVA组小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量明显增加，3-羟基丁酸（3-HB）及其衍生物3-羟基丁酸乙酯（3-HBE）给药组与OVA处理组小鼠相比较肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量明显减少，嗜酸性粒细胞是过敏性哮喘中主要的效应细胞，这说明3-羟基丁酸（3-HB）及其衍生物3-羟基丁酸乙酯（3-HBE）可以改善哮喘。

实施例6：3-羟基丁酸及其衍生物3-羟基丁酸乙酯可以减少哮喘小鼠血清中炎症因子的水平

实验方法

小鼠处死前眼眶取血，离心分离出血清，血清用ELISA试剂盒（BioLegend）,按照厂家提供的说明书来检测炎症因子γ-IFN、IL-5、IL-17A。

实验结果

小鼠血清中炎症因子水平结果如图8所示，其中，统计与数据分析：数值采用平均值±SD；统计比较采用one way ANOVA。小鼠血清中炎症因子统计分析：γ-IFN/IL-17A 给药组（OVA+3-HB及3-HBE）vs模型组（OVA），*，p＜0.05，具有统计学意义；IL-5 给药组（OVA +3-HB及3-HBE）vs模型组（OVA）无统计学意义。

图8结果显示，与对照组相比较，OVA组小鼠血清中炎症因子的水平明显升高，3-羟基丁酸（3-HB）及其衍生物3-羟基丁酸乙酯（3-HBE）给药组与OVA处理组小鼠相比较血清中炎症因子水平明显降低，γ-IFN 主要由Th1细胞分泌，IL-17主要由Th17细胞分泌，IL-5主要由肥大细胞分泌，这说明3-羟基丁酸（3-HB）及其衍生物3-羟基丁酸乙酯（3-HBE）可能会影响T细胞来缓解哮喘。

实施例7：3-羟基丁酸及其衍生物3-羟基丁酸乙酯减少（辅助型T细胞1）Th1、提高（辅助型T细胞2）Th2比例，并提高（调节型T细胞）Treg比例

实验方法

按照下面步骤进行操作：

1）将处理后的小鼠进行安乐死，取出小鼠的脾脏组织，将脾脏剪碎并研磨成单细胞悬液，采用100μm细胞筛网过滤去掉多余的组织，将细胞悬液按照500g离心5min后，倒掉细胞上清液，细胞沉淀加入红细胞裂解液，4℃裂解3min后，加入冷PBS终止裂解；

2）离心去掉裂解液，细胞沉淀用200μl的RPMI培养基（含1μl离子霉素），细胞在37℃细胞培养箱中培养3h，每隔一段时间摇晃混匀细胞；

3）加入PBS洗去离子霉素，然后加入200μl抗体封闭液（1:500），室温孵育10min后，样品中分别加入1μl FITC-CD4+（Th1，Th2），APC-CD4+（Th17，Treg）抗体，室温孵育10min，洗去多余的抗体；

4）样品中加入固定破膜剂处理细胞1h后，细胞用PBS清洗2次后，分别加入含1μlPE-IFN-γ+/ APC-IL-4+(Th1，Th2)或PE-IL-17+/FITC-Foxp3+（Th17，Treg）抗体孵育10min，洗去多余抗体后，加入200μl的PBS重悬细胞，流式上机分别检测（Th1，Th2）或者（Th17，Treg）细胞的比例。

实验结果：

小鼠脾脏中Th1及Th2细胞比例的变化结果如图9所示，小鼠脾脏中Th17及Treg细胞比例的变化结果如图10所示，小鼠脾脏中Th1/Th2及Th17/Treg细胞比例统计分析结果如图11所示，其中，统计与数据分析：数值采用平均值±SD；统计比较采用one way ANOVA。*，p＜0.05具有显著差异。

图9-11结果中PE-IFN-γ+/FITC-CD4+代表Th1细胞；APC-IL-4+/FITC-CD4+ 代表Th2细胞；APC-CD4+/FITC-Foxp3+代表Treg细胞；APC-CD4+/PE-IL-17+ 代表Th17细胞。

OVA可以升高小鼠体内具有促炎作用的Th1及Th17细胞，从图9-11结果中可以看出3-HB及3-HBE给药组与模型对照组相比较，3-HB及3-HBE可以明显降低具有促炎作用的Th1及Th17细胞的比例。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。

本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。